Cette recherche a été financée par le Programme principal de recherche (E0210702-03) de l’Institut coréen de recherche sur l’alimentation (KFRI), financé par le ministère des Sciences et des TIC.

1. Préparation de l’inoculum bactérien
<ol><li>Retirez le flacon de glycérol stocké à -80 °C.</li>
	<li>Retirez la souche bactérienne (2-10 μL) du flacon à l’aide d’un embout de pipette stérile. NOTA : Les souches d’Acinetobacter A. bouvetii (13-1-1), A. junii (13-1-2), A. pittii (13-2-5), A. baumannii (13-2-9), A. radioresistens (20-1) et A. ursingii (24-1) sont utilisées dans ce protocole.</li>
	<li>Inoculez la bactérie à une plaque de gélose au sang disponible dans le commerce (gélose tryptique au soja additionnée de 5 % de sang de mouton, voir le tableau des matériaux). REMARQUE : D’autres milieux, tels que la gélose nutritive ou la gélose MacConkey, peuvent également être utilisés.</li>
	<li>Striez la surface de la gélose à l’aide d’une boucle stérile avec un flambage intermittent pour l’amincir.</li>
	<li>Placez la plaque de gélose à l’envers dans un incubateur et incubez à 30 °C pendant une nuit de 20 à 24 h.</li>
	<li>Prélever une seule colonie de la culture bactérienne à l’aide d’une aiguille stérile et inoculer 5 ml de bouillon stérile pour perfusion de cerveau et de cœur (BHI, voir le tableau des matériaux) avec la culture.</li>
	<li>Incuber le bouillon inoculé dans un incubateur à agitation à 30 °C pendant une nuit de 20 à 24 h à environ 150 tr/min.</li>
	<li>Transférez 1 mL de la culture de nuit dans un tube de microcentrifugation stérile et centrifugez la culture de nuit à 6 000 × g pendant 10 minutes à température ambiante (RT).</li>
	<li>Retirez le surnageant à l’aide d’une pipette.</li>
	<li>À l’aide d’un vortex, remettre le granulé en suspension dans 1 mL de solution saline stérile tamponnée au phosphate (PBS).</li>
	<li>Centrifuger à 6 000 × g pendant 10 min à RT et retirer le surnageant.</li>
	<li>Remettre en suspension la pastille dans un BHI stérile dix fois dilué à l’aide d’un vortex jusqu’à une densité optique d’environ 0,1 à 600 nm. REMARQUE : La densité optique d’environ 0,1 est équivalente à environ 107 UFC/mL.</li>
</ol>2. Quantification du biofilm à l’aide du violet cristallin
<ol><li>Ajouter 200 μL d’inoculum à chaque puits d’une plaque de polystyrène stérile à 96 puits (voir le tableau des matériaux) et ajouter 200 μL d’eau déminéralisée à chacun des puits les plus à l’extérieur pour éviter que les puits intérieurs ne se dessèchent15.</li>
	<li>Ajouter 200 μL de BHI dilué dix fois dans chaque puits de la même plaque comme témoin négatif.</li>
	<li>Incuber la plaque à 25 °C pendant 24 h.</li>
	<li>Retirez le surnageant à l’aide d’une pipette. REMARQUE : La pipette multicanal est souvent plus pratique pour plusieurs échantillons.</li>
	<li>Ajouter délicatement 300 μL de PBS dans chaque puits et retirer le surnageant à l’aide d’une pipette. REMARQUE : La pipette multicanal est souvent plus pratique pour plusieurs échantillons.</li>
	<li>Répétez l’étape 2.5 deux fois de plus.</li>
	<li>Ajouter 200 μL de solution cristalline violette (1 %) (voir le tableau des matériaux) dans chaque puits et incuber à RT pendant 30 minutes.</li>
	<li>Répétez les étapes 2.4 à 2.6.</li>
	<li>Ajouter 200 μL d’éthanol absolu dans chaque puits et incuber pendant 15 min à RT. Bien mélanger en pipetant de haut en bas plusieurs fois.</li>
	<li>Transférez 100 μL d’élution de chaque puits vers une nouvelle plaque de 96 puits.</li>
	<li>Mesurer l’absorbance à 595 nm à l’aide d’un lecteur de microplaques (voir Tableau des matériaux).</li>
	<li>Lorsque l’absorbance est supérieure à 2,0, diluer correctement l’échantillon jusqu’à ce qu’il soit inférieur à 2,0 dans l’éthanol absolu et le mesurer comme à l’étape 2.11. Ensuite, calculez l’absorbance de l’échantillon (valeur finale) en multipliant la valeur observée par le facteur de dilution.</li>
	<li>Calculer l’absorbance réelle des échantillons en soustrayant la valeur moyenne du témoin négatif de la valeur de chaque puits des échantillons d’essai sur la même plaque de puits.</li>
</ol>3. Dénombrement de la viabilité du biofilm
<ol><li>Ajouter 1 mL d’inoculum (étape 1) dans chaque puits d’une plaque de polystyrène stérile à 12 puits15. Incuber la plaque à 25 °C pendant 24 h. Retirez le surnageant à l’aide d’une pipette.</li>
	<li>Ajouter délicatement 1,5 mL de PBS stérile dans chaque puits et retirer le surnageant à l’aide d’une pipette. Ajouter 1 mL de PBS stérile dans chaque puits.</li>
	<li>Grattez le fond et les parois du puits à l’aide de grattoirs à cellules ajustés.</li>
	<li>Transférez la suspension cellulaire récoltée dans un tube en plastique stérile (10-1) contenant 9 mL de solution saline (0,85 % de NaCl) et 10 à 20 billes de verre (voir le tableau des matériaux). REMARQUE : Pour recueillir les débris résiduels du biofilm laissés sur la surface inférieure du puits, ils peuvent être remis en suspension et transférés à l’aide d’une pipette à l’aide d’une solution saline du tube 10-1 .</li>
	<li>Vortex le tube 10-1 pendant 60 s à une vitesse maximale.</li>
	<li>Effectuer une dilution en série 10 fois en transférant 1 mL dans le tube stérile suivant (10-2) contenant 9 mL de solution saline (0,85 % de NaCl) jusqu’à 10-7.</li>
	<li>Étaler 100 μL de chaque dilution sur une gélose Acinetobacter (voir tableau des matériaux) et incuber les plaques de gélose à 30 °C pendant 24 à 42 h.</li>
	<li>Comptez manuellement le nombre de colonies rouges typiques sur chaque plaque entre 10 et 250.</li>
	<li>Calculez le nombre de cellules viables dans le biofilm de chaque puits à l’aide de l’équation ci-dessous : Cellules viables = Nombre de colonies × Facteurs de dilution × 10</li>
</ol>4. Visualisation du biofilm à l’aide de la microscopie confocale à balayage laser (CLSM)
<ol><li>Ajouter 200 μL d’inoculum dans chaque puits d’une plaque stérile à 96 puits destinée à l’analyse microscopique.</li>
	<li>Incuber la plaque à 25 °C pendant 24 h.</li>
	<li>Retirez le surnageant à l’aide d’une pipette.</li>
	<li>Ajouter délicatement 300 μL d’eau déminéralisée stérilisée par filtre dans chaque puits et retirer le surnageant à l’aide d’une pipette.</li>
	<li>Répétez l’étape 4.4.</li>
	<li>Préparer le mélange de SYTO 9 et d’iodure de propidium (voir le tableau des matériaux) dilué dans de l’eau déminéralisée stérilisée par filtre jusqu’à une concentration finale de 10 μM et 60 μM, respectivement.</li>
	<li>Ajouter le mélange dans chaque puits à 200 μL et incuber la plaque pendant 20-30 min à RT dans l’obscurité.</li>
	<li>Répétez les étapes 4.3 et 4.4</li>
	<li>Visualisez les biofilms attachés à la surface inférieure à l’aide de CLSM avec une longueur d’onde d’excitation de 488 nm et 561 nm et une gamme de longueurs d’onde d’émission de 499 à 535 nm et de 568 à 712 nm, respectivement.</li>
</ol>

Évaluation de la formation et caractérisation des biofilms d’Acinetobacter

<ol>
	<li>Wong, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+and+pathophysiological+overview+of+Acinetobacter+infections:+a+century+of+challenges.">Clinical and pathophysiological overview of Acinetobacter infections: a century of challenges.</a> Clinical Microbiology Reviews. 30 (1), 409-447 (2017).</li><li>Carvalheira, A., Silva, J., Teixeira, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acinetobacter+spp.+in+food+and+drinking+water+-+A+review.">Acinetobacter spp. in food and drinking water - A review.</a> Food Microbiology. 95, 103675 (2021).</li><li>Towner, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acinetobacter:+an+old+friend,+but+a+new+enemy.">Acinetobacter: an old friend, but a new enemy.</a> Journal of Hospital Infection. 73 (4), 355-363 (2009).</li><li>Weber, D. J., Rutala, W. A., Miller, M. B., Huslage, K., Sickbert-Bennett, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+hospital+surfaces+in+the+transmission+of+emerging+health+care-associated+pathogens:+Norovirus,+Clostridium+difficile,+and+Acinetobacter+species.">Role of hospital surfaces in the transmission of emerging health care-associated pathogens: Norovirus, Clostridium difficile, and Acinetobacter species.</a> American Journal of Infection Control. 38 (5), S25-S33 (2010).</li><li>Flemming, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biofilm+matrix:+multitasking+in+a+shared+space.">The biofilm matrix: multitasking in a shared space.</a> Nature Reviews Microbiology. 21 (2), 70-86 (2023).</li><li>Flemming, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilms:+an+emergent+form+of+bacterial+life.">Biofilms: an emergent form of bacterial life.</a> Nature Reviews Microbiology. 14 (9), 563-575 (2016).</li><li>Yin, W., Wang, Y., Liu, L., He, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilms:+the+microbial+&amp;#34;protective+clothing&amp;#34;+in+extreme+environments.">Biofilms: the microbial &amp;#34;protective clothing&amp;#34; in extreme environments.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (14), 3423 (2019).</li><li>Gedefie, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acinetobacter+baumannii+biofilm+formation+and+its+role+in+disease+pathogenesis:+a+review.">Acinetobacter baumannii biofilm formation and its role in disease pathogenesis: a review.</a> Infection and drug resistance. 14, 3711-3719 (2021).</li><li>Whiteway, C., Breine, A., Philippe, C., Van der Henst, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acinetobacter+baumannii.">Acinetobacter baumannii.</a> Trends in Microbiology. 30 (2), 199-200 (2022).</li><li>Longo, F., Vuotto, C., Donelli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm+formation+in+Acinetobacter+baumannii.">Biofilm formation in Acinetobacter baumannii.</a> New Microbiologica. 37 (2), 119-127 (2014).</li><li>Azeredo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+review+on+biofilm+methods.">Critical review on biofilm methods.</a> Critical Reviews in Microbiology. 43 (3), 313-351 (2017).</li><li>Jia, J., Xue, X., Guan, Y., Fan, X., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm+characteristics+and+transcriptomic+profiling+of+Acinetobacter+johnsonii+defines+signatures+for+planktonic+and+biofilm+cells.">Biofilm characteristics and transcriptomic profiling of Acinetobacter johnsonii defines signatures for planktonic and biofilm cells.</a> Environmental Research. 213, 113714 (2022).</li><li>Yang, C., Su, P., Moi, S., Chuang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm+formation+in+Acinetobacter+baumannii:+genotype-phenotype+correlation.">Biofilm formation in Acinetobacter baumannii: genotype-phenotype correlation.</a> Molecules. 24 (10), 1849 (2019).</li><li>Alamri, A. M., Alsultan, A. A., Ansari, M. A., Alnimr, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm-formation+in+clonally+unrelated+multidrug-resistant+Acinetobacter+baumannii+isolates.">Biofilm-formation in clonally unrelated multidrug-resistant Acinetobacter baumannii isolates.</a> Pathogens. 9 (8), 630 (2020).</li><li>Lim, E. S., Nam, S. J., Koo, O. K., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+role+of+Acinetobacter+and+Bacillus+for+Escherichia+coli+O157:H7+in+biofilms+against+sodium+hypochlorite+and+extracellular+matrix-degrading+enzymes.">Protective role of Acinetobacter and Bacillus for Escherichia coli O157:H7 in biofilms against sodium hypochlorite and extracellular matrix-degrading enzymes.</a> Food Microbiology. 109, 104125 (2023).</li><li>Stepanovi&#263;, S., &#262;irkovi&#263;, I., Ranin, L., Svabi&#263;-Vlahovi&#263;, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm+formation+by+Salmonella+spp.+and+Listeria+monocytogenes+on+plastic+surface.">Biofilm formation by Salmonella spp. and Listeria monocytogenes on plastic surface.</a> Letters in Applied Microbiology. 38 (5), 428-432 (2004).</li><li>Boone, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+virulence+phenotypes+and+antibiotic+resistance+in+clinical+strains+of+Acinetobacter+baumannii+isolated+in+Nashville,+Tennessee.">Analysis of virulence phenotypes and antibiotic resistance in clinical strains of Acinetobacter baumannii isolated in Nashville, Tennessee.</a> BMC Microbiology. 21 (1), 21 (2021).</li><li>Otter, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface-attached+cells,+biofilms+and+biocide+susceptibility:+implications+for+hospital+cleaning+and+disinfection.">Surface-attached cells, biofilms and biocide susceptibility: implications for hospital cleaning and disinfection.</a> Journal of Hospital Infection. 89 (1), 16-27 (2015).</li><li>Ravishankar, S., Juneja, V. K., Yousef, A. E., Juneja, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+or+resistance+responses+of+microorganisms+to+stresses+in+the+food+processing+environment.">Adaptation or resistance responses of microorganisms to stresses in the food processing environment.</a> Microbial Stress Adaptation and Food Safety. , (2003).</li><li>Dewanti, R., Wong, A. C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+culture+conditions+on+biofilm+formation+by+Escherichia+coli+O157:H7.">Influence of culture conditions on biofilm formation by Escherichia coli O157:H7.</a> International Journal of Food Microbiology. 26 (2), 147-164 (1995).</li><li>McConnell, M. J., Actis, L., Pach&#243;n, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acinetobacter+baumannii:+human+infections,+factors+contributing+to+pathogenesis+and+animal+models.">Acinetobacter baumannii: human infections, factors contributing to pathogenesis and animal models.</a> FEMS Microbiology Reviews. 37 (2), 130-155 (2013).</li><li>McQueary, C. N., Actis, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acinetobacter+baumannii+biofilms:+variations+among+strains+and+correlations+with+other+cell+properties.">Acinetobacter baumannii biofilms: variations among strains and correlations with other cell properties.</a> The Journal of Microbiology. 49 (2), 243-250 (2011).</li></ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

À l’aide du protocole décrit, la formation de biofilms d’isolats d’Acinetobacter à des degrés divers a été mesurée, visualisée et les cellules viables dans les biofilms ont été estimées (Figure 1, Figure 2 et Figure 3).
Dans ce protocole, deux températures différentes ont été utilisées, 30 °C pour la croissance et 25 °C pour la formation du biofilm d’Acinetobacter</e...

Acinetobacter est connu pour provoquer des infections nosocomiales, et son infection humaine, en particulier dans les établissements de santé, est de plus en plus signalée1. Il est répandu dans les hôpitaux, les établissements de santé et les environnements associés à l’alimentation 2,3,4. Il peut survivre pendant une longue période dans des environnements tels que les surfaces hospitalières telles que les barrières de lit, les tables de chevet, la surface des ventilateurs et les éviers4. Une telle persistance sur les surfaces environnementales peut être l’un des facteurs importants contribuant aux infections nosocomiales d’Acinetobacter4.
Le biofilm est une forme de vie microbienne et est une matrice microbienne composée de cellules microbiennes vivantes et de substances polymères extracellulaires (EPS) provenant des cellules5. Les cellules microbiennes sont intégrées dans la matrice et sont souvent très résistantes aux stress environnementaux tels que la chaleur, les sels, la sécheresse, les antibiotiques, les désinfectants et les forces de cisaillement 6,7.
Acinetobacter peut former des biofilms sur les surfaces, ce qui suggère qu’il peut contribuer à une survie prolongée sur les surfaces environnementales, y compris les surfaces hospitalières, et à une résistance accrue aux traitements antibiotiques 8,9. De plus, la formation d’un biofilm d’Acinetobacter pourrait être fortement associée aux résultats cliniques chez l’homme8. Par conséquent, la formabilité du biofilm des souches d’Acinetobacter pourrait être l’un des indicateurs de prédiction de la survie environnementale et des infections humaines 8,10.
Les biofilms attachés à la surface peuvent être quantifiés et visualisés pour évaluer la formabilité du biofilm. Pour quantifier les biofilms attachés à la surface, les biofilms sont normalement colorés par des colorants de coloration du biofilm tels que le violet cristallin, et les colorants sont élués en solution et mesurés pour la densité optique11. La visualisation des biofilms est une autre bonne approche pour évaluer la formabilité des biofilms11. La méthode de visualisation de la microscopie confocale à balayage laser (CLSM) utilisant la spécificité à l’aide de colorants fluorescents pourrait être plus utile pour caractériser la morphologie du biofilm par rapport à d’autres techniques telles que MEB12,13.
Les cellules viables dans les biofilms peuvent être comptées pour estimer le nombre de cellules viables dans les biofilms11. Les cellules viables intégrées dans les biofilms sont détachées, diluées, étalées sur des plaques de gélose, incubées et dénombrées. Étant donné que le nombre plus élevé de cellules est susceptible de répondre à la dose infectieuse, il peut fournir des informations plus détaillées sur les biofilms, tels que les potentiels d’infection associés au nombre de cellules13,14.
Cet article présente des protocoles étape par étape pour (1) quantifier les biofilms attachés à la surface, (2) compter les cellules viables dans les biofilms et (3) visualiser les biofilms à l’aide du CLSM d’Acinetobacter. Les protocoles présentés décrivent les méthodes permettant d’évaluer la formabilité du biofilm des isolats d’Acinetobacter et de caractériser leurs biofilms.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well cell culture plate</td>
			<td>SPL</td>
			<td>30096</td>
			<td>Polystyrene 96-well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BHI (Brain Heart Infusion) broth</td>
			<td>Merck KGaA</td>
			<td>1.10493.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood Agar Base Plate</td>
			<td>KisanBio</td>
			<td>MB-B1005-P50</td>
			<td>Growth media for Acinetobacter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHROMagar Acinetobacter</td>
			<td>CHROMagar</td>
			<td>AC092</td>
			<td>Selective plate for Acinetobacter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal violet solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V5265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filmtracer LIVE/DEAD biofilm viability kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L10316</td>
			<td>SYTO9 and propidium iodide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>Infinite M200 PRO NanoQuant</td>
			<td>Biofilm measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBC Glass Plating Beads</td>
			<td>RBC</td>
			<td>RG001</td>
			<td>Glass beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#956;-Plate 96 Well Black</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>89621</td>
			<td>Microplate intended for CLSM</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification, viability assessment, and visualization strategies for acinetobacter biofilms

Acinetobacter provoque des infections nosocomiales et la formation de son biofilm peut contribuer à la survie sur des surfaces sèches telles que les environnements hospitaliers. Ainsi, la quantification et la visualisation du biofilm sont des méthodes importantes pour évaluer le potentiel des souches d’Acinetobacter à provoquer des infections nosocomiales. Les biofilms qui se forment à la surface de la microplaque peuvent être quantifiés en termes de volume et de nombre de cellules. Les volumes de biofilm peuvent être quantifiés par coloration à l’aide de violet cristallin, lavage, décoloration à l’éthanol, puis mesure du colorant solubilisé à l’aide d’un lecteur de microplaques. Pour quantifier le nombre de cellules incorporées dans les biofilms, les biofilms sont éliminés à l’aide de racleurs cellulaires, récoltés dans la solution saline, vigoureusement agités en présence de billes de verre et étalés sur gélose Acinetobacter. Ensuite, les plaques sont incubées à 30 °C pendant 24 à 42 h. Après incubation, les colonies rouges sont dénombrées pour estimer le nombre de cellules dans les biofilms. Cette méthode de comptage viable peut également être utile pour compter les cellules Acinetobacter dans les biofilms d’espèces mixtes. Les biofilms d’Acinetobacter peuvent être visualisés à l’aide de colorants fluorescents. Une microplaque disponible dans le commerce et conçue pour l’analyse microscopique est utilisée pour former des biofilms. Ensuite, les biofilms attachés à la surface inférieure sont colorés avec des colorants SYTO9 et à l’iodure de propidium, lavés, puis visualisés par microscopie confocale à balayage laser.

Acinetobacter is known to cause nosocomial infections, and its human infection, especially in healthcare facilities, is increasingly reported1. It is widespread in hospitals, healthcare facilities, and food-associated environments2,3,4. It can survive for a long period in environments including hospital surfaces such as bed rails, bedside tables, the surface of ventilators, and sinks4. Such persistence on environmental surfaces may be one of the significant factors contributing to the nosocomial infections of Acinetobacter4.
Biofilm is a form of microbial life and is a microbial matrix composed of live microbial cells and extracellular polymeric substances (EPS) from the cells5. The microbial cells are embedded in the matrix and are often highly resistant to environmental stresses such as heat, salts, dryness, antibiotics, disinfectants, and shear forces6,7.
Acinetobacter can form biofilms on surfaces, suggesting that it may contribute to extended survival on environmental surfaces, including hospital surfaces, and enhanced resistance to antibiotic treatment8,9. In addition, the biofilm formation of Acinetobacter could be highly associated with human clinical outcomes8. Therefore, the biofilm formability of Acinetobacter strains could be one of the indicators in predicting environmental survival and human infections8,10.
The surface-attached biofilms can be quantified and visualized to assess biofilm formability. To quantify surface-attached biofilms, the biofilms are normally stained by biofilm-staining dyes such as crystal violet, and the dyes are eluted in solution and measured for optical density11. Visualization of biofilms is another good approach to assess biofilm formability11. Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM) visualization method employing specificity using fluorescent dyes could be more useful to characterize biofilm morphology compared to other techniques such as SEM12,13.
The viable cells in biofilms can be counted to estimate the number of viable cells in biofilms11. The viable cells embedded in biofilms are detached, diluted, spread on agar plates, incubated, and enumerated. Because the higher number of cells is likely to meet the infectious dose, it can provide more detailed information on biofilms, such as infection potentials associated with the number of cells13,14.
This article presents step-by-step protocols to (1) quantify surface-attached biofilms, (2) count viable cells in the biofilms, and (3) visualize the biofilms using CLSM of Acinetobacter. The presented protocols describe the methods to assess the biofilm formability of Acinetobacter isolates and characterize their biofilms.

Pleins feux sur l’auteur : Un protocole complet pour la quantification, l’évaluation et la visualisation du biofilm d’Acinetobacter 

Stratégies de quantification, d’évaluation de la viabilité et de visualisation des biofilms d’Acinetobacter

Biofilms are composed of live microbial cells and are difficult to remove from the surfaces. Acinetobacter strains commonly found in our environment, causing nosocomial infections, are also known to form biofilms on surfaces. So, we aim to develop methods to both quantify and visualize Acinetobacter biofilms.Our protocol provides a simple and easy method to quantify and visualize the biofilms of Acinetobacter. The viable number of cells inside the biofilms is quantified by using the viable count method. Our research findings reveal that the naturally-existing Acinetobacter vector strains have quite varying potentials for biofilm formation.Also, there will exist distinct morphological differences within the various biofilms. This paved the way for research focusing on the causes of such a large variation among Acinetobacter strains.

Suivant le protocole, les biofilms d’isolats d’Acinetobacter, isolés à l’origine des surfaces de cuisine, ont été formés sur une plaque de polystyrène à 96 puits, colorée au violet cristallin, et les colorants ont été solubilisés dans de l’éthanol et mesurés pour la masse du biofilm (Figure 1). Le nombre de biofilms variait considérablement en fonction des souches, allant de 0,04 à 1,69 OD (Figure 1). Sur la base des critères ét...

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Ce protocole décrit la préparation de l’inoculum, la quantification du biofilm sur des plaques de microtitration à l’aide d’un colorant violet cristallin, le nombre viable dans les biofilms et la visualisation des biofilms d’Acinetobacter.

Acinetobacter causes nosocomial infections and its biofilm formation can contribute to the survival on dry surfaces such as hospital environments. Thus, ...

Les biofilms sont composés de cellules microbiennes vivantes et sont difficiles à éliminer des surfaces. Les souches d’Acinetobacter que l’on trouve couramment dans notre environnement, causant des infections nosocomiales, sont également connues pour former des biofilms sur les surfaces. Nous visons donc à développer des méthodes permettant à la fois de quantifier et de visualiser les biofilms d’Acinetobacter.Notre protocole fournit une méthode simple et facile pour quantifier et visualiser les biofilms d’Acinetobacter. Le nombre viable de cellules à l’intérieur des biofilms est quantifié à l’aide de la méthode de comptage viable. Les résultats de nos recherches révèlent que les souches de vecteurs Acinetobacter naturellement existantes ont des potentiels très variables pour la formation de biofilms.De plus, il existera des différences morphologiques distinctes au sein des différents biofilms. Cela a ouvert la voie à des recherches axées sur les causes d’une telle variation entre les souches d’Acinetobacter.

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Research

JoVE Journal

Biology

Quantification, Viability Assessment, and Visualization Strategies for Acinetobacter Biofilms

1.4K vues.  Korea Food Research Institute. Les biofilms sont composés de cellules microbiennes vivantes et sont difficiles à éliminer des surfaces. Les souches d’Acinetobacter que l’on trouve couramment dans notre environnement, causant des infections nosocomiales, sont également connues pour former des biofilms sur les surfaces. Nous visons donc à développer des méthodes permettant à la fois de quantifier et de visualiser les biofilms d’Acinetobacter.Notre protocole fournit une méthode simple et facile pour quan...

Vidéo: Pleins feux sur l’auteur : Un protocole complet pour la quantification, l’évaluation et la visualisation du biofilm d’Acinetobacter 

Acinetobacter causes nosocomial infections and its biofilm formation can contribute to the survival on dry surfaces such as hospital environments. Thus, biofilm quantification and visualization are important methods to assess the potential of Acinetobacter strains to cause nosocomial infections. The biofilms forming on the surface of the microplate can be quantified in terms of volume and cell numbers. Biofilm volumes can be quantified by staining using crystal violet, washing, destaining using ethanol, then measuring the solubilized dye using a microplate reader. To quantify the number of cells embedded in the biofilms, the biofilms are scrapped off using cell scrapers, harvested in the saline, vigorously agitated in the presence of glass beads, and spread on Acinetobacter agar. Then, the plates are incubated at 30 &#176;C for 24-42 h. After incubation, the red colonies are enumerated to estimate the number of cells in biofilms. This viable count method can also be useful for counting Acinetobacter cells in mixed-species biofilms. Acinetobacter biofilms can be visualized using fluorescent dyes. A commercially available microplate designed for microscopic analysis is employed to form biofilms. Then, the bottom-surface attached biofilms are stained with SYTO9 and propidium iodide dyes, washed, then visualized with confocal laser scanning microscopy.

This protocol describes the preparation of the inoculum, the biofilm quantification on microtiter plates using crystal violet dye, the viable count in biofilms, and the visualization of biofilms of Acinetobacter.

Recherche

Biologie

Preparation of Bacterial Inoculum for Acinetobacter Biofilm Formation

Preparation of Bacterial Inoculum for Acinetobacter Biofilm Formation  

To begin the process of bacterial inoculum preparation, collect 2 to 10 microliters of the bacterial strain from the vial, using a sterile pipette tip, and inoculate a commercially-available blood agar plate with it. Using a sterile loop, streak the agar surface, thinning it out with intermittent flaming. Incubate the prepared agar plate in an upside-down position at 30 degrees Celsius for about 20 to 24 hours.Next, select a single colony of the bacterial culture with a sterile needle and inoculate five milliliters of sterile BHI broth with this culture. Incubate the inoculated broth in a shaking incubator at 30 degrees Celsius at a speed of 150 rotations per minute for about 20 to 24 hours. Then transfer one milliliter of the culture to a sterile micro-centrifuge tube and centrifuge at 6, 000 g and room temperature for 10 minutes.Following centrifugation, discard the supernatant. Add one milliliter of sterile phosphate-buffered saline, or PBS, to the pellet, and re-suspend it using a vortex. Centrifuge the re-suspended pellet at 6, 000 g for 10 minutes at room temperature and discard the supernatant.This time re-suspend the resulting pellet in sterile, tenfold-diluted BHI broth using vortex. Ensure to achieve an optical density of around 0.1 at 600 nanometers.

Préparation d’un inoculum bactérien pour la formation d’un biofilm d’Acinetobacter

Acinetobacter Biofilm Quantification Using Crystal Violet

Acinetobacter Biofilm Quantification Using Crystal Violet  

To begin, add 200 microliters of the bacterial inoculum to each well of a sterile polystyrene 96-well plate. Then add 200 microliters of deionized water into the outermost wells to keep the inner wells from drying out. Incubate the 96-well plate at 25 degrees Celsius for 24 hours.Following incubation, discard the supernatant in each well using a pipette. Carefully add 300 microliters of PBS to each well and remove the PBS again by using the pipette. Add 200 microliters of 1%crystal violet solution to each well before incubating the plate at room temperature for 30 minutes.Then after dispensing 200 microliters of absolute ethanol in each well, leave the plate for 15 minutes at room temperature. Ensure thorough mixing by pipetting the contents in each well up and down repeatedly. Using a microplate reader, measure the absorbance of the wells at 595 nanometers to determine the biofilm mass.The number of biofilms varied greatly depending on the strains, ranging from an optical density or OD value of 0.04 to 1.69 All of the Acetobacter isolates, except for A.bouvetii, formed biofilms, while A.radioresistens formed a weak biofilm. A.junii and A.baumannii formed moderate biofilms, and A.pittii and A.ursingii formed strong biofilms.

Acinetobacter Quantification du biofilm à l’aide de Crystal Violet

Assessing Acinetobacter Biofilm Viability Count

Assessing Acinetobacter Biofilm Viability Count  

Begin by adding one milliliter of the bacterial inoculum to each well of a sterile polystyrene 12 well plate. Incubate the plate at 25 degrees Celsius for 24 hours. Then, remove the supernatant using a pipette.Carefully add 1.5 milliliters of sterile phosphate buffered saline or PBS to each well, and again, remove the supernatant with the pipette. After adding one milliliter of sterile PBS to each well once more, use fitted cell scrapers to scrape off the bottom and wall surfaces of the wells. Transfer the harvested cell suspension to a sterile plastic tube marked as 10 to the negative one containing nine milliliters of saline and 10 to 20 glass beads.Vortex the tube for 60 seconds at maximum speed. Next, perform a tenfold serial dilution by transferring one milliliter of the cell suspension from the previous tube to another sterile tube marked 10 to the negative two containing nine milliliters of saline solution. Continue this process of serial dilution up to tube 10 to the negative seven.Spread 100 microliters from each dilution onto separate acinetobacter agar plates. Incubate the agar plates at 30 degrees Celsius for 24 to 42 hours. Then count the number of typical red colonies on each plate manually, considering those within the range between 10 and 250.All the acinetobacter isolates except for A.bouvetii had cells equivalent to seven to eight log CFU per well in their biofilms. While A.bouvetii had a much lower cell number at 4.4 Log CFU.

Évaluation de la viabilité du biofilm d’Acinetobacter

Acinetobacter Biofilm Visualization by Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM)

Begin by adding 200 microliters of bacterial inoculum into each well of a sterile 96-well plate prepared for microscopic analysis. Incubate the plate at 25 degrees Celsius for 24 hours before removing the supernatant with the pipette. Next, carefully add 300 microliters of filter-sterilized deionized water into each well.Remove the supernatant using a pipette once again. In another tube, prepare a diluted mixture of SYTO 9 and propidium iodide and filter-sterilized deionized water to the respective desired final concentrations. Then add 200 microliters of the mixture into each well and incubate the plate for 20 to 30 minutes at room temperature in a dark setting.Confocal laser scanning microscopy revealed that biofilm formation significantly varied depending on the strains. A substantial amount of biofilm was found in Acinetobacter junii, Acinetobacter baumannii, and Acinetobacter ursingii with distinct biofilm morphologies.