Ce protocole est important car il montre des boucles chromosomiques à haute résolution et d’autres caractéristiques d’interaction à courte portée. Le principal avantage de cette technique est la cartographie de l’organisation du génome en 3D avec une résolution de nucléosome avec un rapport signal/bruit élevé. Pour effectuer le titrage MNase, décongelez une pastille d’une fois 10 à la sixième cellule sur de la glace pendant 10 minutes, et remettez les cellules en suspension dans 500 microlitres de DPBS, et incubez la suspension cellulaire sur de la glace pendant 20 minutes.
Prélever les cellules par centrifugation à 10 000 G pendant cinq minutes à température ambiante et retirer le surnageant. Remettre les cellules en granulés en suspension dans 500 microlitres de tampon MB Number one. Décongeler un flacon de 20 unités par microlitre de MNase, et le diluer avec 10 millimolaires de Tris pour les conditions de digestion décrites dans le texte.
Avec des intervalles de temps appropriés de 10 à 20 secondes, ajoutez un microlitre de la première solution de digestion MNase dans l’un des quatre tubes d’échantillons, tourbillonnez et incubez dans un ThermoMixer à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes à 800 tr/min. Continuez à ajouter un microlitre des dilutions MNase restantes aux autres aliquotes cellulaires. Arrêtez la digestion de la MNase en ajoutant 200 microlitres de tampon d’arrêt fraîchement préparé dans chaque tube dans le même ordre et le même intervalle de temps que la MNase a été ajoutée.
Incuber à 65 degrés Celsius pendant deux heures. Ajoutez 500 microlitres de PCI à chaque échantillon et mélangez soigneusement par vortex. Centrifuger à 19 800 g pendant cinq minutes à température ambiante pour séparer les phases.
Et transférer la phase aqueuse sur de nouveaux tubes. Purifiez l’ADN à l’aide d’un kit de purification d’ADN commercial selon les instructions du fabricant et éluez les échantillons dans 12 microlitres de tampon d’élution. Ajoutez deux à cinq microlitres de colorant de chargement à l’échantillon d’ADN purifié.
Analysez les échantillons sur un gel d’agarose à 1,5 % et choisissez le meilleur degré de digestion pour l’expérience. Un degré de digestion optimal présente peu ou pas de fragments sous-nucléosomales et un rapport mono/dinucléosome de 70 à 90 %. Dans cet échantillon représentatif, un degré de digestion intermédiaire entre les voies trois et quatre a été sélectionné pour les expériences de suivi.
Sur la base du titrage de la MNase, digérer la chromatine en ajoutant la quantité appropriée de MNase à chaque aliquote de l’échantillon. Bien mélanger et incuber dans le ThermoMixer à 37 degrés Celsius, 800 tr/min pendant 10 minutes. Arrêtez la digestion de la MNase en ajoutant 1,6 microlitre d’EGTA de 0,5 molaire à chaque aliquote et incubez dans un ThermoMixer à 65 degrés Celsius pendant 10 minutes avec une agitation de 800 tr/min.
Prélever l’échantillon par centrifugation à 10 000 G pendant cinq minutes à température ambiante et jeter le surnageant. Remettre en suspension la pastille cellulaire dans 500 microlitres de tampon NEB 1X 2.1. Regrouper des échantillons équivalant à une entrée de cinq fois 10 à la sixième cellule ou moins pour un traitement ultérieur.
Avant de procéder à la ligature de proximité, transférez 10 % de l’échantillon en tant que témoin d’entrée pour surveiller le niveau de digestion de la MNase. Ajoutez 150 microlitres de Tris de 10 millimolaires, 25 microlitres de SDS à 10 % et 25 microlitres de protéinase K de 20 milligrammes par millilitre au contrôle de digestion et incubez toute la nuit à 65 degrés Celsius. Prélever l’échantillon restant par centrifugation à 10 000 G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius et jeter le surnageant.
Remettre le granulé en suspension dans 90 microlitres de mélange maître Micro-C fraîchement préparé et incuber dans un ThermoMixer à 37 degrés Celsius, 800 tr/min pendant 15 minutes. Ajouter 10 microlitres de cinq unités par microlitre de fragment de Klenow et incuber dans un ThermoMixer. Ajoutez ensuite 100 microlitres de mélange maître Micro-C fraîchement préparé.
Incuber pendant 45 minutes à 25 degrés Celsius, 800 tr/min, et éteindre la réaction enzymatique avec de l’EDTA comme décrit dans le texte. Incuber dans un mélangeur thermique pendant 20 minutes à 65 degrés Celsius, 800 tr/min. Prélever l’échantillon par centrifugation à 10 000 g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius et jeter le surnageant.
Remettre l’échantillon en suspension dans 500 microlitres de mélange maître Micro-C fraîchement préparé et incuber pendant 2,5 heures à température ambiante à 15 à 20 tr/min. Répétez la centrifugation et retirez le surnageant. Ensuite, remettre l’échantillon en suspension dans 200 microlitres de mélange maître Micro-C fraîchement préparé et incuber dans un ThermoMixer réglé à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes à 800 tr/min.
Pour la réticulation inverse et la déprotéination, ajoutez 25 microlitres de 20 milligrammes par microlitre de protéinase K et 25 microlitres de 10 % de SDS à l’échantillon et incubez à 65 degrés Celsius pendant la nuit avec un mélange intermittent. Ajoutez 500 microlitres de PCI aux échantillons et au contrôle d’entrée, puis mélangez par vortex. Séparez les phases par centrifugation à 19 800 G pendant cinq minutes et transférez la phase aqueuse supérieure dans un tube frais.
Concentrez l’ADN et éluez les échantillons dans 30 microlitres, et les contrôles d’entrée dans 15 microlitres. Appliquez un gel d’agarose à 1,5 % pour séparer les mononucléosomes et les dinucléosomes. Exciser les fragments d’ADN qui ont une taille dinucléosomale et extraire l’ADN comme décrit dans le texte.
Ajouter 150 microlitres de billes pré-préparées à 150 microlitres de l’échantillon et incuber à température ambiante. Placez les tubes dans un aimant approprié et attendez que la solution se dégage. Retirez le surnageant et remettez les billes en suspension dans 300 microlitres de TBW 1X, et répétez cette étape.
Répétez la séparation magnétique, et une fois la solution claire, retirez le surnageant et remettez les billes en suspension dans 100 microlitres de 0,1X TE. Répéter et remettre en suspension dans 50 microlitres de 0,1X TE. Transférez la solution dans des tubes PCR et effectuez la manipulation de l’ADN comme décrit dans le texte. Une fois la ligature de l’adaptateur terminée, laver l’échantillon dans 1X TBW, jeter le surnageant et remettre les billes en suspension dans 20 microlitres de 0,1X TE. Optimisez le nombre de cycles de PCR et amplifiez les bibliothèques de séquences comme décrit dans le texte. La chromatine de 250 000 cellules par réaction a été digérée avec une dilution quadruple de MNase.
La concentration la plus élevée, 10 unités, a montré une chromatine surdigérée presque exclusivement constituée d’ADN mononucléosomique. La digestion de 250 000 cellules ES de souris avec 0,625 unité de MNase a offert le point de départ le plus prometteur pour les digestions préparatives dans les expériences Micro-C. Cependant, une concentration intermédiaire de MNase entre les conditions indiquées dans les voies trois et quatre, correspondant à cinq unités pour 1 million de cellules, devrait être envisagée.
La bande des mononucléosomes ligaturés par proximité avait une taille approximative de 300 paires de bases, similaire à celle des dinucléosomes. Par conséquent, le rapport du signal de bande mono à dinucléosomique est passé de la prédominance des mononucléosomes aux dinucléosomes. La qualité et la quantité de la bibliothèque de séquençage préparée ont été évaluées à l’aide d’une PCR minimale.
La visualisation a montré une bande distincte à 420 paires de bases, et aucune bande pour les dimères de l’adaptateur. Alors que les deux échantillons de cette étude présentaient des taux de cartographie élevés, le bon échantillon avait une fraction plus élevée de lectures cis. Un taux élevé d’interactions transchromosomiques indique des événements de ligature aléatoires, bien que certaines interactions transchromosomiques puissent être importantes.
De plus, le bon échantillon présentait un taux modéré de paires de lecture de mappage avant-arrière, avec des distances inférieures à 500 paires de bases. Cela indique un faible taux de dinucléosomes non clivés par la MNase ayant une taille similaire à celle de deux nucléosomes ligaturés de proximité. Un bon degré de digestion de la MNase est crucial pour cette expérience.
Les nucléosomes trop digérés sont ligaturés de manière inefficace, et la chromatine sous-digérée contient une grande fraction de dinucléosomes non digérés qui peuvent contaminer la bibliothèque de séquençage. Micro-C peut être combiné avec une approche de capture pour cartographier l’organisation du génome spécifique au locus avec une résolution extrêmement élevée.
