Ce protocole fournit une compréhension multidimensionnelle de l’activation des processus de mort cellulaire, ce qui peut fournir des informations essentielles sur les mécanismes de la maladie et éclairer les stratégies thérapeutiques. Ce protocole repose sur l’utilisation d’une technique plus simple et l’accès à l’activation de multiples caspases impératives à partir d’une seule population de cellules endogènes pour déterminer grandement l’activation. La mort des cellules immunitaires innées a été impliquée dans tout le spectre de la maladie, des infections aux maladies inflammatoires en passant par les cancers.
Comprendre les mécanismes moléculaires de la mort cellulaire par activation des caspases peut fournir des informations essentielles sur les processus pathologiques. La Dre Julieann, associée de recherche postdoctorale d’un laboratoire, fera la démonstration de la procédure. Après avoir isolé la moelle osseuse et différencié les BMDM, infecter les cellules avec le virus de la grippe A.
Calculer le volume de virus nécessaire à une multiplicité d’infection de 20 unités de formation de plaques. Retirez le média des BMDM et lavez les cellules une fois avec 500 microlitres de PBS. Ajouter 450 microlitres de virus de la grippe A dans du DMEM à haute teneur en glucose sans FBS inactivé par la chaleur à chaque puits, et incuber les plaques à 37 degrés Celsius pendant une heure dans un incubateur humidifié pour permettre l’absorption.
À la fin de l’incubation d’une heure, ajoutez 50 microlitres de FBS inactivé par la chaleur et remettez les plaques dans l’incubateur à 37 degrés Celsius pour un total de 12 heures. Après 12 heures d’incubation, retirez la plaque de l’incubateur. Aspirez 150 microlitres du surnageant et jetez-le ou conservez-le pour l’analyse du surnageant.
Ne retirez pas le surnageant restant. Maintenant, créez la solution de collecte de protéines en combinant 50 microlitres de tampon de lyse de caspase et 100 microlitres de quatre tampons XSDS par puits. Ensuite, ajoutez 150 microlitres du mélange à chaque puits.
Pour chaque puits, pipeter le mélange pour recueillir les cellules lysées et le surnageant. Pendant le pipetage, grattez le fond du puits avec l’extrémité de la pipette pour perturber les cellules. Après le grattage et le pipetage, recueillir le lysat de protéines dans des tubes de 1,5 millilitre marqués.
À l’aide d’un bloc chauffant, chauffez tous les tubes à 100 degrés Celsius pendant 12 minutes. Retirer les tubes du bloc thermique et centrifuger à 14 500 g pendant 30 secondes à température ambiante pour enrober les composants insolubles. Préparez l’appareil d’électrophorèse avec un gel de polyacrylamide à 12% avec 10 puits.
Remplissez l’appareil d’électrophorèse avec un tampon courant et retirez le peigne de gel. Ensuite, chauffez les échantillons à 100 degrés Celsius pendant cinq minutes. Centrifuger les échantillons à 14,500 G pendant 30 secondes à température ambiante avant le chargement.
Ensuite, chargez lentement 30 microlitres de l’échantillon dans chaque puits. Utiliser un tampon combiné de surnageant et de lysat protéique et de lyse de caspase ou l’homogénat tissulaire pour les taches de caspases 1, 3, 7 et 8, et utiliser le tampon DN RIPA de lysat de protéines décrit dans le protocole ou l’homogénat tissulaire pour les caspases 11 et 9. Pour évaluer les six caspases à la fois, utilisez la même procédure pour charger les mêmes échantillons dans chacun des six gels.
Connectez l’appareil d’électrophorèse à la source d’alimentation et réglez l’alimentation à 80 volts pendant 20 minutes pour commencer la course de gel. Après les 20 premières minutes, réglez l’alimentation à 100 volts pendant 45 à 60 minutes. Observez le front de teinture.
Une fois que le front de colorant atteint le fond du gel, éteignez l’alimentation. Pendant l’exécution du gel, préparez le tampon de transfert comme décrit dans le manuscrit. Faites la solution fraîche à chaque fois.
Retirez le gel de l’appareil d’électrophorèse à l’aide du libérateur de gel. Pour configurer la pile de transfert du gel, activez une membrane PVDF en la trempant dans du méthanol pendant une minute. Pré-mouiller deux morceaux de papier filtre, le gel et la membrane PVDF et transférer le tampon pendant cinq minutes.
Conservez la membrane et le gel en PVDF dans des récipients séparés pendant cette incubation de cinq minutes. Commencez à assembler la pile de transfert sur le système semi-sec. Sur le côté nano platine inférieur, placez un morceau de papier filtre, la membrane PVDF, le gel, et enfin, un morceau de papier filtre.
Étalez doucement ou pressez les bulles d’air entre les couches et fermez le haut du système. Maintenant, connectez-vous à la source d’alimentation. Réglez l’alimentation à 25 volts pendant 40 minutes.
Après le transfert, démontez la pile de transfert, collectez la membrane et placez-la dans une boîte de Petri carrée. Ensuite, effectuez le blocage de la membrane en ajoutant 15 millilitres d’une solution de lait écrémé à 5% et incuber la membrane sur un agitateur à bascule à 50 à 70 RPM à température ambiante pendant une heure. Après l’incubation, retirer la solution bloquante, ajouter 10 millilitres de la solution d’anticorps diluée et incuber pendant deux heures à température ambiante ou quatre degrés Celsius pendant une nuit sur un agitateur à bascule, comme démontré précédemment.
Ensuite, recueillez la solution d’anticorps et lavez la membrane en ajoutant 15 millilitres de TBST à la membrane sur un agitateur à bascule à température ambiante pendant 10 minutes. Jetez le TBST. Répétez le lavage avec 15 millilitres de TBST trois fois.
Ajouter 10 millilitres de la solution d’anticorps conjugués HRP secondaire diluée. Incuber sur un agitateur à bascule à température ambiante pendant une heure. À la fin de l’incubation, une fois la solution d’anticorps retirée, laver la membrane en ajoutant 15 millilitres de TBST sur un agitateur à bascule à température ambiante pendant 10 minutes.
Après avoir terminé les étapes de lavage et retiré le TBST, ajoutez 10 millilitres du substrat HRP haute sensibilité. Laissez-le reposer à température ambiante pendant une minute. Retirez la membrane du substrat.
Passez directement à l’imagerie à l’aide d’un imageur à chimiluminescence avec le bac trans blanc accessoire inséré en position inférieure. Exposez la membrane à l’aide du mode d’exposition automatique. Les caspases pro et activées 1, 11, 3, 7, 8 et 9 chez les mutants de type sauvage et ZBP1 après une infection par le virus de la grippe A, les mutants de type sauvage et AIM2 après infection à HSV1, et l’infection à Francisella novicida, ou les BDM mutants de type sauvage et NLRP3 après lipopolysaccharide et stimulation ATP sont analysés.
Les cellules dépourvues de capteurs PANoptosis en amont ne subissent pas de mort cellulaire robuste en réponse aux stimuli inducteurs de PANoptosis apparentés. L’infection par le virus de la grippe A induit la formation du ZBP1-PANoptosome et les cellules déficientes en ZBP1 sont significativement protégées contre la mort cellulaire pendant l’infection par le virus de la grippe A. De même, les infections à HSV1 et Francisella novicida induisent la formation du panoptosome AIM2, et les cellules déficientes en AIM2 ne subissent pas de mort cellulaire robuste en réponse à ces infections.
Les cellules dépourvues de capteurs d’inflammasome en amont sont protégées de la mort cellulaire en réponse à leurs stimuli respectifs, et les cellules déficientes en NLRP3 ne subissent pas la mort cellulaire en réponse au lipopolysaccharide et à l’ATP. Il est important de se rappeler de préparer un mélange des deux lysats cellulaires pour déterminer une caspase spécifique. Après le chargement du jet, l’échantillon lumineux doit être stocké à moins 20 degrés pour maintenir l’intégrité des objectifs de la caspase pour le suivi En conjonction avec ce protocole, l’imagerie de mort cellulaire en temps réel ou les tests LDH peuvent être utilisés pour surveiller l’exécution de la mort cellulaire, et ELIZA peut être utilisé pour vérifier la libération de cytokines ou d’AMPIM à partir de cellules subissant différents types de mort cellulaire.
