Ce travail a été financé par le projet d’ouverture des laboratoires clés du Hubei (subvention n ° 2021KFY055), la Fondation des sciences naturelles de la province du Hubei (subvention n ° 2020CFB240) et les fonds de recherche fondamentale pour les universités centrales (subvention n ° 2042020kf0065).

Toutes les étapes sont effectuées à température ambiante, sauf indication contraire. Toutes les souris C57BL / 6J utilisées ont été obtenues auprès du Centre des animaux de laboratoire de l’Université de Wuhan, et toutes les expériences connexes ont été approuvées par le Comité d’éthique de l’expérimentation animale de l’Université de Wuhan. Tous les efforts ont été faits pour minimiser la souffrance des souris.
1. Énucléation et fixation des yeux
<ol><li>Euthanasier les souris avec une asphyxie au dioxyde de carbone et énucléer doucement le globe oculaire à l’aide d’une pince à épiler édentée.</li>
	<li>Rincer le globe oculaire une fois dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS).</li>
	<li>Percer le globe oculaire avec une aiguille de seringue au niveau de la cornée au microscope (oculaire WF: 10x/22; objectif de grossissement continu: 0,67x-4,5x) pour accélérer la fixation dans le globe oculaire et améliorer l’efficacité de fixation.</li>
	<li>Transférer dans une plaque de 24 puits contenant 4 % de paraformaldéhyde (PFA).</li>
	<li>Fixez le globe oculaire dans 4% PFA pendant 45 min, puis transférez-le sur 1x PBS pour éliminer l’excès de PFA (laver trois fois, 5 min / temps) immédiatement.</li>
</ol>2. Isolement et aplatissement de la rétine
<ol><li>Transférez le globe oculaire sur une lame de verre et placez-le sous un microscope à dissection (oculaire WF: 10x/22; objectif de grossissement continu: 0,67x-4,5x).</li>
	<li>Tenez la pince dans une main et utilisez-la pour serrer la marge de la cornée afin d’empêcher le mouvement du globe oculaire. Utilisez l’autre main pour tenir les ciseaux à dissection et couper autour de la cornée à environ 1 mm de profondeur à travers le limbe cornéoscléral. Retirez la lentille et le corps vitreux.</li>
	<li>Tenez le disque optique au centre et, à l’aide de ciseaux disséquants, coupez la rétine radialement le long des quatre quadrants, atteignant environ 2/3 du rayon de la rétine.</li>
	<li>Serrez l’un des bords scléraux à l’aide d’une pince dentée. De l’autre main, tenez le bord de la sclérotique avec une pince non dentée et déplacez-vous de l’endroit où la sclérotique est fixée par la pince dentée vers la base de la sclérotique. Pelez soigneusement la rétine.</li>
	<li>Aspirez le PBS à l’aide d’une pipette (200 μL) pour rincer et mouiller la rétine, puis retirez tout excès de PBS avec un petit morceau de papier absorbant. Si nécessaire, aplatissez doucement la rétine avec une petite brosse à poils.</li>
	<li>Pipeter lentement le méthanol froid (prérefroidi dans un congélateur à −20°C) goutte à goutte sur la surface interne de la rétine (le volume de méthanol n’est pas fixé, tant que la rétine peut être complètement recouverte par le méthanol). La rétine devient blanche et développe une ténacité accrue.</li>
	<li>Aplatir doucement la rétine et éliminer les impuretés telles que les membranes pigmentaires résiduelles et le corps vitré avec de petites brosses à poils. Inverser la rétine à l’aide de petites brosses à poils et répéter le processus mentionné ci-dessus.</li>
	<li>Transférez la rétine traitée au méthanol dans un puits d’une plaque de 24 puits et maintenez-la trempée dans du méthanol.</li>
	<li>Conservez-le à -20 °C pendant 1 à 2 h pour une immunocoloration immédiate, ou laissez la rétine dans le méthanol et conservez-le à -20 °C pour un stockage à long terme.</li>
	<li>Retirez le méthanol de la plaque à 24 puits et rincez la rétine avec 1x PBS.</li>
</ol>3. Coloration immunofluorescente des CGR
<ol><li>Transférer délicatement la rétine dans une plaque d’hémagglutination de 24 puits à l’aide d’une pipette Pasteur en plastique et bloquer dans 5 % de PBS-TX-BSA (5 g de poudre d’albumine sérique bovine dissoute dans 100 mL de 1x solution PBST; le PBST est formé en ajoutant 10 mL de Triton X-100 à 2 000 mL de 1 x PBS) à température ambiante pendant 4 h ou pendant une nuit à 4 °C. Gardez le côté ganglion vers le haut.</li>
	<li>Retirer le PBS-TX-BSA et incuber la rétine à 4 °C pendant 48-96 h, en ajoutant 100 μL de l’anticorps primaire sélectionné (anticorps anti-RBPMS du cobaye) en utilisant une dilution de 1:400.</li>
	<li>Retirez l’anticorps primaire et rincez la rétine trois fois (20 min chacune) avec 1x PBS, en agitant à température ambiante.</li>
	<li>Incuber la rétine en agitant doucement pendant une nuit à 4 °C avec 100 μL de l’anticorps secondaire correspondant (voir le tableau des matériaux), cyanine Cy3 affiniPure âne anti-cobaye IgG (H+L), en utilisant une dilution de 1:400.</li>
	<li>Rincer la rétine avec 1x PBS trois fois (20 min chacune).</li>
	<li>Posez la rétine à plat sur la lame avec la couche de cellules ganglionnaires tournée vers le haut, déposez une quantité appropriée d’agent de trempe antifluorescence autour de la rétine avec une pipette et couvrez la lame avec une lamelle de couverture (veillez à ne pas avoir de bulles). REMARQUE: Pour déterminer la quantité appropriée d’anti-fluorescence, assurez-vous qu’il couvre toute la rétine. Après cela, couvrez la lame sans permettre à la rétine de flotter et de bouger facilement.</li>
	<li>Scellez la lame tout autour avec un agent d’étanchéité pour l’empêcher de bouger. Conservez les échantillons à −20°C et à l’abri de la lumière.</li>
	<li>Imagez la rétine à l’aide d’un microscope confocal à fluorescence.</li>
</ol>

Isolement de la rétine de souris et traitement au méthanol pour l’étude des cellules ganglionnaires de la rétine

<ol>
	<li>Sanes, J. R., Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+types+of+retinal+ganglion+cells:+Current+status+and+implications+for+neuronal+classification.">The types of retinal ganglion cells: Current status and implications for neuronal classification.</a> Annual Review of Neuroscience. 38, 221-246 (2015).</li><li>Almasieh, M., Wilson, A. M., Morquette, B., Cueva Vargas, J. L., Di Polo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+basis+of+retinal+ganglion+cell+death+in+glaucoma.">The molecular basis of retinal ganglion cell death in glaucoma.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 31 (2), 152-181 (2012).</li><li>Au, N. P. B., Ma, C. H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroinflammation,+microglia+and+implications+for+retinal+ganglion+cell+survival+and+axon+regeneration+in+traumatic+optic+neuropathy.">Neuroinflammation, microglia and implications for retinal ganglion cell survival and axon regeneration in traumatic optic neuropathy.</a> Frontiers in Immunology. 13, 860070 (2022).</li><li>Pavlidis, M., Stupp, T., Naskar, R., Cengiz, C., Thanos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+ganglion+cells+resistant+to+advanced+glaucoma:+A+postmortem+study+of+human+retinas+with+the+carbocyanine+dye+DiI.">Retinal ganglion cells resistant to advanced glaucoma: A postmortem study of human retinas with the carbocyanine dye DiI.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 44 (12), 5196-5205 (2003).</li><li>Vidal-Sanz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+glaucomatous+damage:+anatomical+and+functional+data+from+ocular+hypertensive+rodent+retinas.">Understanding glaucomatous damage: anatomical and functional data from ocular hypertensive rodent retinas.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 31 (1), 1-27 (2012).</li><li>Kole, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activating+transcription+factor+3+(ATF3)+protects+retinal+ganglion+cells+and+promotes+functional+preservation+after+optic+nerve+crush.">Activating transcription factor 3 (ATF3) protects retinal ganglion cells and promotes functional preservation after optic nerve crush.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 61 (2), 31 (2020).</li><li>Nadal-Nicol&#225;s, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brn3a+as+a+marker+of+retinal+ganglion+cells:+qualitative+and+quantitative+time+course+studies+in+naive+and+optic+nerve-injured+retinas.">Brn3a as a marker of retinal ganglion cells: qualitative and quantitative time course studies in naive and optic nerve-injured retinas.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 50 (8), 3860-3868 (2009).</li><li>Kwong, J. M., Caprioli, J., Piri, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+binding+protein+with+multiple+splicing:+A+new+marker+for+retinal+ganglion+cells.">RNA binding protein with multiple splicing: A new marker for retinal ganglion cells.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 51 (2), 1052-1058 (2010).</li><li>Stradleigh, T. W., Ishida, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation+strategies+for+retinal+immunohistochemistry.">Fixation strategies for retinal immunohistochemistry.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 48, 181-202 (2015).</li><li>Stradleigh, T. W., Greenberg, K. P., Partida, G. J., Pham, A., Ishida, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moniliform+deformation+of+retinal+ganglion+cells+by+formaldehyde-based+fixatives.">Moniliform deformation of retinal ganglion cells by formaldehyde-based fixatives.</a> Journal of Comparative Neurology. 523 (4), 545-564 (2015).</li><li>Bucher, D., Scholz, M., Stetter, M., Obermayer, K., Pfl&#252;ger, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correction+methods+for+three-dimensional+reconstructions+from+confocal+images:+I.+Tissue+shrinking+and+axial+scaling.">Correction methods for three-dimensional reconstructions from confocal images: I. Tissue shrinking and axial scaling.</a> Journal of Neuroscience Methods. 100 (1-2), 135-143 (2000).</li><li>Chidlow, G., Daymon, M., Wood, J. P., Casson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+a+wide-ranging+panel+of+antigens+in+the+rat+retina+by+immunohistochemistry:+Comparison+of+Davidson's+solution+and+formalin+as+fixatives.">Localization of a wide-ranging panel of antigens in the rat retina by immunohistochemistry: Comparison of Davidson's solution and formalin as fixatives.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 59 (10), 884-898 (2011).</li><li>Tokuda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+fixative+solution+for+retinal+morphology:+A+comparison+with+Davidson's+fixative+and+other+fixation+solutions.">Optimization of fixative solution for retinal morphology: A comparison with Davidson's fixative and other fixation solutions.</a> Japanese Journal of Ophthalmology. 62 (4), 481-490 (2018).</li><li>Miki, M., Ohishi, N., Nakamura, E., Furumi, A., Mizuhashi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+fixation+of+the+whole+bodies+of+fish+by+a+double-fixation+method+with+formalin+solution+and+Bouin's+fluid+or+Davidson's+fluid.">Improved fixation of the whole bodies of fish by a double-fixation method with formalin solution and Bouin's fluid or Davidson's fluid.</a> Journal of Toxicologic Pathology. 31 (3), 201-206 (2018).</li><li>Zanini, C., Gerbaudo, E., Ercole, E., Vendramin, A., Forni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+two+commercial+and+three+home-made+fixatives+for+the+substitution+of+formalin:+A+formaldehyde-free+laboratory+is+possible.">Evaluation of two commercial and three home-made fixatives for the substitution of formalin: A formaldehyde-free laboratory is possible.</a> Environmental Health. 11, 59 (2012).</li><li>Tang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+method+to+visualize+the+goblet+cell-associated+antigen+passages+and+identify+goblet+cells+in+the+intestine,+conjunctiva,+and+airway.">An optimized method to visualize the goblet cell-associated antigen passages and identify goblet cells in the intestine, conjunctiva, and airway.</a> Immunobiology. 227 (6), 152260 (2022).</li><li>Brock, R., Hamelers, I. H., Jovin, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+fixation+protocols+for+adherent+cultured+cells+applied+to+a+GFP+fusion+protein+of+the+epidermal+growth+factor+receptor.">Comparison of fixation protocols for adherent cultured cells applied to a GFP fusion protein of the epidermal growth factor receptor.</a> Cytometry. 35 (4), 353-362 (1999).</li><li>Baykal, B., Korkmaz, C., Kocabiyik, N., Ceylan, O. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+post-fixation+on+visualising+vimentin+in+the+retina+using+immunofluorescence+method.">The influence of post-fixation on visualising vimentin in the retina using immunofluorescence method.</a> Folia Morphologica. 77 (2), 246-252 (2018).</li><li>Powner, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+gene+expression+in+whole+mouse+retina+by+in+situ+hybridization.">Visualization of gene expression in whole mouse retina by in situ hybridization.</a> Nature Protocols. 7 (6), 1086-1096 (2012).</li><li>Zhang, N., Cao, W., He, X., Xing, Y., Yang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+methanol+to+preserve+retinas+for+immunostaining.">Using methanol to preserve retinas for immunostaining.</a> Clinical and Experimental Ophthalmology. 50 (3), 325-333 (2022).</li><li>Kalesnykas, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+ganglion+cell+morphology+after+optic+nerve+crush+and+experimental+glaucoma.">Retinal ganglion cell morphology after optic nerve crush and experimental glaucoma.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 53 (7), 3847-3857 (2012).</li><li>Parrilla-Reverter, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-course+of+the+retinal+nerve+fibre+layer+degeneration+after+complete+intra-orbital+optic+nerve+transection+or+crush:+a+comparative+study.">Time-course of the retinal nerve fibre layer degeneration after complete intra-orbital optic nerve transection or crush: a comparative study.</a> Vision Research. 49 (23), 2808-2825 (2009).</li></ol>

Les auteurs n’ont connaissance d’aucune affiliation, adhésion, financement ou participation financière qui pourrait affecter l’objectivité de cette étude.

La fixation est une étape essentielle pour préserver la rétine, ce qui peut avoir un impact sur les investigations ultérieures du RGC basées sur la morphologie. Une fixation réussie capture rapidement la structure et l’état des rétines au moment de les exposer au milieu de fixation, ce qui est essentiel pour une analyse plus approfondie. Bien que le formaldéhyde ait été considéré comme l’un des agents de fixation les plus courants pour la fixation et la conservation des tissus et des cellules, le formald...

Les cellules ganglionnaires de la rétine (CGR) sont les seuls neurones de projection dans la rétine, et elles intègrent et transmettent des informations visuelles extérieures au cerveau1. De nombreuses maladies neurodégénératives telles que le glaucome et la neuropathie optique traumatique sont caractérisées par des dommages irréversibles et la perte deCGR2,3. L’analyse des changements morphologiques et quantitatifs des CGR est une étape cruciale pour déterminer comment les maladies neurodégénératives se développent et progressent 4,5.
Le test d’immunofluorescence indirecte est une méthode largement acceptée pour surveiller la distribution des protéines et le comptage cellulaire. En laboratoire, l’immunomarquage rétinien à montage entier est couramment utilisé dans les études expérimentales sur les CGR pour évaluer les conditions physiologiques et pathologiques de la rétine6. Les marqueurs les plus couramment utilisés pour la quantification du RGC dans l’ensemble de la rétine comprennent Brn3a, protéine de liaison à l’ARN avec épissage multiple (RBPMS), et ainsi de suite 7,8. La caractérisation de la quantité et de la distribution des CGR nécessite une immunocoloration rétinienne de haute qualité à montage entier. Généralement, dans les protocoles d’immunomarquage, la rétine est immergée dans des fixateurs chimiques avant d’être incubée dans des anticorps. Les fixateurs idéaux ne doivent pas modifier la forme des cellules, l’accessibilité ou l’affinité des épitopes pour les anticorps, ni les dimensions linéaires du tissu 9,10.
En raison de la structure complexe de la rétine, des problèmes tels que la fragilité et le repliement de la rétine, ainsi que certaines difficultés courantes, notamment le rétrécissement des cellules et des noyaux peu clairs, sont susceptibles de se produire lors de la fabrication d’un patch rétinien à montage entier, ce qui a un impact négatif sur la recherche expérimentale. En outre, toutes les rétines ne sont pas immunocolorées immédiatement, en particulier lorsqu’il s’agit des rétines de souris transgéniques à des prix élevés et d’origine précieuse, ce qui nécessite la préservation des échantillons rétiniens supplémentaires pour une utilisation ultérieure.
La solution fixatrice appropriée peut fixer rapidement le tissu, éviter l’autolyse tissulaire, préserver la morphologie et la structure normales des cellules tissulaires et conserver l’antigénicité des protéines et autres substances10. À l’heure actuelle, la fixation à base de formaldéhyde a été largement utilisée dans divers tissus, y compris les rétines séparées, les œillets hémisectés et les globes oculaires entiers10. Le rétrécissement tissulaire et l’altération morphologique des cellules sont les deux défis critiques rencontrés après l’immersion dans le formaldéhyde11. De plus, des formulations de fixation modifiées voient de plus en plus le jour pour maximiser la rétention des propriétés originales de la rétine et des cellules cibles 9,10. Différents traitements de fixation rétinienne peuvent affecter différemment la structure rétinienne, l’immunogénicité des protéines, l’excitation par fluorescence et le cycle de tremped’atténuation 12,13. Les rétines fixées avec la solution de Davidson sont plus morphologiquement intactes que celles fixées avec du formol, mais la solution de Davidson est moins compatible avec certains anticorps, tels que la molécule d’adaptateur de liaison au calcium ionisée par marqueur microglial 112. Compte tenu de la nature fragile des rétines, les chercheurs se demanderaient naturellement si l’intégrité rétinienne, ainsi que les propriétés et la morphologie des cellules cibles, changeront après un stockage à long terme. Cependant, les effets possibles de la solution de fixation sur la morphologie des cellules rétiniennes et RGC après stockage pendant plusieurs mois ont rarement été rapportés. L’optimisation de la fixation rétinienne est essentielle pour l’évaluation et la préservation des CGR.
Nous fournissons une description détaillée d’une méthode fiable et techniquement simple que nous utilisons pour la coloration rétinienne murine à montage entier. Notre méthode met l’accent sur la préparation et le stockage appropriés des rétines pour l’investigation du CGR, en tenant compte de la nécessité de stockage à long terme du tissu rétinien ainsi que des aspects spécifiques de la formation ou de la dégradation des fluorophores.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>24-well cell culture cluster</td>
			<td>Costar</td>
			<td></td>
			<td>Eyeball fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well hemagglutination plate</td>
			<td>Labedit Company</td>
			<td></td>
			<td>Incubation antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesion microscope slides</td>
			<td>Citotest</td>
			<td></td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-fluorescent quenching mountant</td>
			<td>Servicebio</td>
			<td>G1401</td>
			<td>Slow down fluorescence quenching</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA (bovine serum albumin)</td>
			<td>Servicebio</td>
			<td>GC305010</td>
			<td>Blocking reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>OLYMPUS</td>
			<td></td>
			<td>Apply 40x objective lens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved scissors</td>
			<td>Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd.</td>
			<td></td>
			<td>Dissecting tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>RWD Life science Co.,LTD&#160;</td>
			<td>77001S</td>
			<td>Dissecting tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd.</td>
			<td></td>
			<td>Dissecting tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.</td>
			<td>20210624</td>
			<td>GC&#8805;99.5%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nail polish</td>
			<td>SecheVite</td>
			<td></td>
			<td>Sealing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles&#160;</td>
			<td>Shanghai Kindly Enterprises Development Group Co., Ltd.</td>
			<td></td>
			<td>Accelerate the fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde solution</td>
			<td>Servicebio</td>
			<td>G1101</td>
			<td>Eyeball fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (phosphate buffered saline pH 7.4)</td>
			<td>Servicebio</td>
			<td>G0002</td>
			<td>Rinse the eyeball&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody: guinea pig anti-RNA-binding protein with multiple splicing (RBPMS)</td>
			<td>PhosphoSolutions</td>
			<td>Cat. #1832-RBPMS</td>
			<td>For immunofluorescence. Used at 1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody: Cy3 affiniPure donkey anti-guinea pig IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>706-165-148</td>
			<td>For immunofluorescence. Used at 1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight scissors</td>
			<td>Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd.</td>
			<td></td>
			<td>Dissecting tools</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methanol-based whole-mount preparation for the investigation of retinal ganglion cells

Les cellules ganglionnaires de la rétine (CGR), qui sont les neurones de projection de la rétine, propagent des informations visuelles externes au cerveau. Les changements pathologiques dans les RGC ont une relation étroite avec de nombreuses maladies dégénératives de la rétine. L’immunomarquage rétinien à montage entier est fréquemment utilisé dans les études expérimentales sur les CGR pour évaluer les conditions développementales et pathologiques de la rétine. Dans certaines circonstances, certains échantillons précieux de rétine, tels que ceux provenant de souris transgéniques, peuvent devoir être conservés pendant une longue période sans affecter la morphologie ou le nombre de CGR. Pour des résultats expérimentaux crédibles et reproductibles, l’utilisation d’un milieu de conservation efficace est essentielle. Ici, nous décrivons l’effet du méthanol en tant que milieu fixe auxiliaire pour les préparations rétiniennes à montage entier et le stockage à long terme. En bref, pendant le processus d’isolement, du méthanol froid (-20 °C) est pipeté à la surface de la rétine pour aider à fixer les tissus et faciliter leur perméabilité, puis les rétines peuvent être stockées dans du méthanol froid (-20 °C) avant d’être immunocolorées. Ce protocole décrit le flux de travail d’isolement de la rétine et le protocole de stockage des échantillons de tissus, ce qui est utile et pratique pour l’étude des CGR.

Après la dissection, la rétine devrait ressembler à un trèfle plat à quatre feuilles. Dans cette étude, en utilisant le protocole décrit ci-dessus, la rétine est devenue blanche après l’ajout de méthanol (Figure 1). Pendant ce temps, la rétine est passée de molle à souple et plate. Ensuite, les RGC ont été étiquetés avec anti-RBPMS8. Quatre champs d’image ont été pris dans la rétine à monture entière (n = 3) à l’aide d’un microscope conf...

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Pleins feux sur l’auteur : Préparation à montage entier à base de méthanol pour l’étude des cellules ganglionnaires rétiniennes  

Le méthanol peut être utilisé comme milieu fixe auxiliaire pour les préparations rétiniennes à montage entier et le stockage à long terme, ce qui est utile pour l’investigation des cellules ganglionnaires de la rétine.

PRÉPARATION À MONTAGE ENTIER À BASE DE MÉTHANOL POUR L’ÉTUDE DES CELLULES GANGLIONNAIRES DE LA RÉTINE

Retinal ganglion cells (RGCs), which are the projection neurons of the retina, propagate external visual information to the brain. Pathological changes in ...

La recherche vise à fournir un flux de travail modifié d’isolation de la rétine et un protocole de stockage d’échantillons de tissus, ce qui est utile et pratique pour étudier les CGR. Les rétines sont fragiles et repliables, ce qui limite la recherche expérimentale lors de la fabrication d’un patch rétinien à montage entier. De plus, toutes les rétines ne nécessitent pas d’immunocoloration immédiate.Parfois, des échantillons de rétine supplémentaires doivent être conservés pour une utilisation ultérieure. Nous fournissons une description détaillée d’une méthode fiable et techniquement simple de coloration de la rétine à montage entier qui met l’accent sur la préparation appropriée et la nécessité du stockage à long terme des rétines pour l’investigation RGC. Nous continuerons à travailler sur la recherche fondamentale sur les neuropathies optiques dégénératives.En outre, le mécanisme moléculaire des lésions du nerf optique et de la régénération accidentelle et les cibles cliniques potentielles pour le diagnostic et le traitement des maladies neurodégénératives seront explorés.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Methanol-Based Whole-Mount Preparation for the Investigation of Retinal Ganglion Cells

2.9K vues.  Renmin Hospital of Wuhan University. La recherche vise à fournir un flux de travail modifié d’isolation de la rétine et un protocole de stockage d’échantillons de tissus, ce qui est utile et pratique pour étudier les CGR. Les rétines sont fragiles et repliables, ce qui limite la recherche expérimentale lors de la fabrication d’un patch rétinien à montage entier. De plus, toutes les rétines ne nécessitent pas d’immunocoloration immédiate.Parfois, des échantillons de rétine supplémentaires doivent êt...

Vidéo: Pleins feux sur l’auteur : Préparation à montage entier à base de méthanol pour l’étude des cellules ganglionnaires rétiniennes  

An Isolated Retinal Preparation to Record Light Response from Genetically Labeled Retinal Ganglion Cells

The first steps in vertebrate vision take place when light stimulates the rod and cone photoreceptors of the retina 1. This information is then segregated into what are known as the ON and OFF pathways. The photoreceptors signal light information to the bipolar cells (BCs), which depolarize in response to increases (On BCs) or decreases (Off BCs) in light intensity. This segregation of light information is maintained at the level of the retinal ganglion cells (RGCs), which have dendrites stratifying in either the Off sublamina of the inner plexiform layer (IPL), where they receive direct excitatory input from Off BCs, or stratifying in the On sublamina of the IPL, where they receive direct excitatory input from On BCs. This segregation of information regarding increases or decreases in illumination (the On and Off pathways) is conserved and signaled to the brain in parallel.
The RGCs are the output cells of the retina, and are thus an important cell to study in order to understand how light information is signaled to visual nuclei in the brain. Advances in mouse genetics over recent decades have resulted in a variety of fluorescent reporter mouse lines where specific RGC populations are labeled with a fluorescent protein to allow for identification of RGC subtypes 2 3 4 and specific targeting for electrophysiological recording. Here, we present a method for recording light responses from fluorescently labeled ganglion cells in an intact, isolated retinal preparation. This isolated retinal preparation allows for recordings from RGCs where the dendritic arbor is intact and the inputs across the entire RGC dendritic arbor are preserved. This method is applicable across a variety of ganglion cell subtypes and is amenable to a wide variety of single-cell physiological techniques.

This article provides a description of how to dissect and record from the isolated retinal preparation in mouse. In particular, we describe how to record light responses from a fluorescently labeled ganglion cell population and subsequently identify and analyze its morphology.

Une préparation isolée rétinienne pour enregistrer la réponse de Lumière génétiquement marqués cellules ganglionnaires rétiniennes

The first steps in vertebrate vision take place when light stimulates the rod and cone photoreceptors of the retina 1.  This information is then ...

Recherche

Neurosciences

Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and cones). The RPE is a monolayer of pigmented cuboidal cells and associates closely with the neural retina just above it. This association makes the RPE of great interest to researchers studying retinal diseases. The RPE is also the site of an in vivo assay of homology-directed DNA repair, the pun assay. The mouse eye is particularly difficult to dissect due to its small size (about 3.5mm in diameter) and its spherical shape. This article demonstrates in detail a procedure for dissection of the eye resulting in a whole mount of the RPE. In this procedure, we show how to work with, rather than against, the spherical structure of the eye. Briefly, the connective tissue, muscle, and optic nerve are removed from the back of the eye. Then, the cornea and lens are removed. Next, strategic cuts are made that result in significant flattening of the remaining tissue. Finally, the neural retina is gently lifted off, revealing an intact RPE, which is still attached to the underlying choroid and sclera. This whole mount can be used to perform the pun assay or for immunohistochemistry or immunofluorescent assessment of the RPE tissue.

A formal demonstration of the dissection of a mouse eye, resulting in a whole mount of the retinal pigment epithelium.

Dissection d&#39;un oeil de la souris pour un mont entiers de l&#39;épithélium pigmentaire rétinien

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and ...

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural connectivity form during development. In mice, retinofugal projections are arranged in a topographic manner and form eye-specific layers in the Lateral Geniculate Nucleus (dLGN) of the thalamus and the Superior Colliculus (SC). The development of these precise patterns of retinofugal projections has typically been studied by labeling populations of RGCs with fluorescent dyes and tracers, such as horseradish peroxidase1-4. However, these methods are too coarse to provide insight into developmental changes in individual RGC axonal arbor morphology that are the basis of retinotopic map formation. They also do not allow for the genetic manipulation of RGCs.
Recently, electroporation has become an effective method for providing precise spatial and temporal control for delivery of charged molecules into the retina5-11. Current retinal electroporation protocols do not allow for genetic manipulation and tracing of retinofugal projections of a single or small cluster of RGCs in postnatal mice. It has been argued that postnatal in vivo electroporation is not a viable method for transfecting RGCs since the labeling efficiency is extremely low and hence requires targeting at embryonic ages when RGC progenitors are undergoing differentiation and proliferation6. 
In this video we describe an in vivo electroporation protocol for targeted delivery of genes, shRNA, and fluorescent dextrans to murine RGCs postnatally. This technique provides a cost effective, fast and relatively easy platform for efficient screening of candidate genes involved in several aspects of neural development including axon retraction, branching, lamination, regeneration and synapse formation at various stages of circuit development. In summary we describe here a valuable tool which will provide further insights into the molecular mechanisms underlying sensory map development.

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

We demonstrate an in vivo electroporation protocol for transfecting single or small clusters of retinal ganglion cells (RGCs) and other retinal cell types in postnatal mice over a wide range of ages. The ability to label and genetically manipulate postnatal RGCs in vivo is a powerful tool for developmental studies.

La transfection des cellules ganglionnaires de la rétine de la souris par In vivo L&#39;électroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection

To analyze the axonal and dendritic morphology of neurons, it is essential to obtain accurate labeling of neuronal structures. Preparing well labeled samples with little to no tissue damage enables us to analyze cell morphology and to compare individual samples to each other, hence allowing the identification of mutant anomalies.
In the demonstrated dissection method the nervous system remains mostly inside the adult fly. Through a dorsal incision, the abdomen and thorax are opened and most of the internal organs are removed. Only the dorsal side of the ventral nerve cord (VNC) and the cervical connective 
(CvC) containing the big axons of the giant fibers (GFs)1 are exposed, while the brain containing the GF cell body and dendrites remains2 in the 
intact head. In this preparation most nerves of the VNC should remain attached to their muscles. 
Following the dissection, the intracellular filling of the giant fiber (GF) with a fluorescent dye is demonstrated. In the CvC the GF axons are located at the dorsal surface and thus can be easily visualized under a microscope with differential interference contrast (DIC) optics. This allows the injection of the GF axons with dye at this site to label the entire GF including the axons and their terminals in the VNC. This method results in reliable and strong staining of the GFs allowing the neurons to be imaged immediately after filling with an epifluorescent microscope. Alternatively, the fluorescent signal can be enhanced using standard immunohistochemistry procedures3 suitable for high resolution confocal microscopy.

Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection

An in vivo dissection of the adult Drosophila ventral nerve cord (VNC) is demonstrated. This particular dissection method causes little damage to the VNC allowing the subsequent labeling of the giant fiber neurons with fluorescent dye for high resolution imaging.

Préparation Mont entiers de l&#39;Adulte Drosophile Chaîne nerveuse ventrale pour injection fibre Dye Géant

To analyze the axonal and dendritic morphology of neurons, it is essential to obtain accurate labeling of neuronal structures. Preparing well labeled ...

Implementing Dynamic Clamp with Synaptic and Artificial Conductances in Mouse Retinal Ganglion Cells

Ganglion cells are the output neurons of the retina and their activity reflects the integration of multiple synaptic inputs arising from specific neural circuits. Patch clamp techniques, in voltage clamp and current clamp configurations, are commonly used to study the physiological properties of neurons and to characterize their synaptic inputs. Although the application of these techniques is highly informative, they pose various limitations. For example, it is difficult to quantify how the precise interactions of excitatory and inhibitory inputs determine response output. To address this issue, we used a modified current clamp technique, dynamic clamp, also called conductance clamp 1, 2, 3 and examined the impact of excitatory and inhibitory synaptic inputs on neuronal excitability. This technique requires the injection of current into the cell and is dependent on the real-time feedback of its membrane potential at that time. The injected current is calculated from predetermined excitatory and inhibitory synaptic conductances, their reversal potentials and the cell's instantaneous membrane potential. Details on the experimental procedures, patch clamping cells to achieve a whole-cell configuration and employment of the dynamic clamp technique are illustrated in this video article. Here, we show the responses of mouse retinal ganglion cells to various conductance waveforms obtained from physiological experiments in control conditions or in the presence of drugs. Furthermore, we show the use of artificial excitatory and inhibitory conductances generated using alpha functions to investigate the responses of the cells.

This video article illustrates the set-up, the procedures to patch cell bodies and how to implement dynamic clamp recordings from ganglion cells in whole-mount mouse retinae. This technique allows the investigation of the precise contribution of excitatory and inhibitory synaptic inputs, and their relative magnitude and timing to neuronal spiking.

La mise en œuvre Clamp dynamique avec conductances synaptiques et artificielle chez la souris cellules ganglionnaires rétiniennes

Ganglion cells are the output neurons of the  retina and their activity reflects the integration of multiple synaptic inputs  arising from specific neural ...

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat muscles can offer significant advantage over traditionally used thicker muscles, such as those from the hind limb (e.g. gastrocnemius). Thin muscles allow for comprehensive overview of the entire innervation pattern for a given muscle, which in turn permits identification of selectively vulnerable pools of motor neurons. These muscles also allow analysis of parameters such as motor unit size, axonal branching, and terminal/nodal sprouting. A common obstacle in using such muscles is gaining the technical expertise to dissect them. In this video, we detail the protocol for dissecting the transversus abdominis (TVA) muscle from young mice and performing immunofluorescence to visualize axons and neuromuscular junctions (NMJs). We demonstrate that this technique gives a complete overview of the innervation pattern of the TVA muscle&#160;and can be used to investigate NMJ pathology in a mouse model of the childhood motor neuron disease, spinal muscular atrophy.

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

In this video we demonstrate a protocol for dissection of the transversus abdominis muscle of the mouse and use immunofluorescence and microscopy to visualize neuromuscular junctions.

Dissection du muscle Transversus Abdominis pour l’analyse de jonction neuromusculaire à montage entier

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

Tout le mont immunomarquage des récepteurs olfactifs neurones dans le<em&gt; Drosophila</em&gt; Antenne

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the molecular and cellular basis of higher brain functions. A whole-mount preparation of adult brains with well-preserved morphology is critical for such whole brain-based studies, but can be technically challenging and time-consuming. This protocol describes an easy-to-learn, one-step dissection approach of an adult fly head in less than 10 s, while keeping the intact brain attached to the rest of the body to facilitate subsequent processing steps. The procedure helps remove most of the eye and tracheal tissues normally associated with the brain that can interfere with the later imaging step, and also places less demand on the quality of the dissecting forceps. Additionally, we describe a simple method that allows convenient flipping of the mounted brain samples on a coverslip, which is important for imaging both sides of the brains with similar signal intensity and quality. As an example of the protocol, we present an analysis of dopaminergic (DA) neurons in adult brains of WT (w1118) flies. The high efficacy of the dissection method makes it particularly useful for large-scale adult brain-based studies in Drosophila.

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

The adult Drosophila brain is a valuable system for studying neuronal circuitry, higher brain functions, and complex disorders. An efficient method to dissect whole brain tissue from the small fly head will facilitate brain-based studies. Here we describe a simple, one-step dissection protocol of adult brains with well-preserved morphology.

Une seule étape simple protocole Dissection pour Whole-mount Préparation des adultes<em&gt; Drosophila</em&gt; Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Single-cell RNA-Seq of Defined Subsets of Retinal Ganglion Cells

The discovery of cell type-specific markers can provide insight into cellular function and the origins of cellular heterogeneity. With a recent push for the improved understanding of neuronal diversity, it is important to identify genes whose expression defines various subpopulations of cells. The retina serves as an excellent model for the study of central nervous system diversity, as it is composed of multiple major cell types. The study of each major class of cells has yielded genetic markers that facilitate the identification of these populations. However, multiple subtypes of cells exist within each of these major retinal cell classes, and few of these subtypes have known genetic markers, although many have been characterized by morphology or function. A knowledge of genetic markers for individual retinal subtypes would allow for the study and mapping of brain targets related to specific visual functions and may also lend insight into the gene networks that maintain cellular diversity. Current avenues used to identify the genetic markers of subtypes possess drawbacks, such as the classification of cell types following sequencing. This presents a challenge for data analysis and requires rigorous validation methods to ensure that clusters contain cells of the same function. We propose a technique for identifying the morphology and functionality of a cell prior to isolation and sequencing, which will allow for the easier identification of subtype-specific markers. This technique may be extended to non-neuronal cell types, as well as to rare populations of cells with minor variations. This protocol yields excellent-quality data, as many of the libraries have provided read depths greater than 20 million reads for single cells. This methodology overcomes many of the hurdles presented by Single-cell RNA-Seq and may be suitable for researchers aiming to profile cell types in a straightforward and highly efficient manner.

Here, we present a combinatorial approach for classifying neuronal cell types prior to isolation and for the subsequent characterization of single-cell transcriptomes. This protocol optimizes the preparation of samples for successful RNA Sequencing (RNA-Seq) and describes a methodology designed specifically for the enhanced understanding of cellular diversity.

L&#39;ARN monocellulaire-séquentiel des sous-ensembles définis des cellules ganglionnaires rétiniennes

The discovery of cell type-specific markers can provide insight into cellular function and the origins of cellular heterogeneity. With a recent push for ...

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in vivo&#8212;rapidly, repetitively, and at a high resolution. This protocol describes OCT imaging in the mouse retina as a powerful tool to study optic neuropathies (OPN). The OCT system is an interferometry-based, non-invasive alternative to common post mortem histological assays. It provides a fast and accurate assessment of retinal thickness, allowing the possibility to track changes, such as retinal thinning or thickening. We present the imaging process and analysis with the example of the Opa1delTTAG mouse line. Three types of scans are proposed, with two quantification methods: standard and homemade calipers. The latter is best for use on the peripapillary retina during radial scans; being more precise, is preferable for analyzing thinner structures. All approaches described here are designed for retinal ganglion cells (RGC) but are easily adaptable to other cell populations. In conclusion, OCT is efficient in mouse model phenotyping and has the potential to be used for the reliable evaluation of therapeutic interventions.

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

This manuscript describes a protocol for the in vivo imaging of the mouse retina with high-resolution spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT). It focuses on retinal ganglion cells (RGC) in the peripapillary region, with several scanning and quantifying approaches described.

Tomographie par cohérence optique : Imagerie souris ganglionnaires rétiniennes cellules In Vivo

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in ...