Ce protocole nous permet d’augmenter le nombre de neurones dans les cultures de ganglions de la racine dorsale de souris adultes. Cela peut aider à déterminer la contribution des cellules neuronales à une réponse donnée. Nous avons ajouté une étape d’immunopanoramique à un protocole de culture DRG de base.
Le principal avantage est de sélectionner contre les cellules non neuronales. Si vous êtes nouveau dans les cultures DRG primaires, il est préférable de pratiquer les dissections pour obtenir autant de DRG que possible et couper autant de nerfs que possible. Pour commencer, aspirez la poly-D-lysine utilisée pour recouvrir la plaque de culture et lavez la plaque trois fois avec de l’eau de culture tissulaire.
Inclinez le couvercle et laissez la surface sécher complètement. Appliquez suffisamment de laminine sur la plaque pour recouvrir le fond de chaque puits et placez-la dans un incubateur à 37 degrés Celsius. Lavez les plats de panoramique précédemment préparés de CD45, PDGFR-bêta et O4 avec D-PBS.
Pour le plat CD45, ajoutez 5 millilitres d’anticorps primaire à 0,2% BSA et 20 microlitres d’anticorps primaires CD45. Pour la boîte PDGFR-bêta, ajoutez 15,2 microlitres de PDGFR-bêta aux 5 millilitres de plaque contenant 0,2% de BSA. Pour le plat O4, ajoutez 2 millilitres d’hybridome O4 à 3 millilitres de 0,2% BSA, et 100 microlitres supplémentaires de 4% BSA, pour vous assurer que la concentration finale de BSA reste à 0,2%Ensuite, perfuser la souris euthanasie avec 30 millilitres de solution saline glacée à 0,9%.
Observez le changement de couleur du foie pour assurer la perfusion. Épinglez les pattes avant et postérieures à une scène en polystyrène et utilisez une lame de rasoir propre pour exposer la colonne vertébrale à l’arrière. Effectuez une laminectomie en faisant des coupures à peu près à mi-hauteur de chaque côté de la colonne vertébrale dorsale, en enlevant la moitié dorsale de la colonne pour exposer la moelle épinière.
Soit couper doucement les nerfs et retirer la moelle épinière, soit pousser doucement la moelle sur le côté, en maintenant l’intégrité nerveuse. Au microscope à dissection, utilisez les racines nerveuses de la colonne vertébrale pour trouver et enlever tous les ganglions de la racine dorsale, ou DRG, de chaque côté de la colonne vertébrale. Coupez les débris nerveux de chaque DRG au fur et à mesure qu’il est enlevé, car plus de débris nerveux dans la culture peuvent entraîner une mauvaise survie.
Recueillir les DRG dans 15 millilitres de HBSS dans un tube conique sur de la glace et les laisser se déposer au fond. À l’aide d’une pipette, aspirez la majeure partie de l’HBSS des DRG et laissez environ 100 microlitres de liquide dans le tube, pour éviter de perdre le tissu. Lavez trois fois avec 1 millilitre de HBSS et ajoutez 5 millilitres de solution STEMxyme de travail préalablement décongelée au tissu.
Couvrez le couvercle avec un film transparent et faites flotter le tube sur le côté dans un bain-marie de 37 degrés Celsius pendant une heure. Après incubation avec l’enzyme, ajouter 1 millilitre de solution inhibitrice ovomucoïde faible teneur en ovomucoïde dans le tube. Triturez doucement les cellules avec une pipette P1000 10 à 15 fois et laissez les morceaux de tissu se déposer.
Ensuite, transférer les 2 à 3 millilitres supérieurs de la solution contenant les cellules dissociées dans une solution ovomucoïde basse fraîche et répéter jusqu’à ce que le tissu soit complètement dissocié et qu’il ne reste plus de morceaux visibles. Centrifuger le tube pendant 10 minutes à 300 x g à température ambiante. Après avoir retiré le surnageant à l’aide d’une pipette, comme démontré précédemment, remettre en suspension la pastille de cellule dans 1 millilitre de tampon panoramique et pipeter doucement pour mélanger.
Pré-mouiller une crépine cellulaire de 70 micromètres avec 1 millilitre de tampon panoramique sur un tube conique de 50 millilitres, puis filtrer la solution cellulaire à travers la crépine cellulaire. Lavez le tube avec 1 millilitre de tampon panoramique et passez-le à travers la crépine. Pour la stratification des cellules, ajoutez 2 millilitres de 15% de BSA et enduisez doucement les côtés du tube fermé.
Pour enlever les débris de myéline, superposez soigneusement la suspension cellulaire un millilitre à la fois en pipetant contre le côté du tube, sur le coussin BSA. Centrifuger le tube à 300 x g pendant 10 minutes à température ambiante, avec une accélération et une décélération lentes. La couche moyenne de myéline montre des flocons de matière blanche.
À l’aide d’une pipette P1000, retirez le liquide clair sur le dessus, la phase de myéline entre les deux, et le BSA, un millilitre à la fois, en laissant environ 100 microlitres pour ne pas déranger la pastille. Pour la récupération de l’antigène, ajoutez 5 millilitres de tampon panoramique et incuber le tube dans un incubateur à 37 degrés Celsius et 10% de dioxyde de carbone pendant 30 à 45 minutes. Ensuite, lavez le plat CD45 incubé trois fois avec du D-PBS et versez le rinçage final.
Versez ensuite la suspension cellulaire dans le plat CD45. Incuber la capsule pendant 20 minutes à température ambiante, en remuant doucement à intervalles de 10 minutes pour permettre aux cellules d’obtenir un accès égal à l’anticorps. Secouez doucement le plat CD45 et soutenez-le en biais.
Pipeter soigneusement 1 millilitre de la suspension cellulaire sur le plat, pour recueillir les cellules non liées. Ensuite, transférez-le dans le plat PDGFR-bêta, préalablement lavé trois fois avec du D-PBS, et incuber. Transférer les cellules non liées de la boîte PDGFR-bêta à la boîte O4, comme démontré précédemment, et incuber la plaque.
Après l’incubation, transférer la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 millilitres et centrifuger à 300 x g pendant 10 minutes. Remettez les cellules en suspension dans le volume désiré et diluez dans un rapport de 1:1 avec du bleu de trypan pour la viabilité cellulaire. À l’aide d’un hémocytomètre, comptez les cellules moyennes à grandes.
Retirez la laminine et plaquez immédiatement les cellules à la densité désirée, sans les laisser sécher avant d’incuber la plaque. Les cultures DRG fixes, entières et immunopanées ont été colorées avec de la bêta3-tubuline pour les neurones et du DAPI pour tous les noyaux. Il a été déterminé que les cultures DRG entières présentaient une coloration d’environ 42,36 % de bêta3-tubuline, et les cultures de DRG immunopanées présentaient une coloration d’environ 71,44 % de bêta3-tubuline, ce qui révèle une augmentation significative de l’enrichissement neuronal avec l’immunopanning.
Traiter le tissu avec soin est très important. Manipuler les DRG avec douceur, couper l’excès de nerf et prendre soin de ne pas agiter ou perdre de tissu et de culture sont tous des éléments cruciaux à connaître.
