Nous remercions Valentina Greco pour les souris K14-mCherry-H2B. Nous sommes reconnaissants à l’atelier d’usinage du département de physique de l’Université Emory d’avoir généré les disques de lamelles en verre. Ce travail a été financé par le prix de développement de carrière #IK2 BX005370 du service BLRD du ministère des Anciens Combattants des États-Unis à LS, les prix NIH RF1-AG079269 et R56-AG072473 à MJMR, et le prix I3 Emory SOM/GT pour le calcul et l’analyse de données à MJMR.

Cette recherche a été réalisée conformément aux directives de l’Université Emory et du centre médical des anciens combattants d’Atlanta sur les soins et l’utilisation des animaux et a été approuvée par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC).
1. Installation de l’insert d’imagerie en direct sur la platine du microscope inversé
<ol><li>Construisez l’insert à l’aide de fichiers .stl (Fichier supplémentaire 1, Fichier supplémentaire 2 et Fichier supplémentaire 3) en spécifiant les dimensions et la conception 3D (voir Figure 1 et Figure 2A), une imprimante 3D et de l’acide polylactique (PLA).</li>
	<li>Placez délicatement l’insert (Figure 2B,C) dans la grande rainure de la platine du microscope (Figure 2C et Figure 3A). Utilisez des vis pour fixer l’insert à l’aide de quatre trous de vis situés dans chaque coin de l’insert (Figure 2B-C). REMARQUE : L’insert est bidirectionnel et peut être tourné à 180° en fonction de l’orientation de la platine du microscope et de l’appareil d’anesthésie.</li>
	<li>Faites glisser la plaque chauffante dans le bouchon d’insertion, côté vers le bas (Figure 2D) de manière à ce que l’appareil repose sur les rainures d’insertion inférieures, l’orifice de la fiche passant sous la platine (Figure 3B).</li>
	<li>Alignez l’ouverture circulaire rainurée de l’insert avec un objectif d’immersion d’huile de silicone 40x (Figure 3C) et appliquez de l’huile de silicone au centre de l’objectif.<ol><li>Si l’imagerie s’étend sur des périodes plus longues (>1 h), appliquez une généreuse cuillerée d’huile qui persistera à l’interface lamelle/objectif tout au long de l’imagerie. Ne laissez pas l’huile se répandre sur les bords de l’objectif.</li>
	</ol></li>
	<li>À l’aide d’une seringue, appliquez une petite quantité de graisse sous vide le long de l’ouverture circulaire rainurée et posez le disque de lamelle sur le dessus pour sceller l’insert (Figure 3D). REMARQUE : Le disque de lamelles est créé en enlevant les parois d’une boîte de culture cellulaire à fond en verre de 35 mm x 10 mm (effectuée par un atelier d’usinage).</li>
	<li>Soulevez l’objectif 40x jusqu’à ce que l’huile embrasse le fond de la lamelle en verre.</li>
</ol>2. Configuration de l’isoflurane et préparation de la souris
<ol><li>Positionnez les composants électroniques du vaporisateur à faible débit (chambre d’anesthésie, tuyau, vaporisateur, cartouche de charbon) de manière à permettre au cône nasal et à la tubulure attachée d’atteindre l’insert (Figure 3A). ATTENTION : L’isoflurane est un anesthésique par inhalation et doit être manipulé avec précaution pour éviter les déversements et minimiser l’exposition humaine.</li>
	<li>Mesurez le poids de la bouteille d’isoflurane avant utilisation et enregistrez-la. Fixez le bouchon du vaporisateur électronique à la bouteille d’isoflurane.</li>
	<li>Connectez le cordon d’alimentation au vaporisateur électronique. Fermez les clips bleus du cône de nez et ouvrez les clips blancs de la chambre d’induction pour permettre à l’air de circuler à travers la chambre dans la cartouche de charbon de bois. Retirez le chapeau d’air ambiant rouge du côté gauche de la machine pour permettre à l’air de circuler.</li>
	<li>Laisser le système se réchauffer pendant 5 minutes à 200 mL/min (faible débit) et 2 % d’isoflurane. REMARQUE : Bien que le réglage du cône de nez soit sélectionné, la ligne de cône de nez bleu doit rester fermée et la ligne blanche de la chambre d’induction doit rester ouverte.</li>
	<li>Une fois que le système est correctement équilibré, purgez les conduites pour éliminer l’isoflurane restant de la chambre.</li>
	<li>Placez la souris dans la chambre d’induction et sélectionnez High Flow. Terminez toute la préparation de la souris (c.-à-d. l’épilation, l’administration topique de médicaments, l’application d’une pommade pour les yeux, etc.) avant de poser le corps de l’animal sur l’insert. Confirmez que la souris est complètement anesthésiée à l’aide de la méthode du réflexe de pincement des orteils.<ol><li>Avec la jambe tendue, utilisez un ongle pour pincer fermement l’orteil sans causer de dommages physiques. Si la souris présente une réaction positive au stimulus (c’est-à-dire une rétraction des jambes, une contraction du pied, etc.), continuez à administrer un anesthésique dans la chambre jusqu’à ce qu’aucune réaction ne soit observée. Une fois correctement anesthésiée, la fréquence respiratoire de la souris devrait ralentir à ~55-65 respirations par minute18.</li>
	</ol></li>
	<li>Lorsque la souris est complètement anesthésiée, sélectionnez à nouveau High Flow (Débit élevé) pour arrêter l’administration d’isoflurane. Purgez la chambre avant de l’ouvrir et ajustez les clips (bleu : ouvert ; blanc : fermé) pour délivrer l’isoflurane à travers le cône nasal. Sélectionnez Low Flow (Faible débit) pendant que le cône nasal est attaché à la souris pour continuer à administrer de l’isoflurane.</li>
	<li>Vissez le tube d’isoflurane avec le cône de nez attaché à travers le support de tube d’angle de l’insert (Figure 3A et Figure 5).</li>
</ol>3. Placement de la souris sur l’insert pour l’imagerie intravitale
<ol><li>Branchez la plaque chauffante sur le contrôleur (contenant une sonde anale attachée), allumez-la et laissez-la atteindre 36 °C (Figure 4A).</li>
	<li>Retirez la souris anesthésiée de la chambre d’induction et posez-la sur la plaque chauffante (Figure 4B et Figure 5A). Effectuez le transfert de la chambre à l’insertion rapidement pour minimiser le temps pendant lequel la souris est active sans anesthésie par inhalation.</li>
	<li>Fixez le cône de nez sur la souris (Figure 4B, C et Figure 5). Si nécessaire, utilisez du ruban adhésif pour sécuriser davantage l’angle et le positionnement du cône de nez.</li>
	<li>Insérez la sonde anale et ajustez la température du contrôleur jusqu’à ce que la température du corps de la souris soit stable à ~36 °C (Figure 4A,B). Une fois que la souris est correctement positionnée, utilisez une pellicule plastique pour emprisonner la chaleur, si nécessaire, afin de maintenir davantage la température corporelle appropriée (Figure 4C).</li>
	<li>Positionnez la souris de manière à ce que la tête s’aligne avec le disque de lamelle et immobilisez l’oreille au centre de la lamelle en verre à l’aide d’un clip d’oreille en métal (Figure 5A,B) ou d’un ruban adhésif (Figure 5C). REMARQUE : La pression du clip d’oreille métallique sur l’oreille peut être ajustée en desserrant la vis qui fixe le clip à l’insert. Un ressort métallique peut être ajouté pour une flexibilité accrue du serrage des clips.<ol><li>Pour modifier l’emplacement du clip d’oreille, dévissez le boulon à l’aide d’une clé Allen de 2,5 mm et transférez-le sur le site secondaire (Figure 2B,C). Lors du remontage du clip d’oreille, placez le clip contre l’insert, suivi de la rondelle sur le dessus. Utilisez un boulon pour fixer solidement le clip avec une légère force pour faire pivoter le clip.</li>
	</ol></li>
	<li>Ajustez le positionnement z de l’objectif jusqu’à ce que les cellules se trouvent à l’intérieur du point focal (Figure 6A,D). Définissez les paramètres z-stack et time-lapse en fonction des objectifs expérimentaux et commencez l’acquisition d’images. REMARQUE : Si la configuration correcte est obtenue, l’oreille de la souris peut être photographiée pendant au moins 3 h consécutifs (Figure 6A',D').<ol><li>Une fois que les limites de la pile z sont définies, ajustez la puissance et le gain du laser pour vous assurer qu’aucun plan z n’est sursaturé afin de minimiser le photoblanchiment. Déterminez les paramètres de time-lapse à l’aide de l’épaisseur totale de la pile z, du nombre d’étapes (échantillonnage de Nyquist recommandé) et des intervalles de temps.</li>
		<li>Déterminer les paramètres d’imagerie (intervalles de temps, temps total d’imagerie, etc.) à l’aide de plusieurs facteurs, y compris la viabilité de l’animal sous anesthésie, le photoblanchiment/phototoxicité induit par le laser et l’objectif de l’imagerie en direct (c.-à-d. la dynamique de la division cellulaire, les interactions cellule-cellule, etc.).</li>
	</ol></li>
</ol>4. Arrêt de l’imagerie
<ol><li>Allumez le coussin chauffant à circulation d’eau et réglez-le sur Cycle continu et 35 °C pendant au moins 30 minutes avant la fin de l’acquisition de l’image.</li>
	<li>Une fois l’imagerie terminée, sélectionnez Low Flow sur le vaporisateur électronique pour arrêter l’administration d’isoflurane et déplacez la souris vers un coussin chauffant jusqu’à ce qu’elle soit ambulatoire.</li>
	<li>Une fois réveillée, replacez la souris dans le récipient de transfert tout en continuant à la maintenir sur un coussin chauffant jusqu’à ce qu’elle soit complètement ambulatoire. Surveillez constamment la souris lorsqu’elle est sur le coussin chauffant jusqu’à ce qu’elle réponde.</li>
	<li>Sur le vaporisateur électronique, cliquez sur Sélectionner le menu > Contrôle anesthésique > vide. Retirez le flacon d’isoflurane du système et replacez le bouchon du fabricant sur le flacon.</li>
	<li>Mesurez le poids de la bouteille d’isoflurane et de la cartouche de charbon de bois et entrez les poids dans le journal. Une fois que la cartouche de charbon de bois pèse 50 g de plus que la mesure de base, jetez-la et remplacez-la par une nouvelle unité. Remettez l’isoflurane dans le coffre-fort.</li>
	<li>Retirez le disque de lamelle et essuyez-le avec du papier pour lentilles et une solution pour lentilles. Rangez-le correctement pour éviter les rayures et le réutiliser.</li>
	<li>Retirez la tubulure d’anesthésie du support d’insertion et dévissez l’insert de la platine du microscope.</li>
</ol>

Imagerie intravitale à l’aide d’un microscope inversé pour suivre la dynamique des cellules cutanées

<ol>
	<li>Babes, L., Yipp, B. G., Senger, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+of+the+metastatic+pulmonary+environment.">Intravital microscopy of the metastatic pulmonary environment.</a> Methods in Molecular Biology. , 383-396 (2023).</li><li>Nal Chen, ., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+promote+glioblastoma+tumor+cell+migration+after+biopsy.">Neutrophils promote glioblastoma tumor cell migration after biopsy.</a> Cells. 11 (14), 2196 (2022).</li><li>Courson, J. A., Langlois, K. W., Lam, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+to+study+platelet-leukocyte-endothelial+interactions+in+the+mouse+liver.">Intravital microscopy to study platelet-leukocyte-endothelial interactions in the mouse liver.</a> Journal of Visualized Experiments. 188 (188), (2022).</li><li>Rios, A. C., van Rheenen, J., Scheele, C. L. G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multidimensional+imaging+of+breast+cancer.">Multidimensional imaging of breast cancer.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 13 (5), (2022).</li><li>Fischer, M., Edelblum, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+to+visualize+murine+small+intestinal+intraepithelial+lymphocyte+migration.">Intravital microscopy to visualize murine small intestinal intraepithelial lymphocyte migration.</a> Current Protocols. 2 (8), (2022).</li><li>Pineda, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+of+hair+follicle+regeneration+in+the+mouse.">Intravital imaging of hair follicle regeneration in the mouse.</a> Nature Protocols. 10 (7), 1116-1130 (2015).</li><li>Entenberg, D., Oktay, M. H., Condeelis, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+to+study+cancer+progression+and+metastasis.">Intravital imaging to study cancer progression and metastasis.</a> Nature Reviews. Cancer. 23 (1), 25-42 (2023).</li><li>Turk, M., Biernaskie, J., Mahoney, D. J., Jenne, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+techniques+to+image+wound+healing+in+mouse+skin.">Intravital microscopy techniques to image wound healing in mouse skin.</a> Methods in Molecular Biology. , 165-180 (2022).</li><li>Pal Arndt, ., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+3D+intravital+look+at+the+juxtaglomerular+renin-cell-niche+reveals+an+individual+intra/extraglomerular+feedback+system.">A quantitative 3D intravital look at the juxtaglomerular renin-cell-niche reveals an individual intra/extraglomerular feedback system.</a> Frontiers in Physiology. 13, 980787 (2022).</li><li>Oal Yam, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+conversion+to+a+tumor-killing+phenotype+underpins+effective+microbial+therapy.">Neutrophil conversion to a tumor-killing phenotype underpins effective microbial therapy.</a> Cancer Research. 83 (8), 1315-1328 (2023).</li><li>Huang, S., Rompolas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+microscopy+for+intracutaneous+imaging+of+stem+cell+activity+in+mice.">Two-photon microscopy for intracutaneous imaging of stem cell activity in mice.</a> Experimental Dermatology. 26 (5), 379-383 (2017).</li><li>Durr, N. J., Weisspfennig, C. T., Holfeld, B. A., Ben-Yakar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maximum+imaging+depth+of+two-photon+autofluorescence+microscopy+in+epithelial+tissues.">Maximum imaging depth of two-photon autofluorescence microscopy in epithelial tissues.</a> Journal of Biomedical Optics. 16 (2), 026008 (2011).</li><li>Tauer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+and+risks+of+multiphoton+microscopy+in+physiology.">Advantages and risks of multiphoton microscopy in physiology.</a> Experimental Physiology. 87 (6), 709-714 (2002).</li><li>Yoshitake, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+comparison+between+confocal+and+multiphoton+microscopy+for+rapid+histopathological+evaluation+of+unfixed+human+breast+tissue.">Direct comparison between confocal and multiphoton microscopy for rapid histopathological evaluation of unfixed human breast tissue.</a> Journal of Biomedical Optics. 21 (12), 126021 (2016).</li><li>Mesa, K., Rompolas, P., Zito, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Niche-induced+cell+death+and+epithelial+phagocytosis+regulate+hair+follicle+stem+cell+pool.">Niche-induced cell death and epithelial phagocytosis regulate hair follicle stem cell pool.</a> Nature. 522, 94-97 (2015).</li><li>Ral Li, ., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pdgfra+marks+a+cellular+lineage+with+distinct+contributions+to+myofibroblasts+in+lung+maturation+and+injury+response.">Pdgfra marks a cellular lineage with distinct contributions to myofibroblasts in lung maturation and injury response.</a> eLife. 7, (2018).</li><li>Tal Tumbar, ., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+epithelial+stem+cell+niche+in+skin.">Defining the epithelial stem cell niche in skin.</a> Science. 303 (5656), 359-363 (2004).</li><li>Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+vital+signs+for+long-term+survival+of+mice+under+anesthesia.">Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2 (2), 5563 (2011).</li><li>Sanderson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-photon+microscopy.">Multi-photon microscopy.</a> Current Protocols. 3 (1), 634 (2023).</li></ol>

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Dans cette étude, nous présentons un nouvel outil qui facilite l’imagerie intravitale stable et à long terme des épithéliums cutanés intacts de souris sur des microscopes confocaux inversés. Cette invention est fabriquée en PLA, qui est le matériau imprimable en 3D le plus courant et le moins coûteux ; tous les coûts d’impression 3D en interne pour cet insert s’élèvent à 5 < $. Les deux pièces d’insertion séparées (Figure 1, Fichier supplémentaire 1...

La microscopie intravitale est un outil puissant qui permet de surveiller les comportements cellulaires dans leurs environnements in vivo non perturbés. Cette méthode unique a fourni des informations clés sur le fonctionnement interne de systèmes d’organes complexes de mammifères, notamment le poumon1, le cerveau2, le foie3, la glande mammaire4, l’intestin5 et la peau6. De plus, cette approche a révélé des altérations du comportement cellulaire au cours du développement de la tumeur7, de la cicatrisation des plaies8,9, de l’inflammation10 et d’autres pathologies diverses in situ. Dans cette étude, nous nous concentrons sur l’amélioration de l’accessibilité de la microscopie intravitale pour imager la dynamique épithéliale et stromale vivante dans la peau intacte de souris. La compréhension des comportements cellulaires de la peau des mammifères est d’une grande importance clinique en raison de la remarquable capacité de régénération et de tumoricité de ce tissu.
L’imagerie intravitale chez la souris a été principalement réalisée à l’aide de microscopes multiphotoniques verticaux en raison de leur capacité à fournir une imagerie à haute résolution à des profondeurs tissulaires >100 μm11,12. Néanmoins, ces instruments n’ont pas la polyvalence et l’accessibilité plus générale des microscopes confocaux inversés, qui sont plus conviviaux et plus rentables, permettent d’imager des cellules en culture, ne nécessitent pas d’obscurité complète lors de l’acquisition d’images et sont généralement plus sûrs, entre autres avantages notables13,14. Dans cette étude, nous présentons un nouvel outil qui améliore considérablement l’accessibilité de l’imagerie intravitale en adaptant cette approche aux microscopes confocaux inversés.
Ici, nous présentons une conception d’insert de platine personnalisée imprimée en 3D qui intègre plusieurs caractéristiques clés pour faciliter l’imagerie intravitale stable et à long terme de la peau de l’oreille de souris sur un microscope confocal inversé (Figure 1, Figure 2, Figure 3, Figure 4 et Figure 5). Ces caractéristiques spécialisées comprennent un trou d’objectif décalé qui permet au corps entier d’une souris adulte de reposer entièrement à plat pendant l’imagerie. Cela minimise les interférences vibratoires des mouvements du corps de la souris sur l’imagerie et élimine le besoin d’administrer de la kétamine et de la xylazine pour atténuer la respiration, une pratique souvent associée à l’imagerie intravitale6. De plus, des supports d’angle sur l’insert positionnent correctement un cône nasal isoflurane pour qu’il s’aligne avec le visage de la souris, un clip d’oreille en métal immobilise l’oreille de la souris sur un disque de lamelle construit sur mesure, et une plaque chauffante de biofeedback en boucle fermée amovible en option affleure dans l’insert pour soutenir la température du corps de la souris pendant les longues sessions d’imagerie. Le disque de lamelles personnalisé, qui fournit une surface plane essentielle pour que la tête et l’oreille de la souris puissent être posées à plat, a été généré dans un atelier d’usinage en enlevant les parois d’une boîte de culture cellulaire générique contenant des lamelles. L’utilisation d’une lentille d’immersion dans l’huile de silicone 40x (ouverture numérique de 1,25 [N.A.], distance de travail de 0,3 mm) en conjonction avec le disque de lamelle et l’insert de platine personnalisé permet d’obtenir des images haute résolution à >50 μm de profondeur dans le derme de l’oreille.
Pour tester la fonctionnalité de ce nouvel insert de platine de microscope inversé, nous avons capturé des empilements z couvrant toutes les couches épithéliales épidermiques sur une période de 3 h dans l’oreille d’une souris adulte transgénique vivante K14-H2B-mCherry15 (les noyaux épithéliaux de cette lignée de souris contiennent une étiquette fluorescente rouge) (Figure 6A-A'). Nous avons également capturé des piles z couvrant plusieurs couches de fibroblastes dans le derme de la peau sur une période de 3 h dans l’oreille d’un Pdgfra-rtTA16 transgénique vivant ; pTRE-H2B-GFP17 souris adulte (les noyaux des fibroblastes de cette lignée de souris contiennent un marquage fluorescent vert après induction de la doxycycline) (Figure 6B-D'). Nos données à haute résolution démontrent une stabilité constante par l’absence de dérive dans les plans x, y et z, prouvant ainsi l’efficacité de ce nouvel outil d’imagerie intravitale pour une utilisation sur des microscopes inversés. Il est important de noter que les dimensions de cet insert de platine imprimé en 3D peuvent être ajustées, comme décrit dans les fichiers supplémentaires 1, 2 et 3, pour s’adapter à n’importe quel microscope inversé, et le positionnement de l’ouverture de l’objectif peut être déplacé vers d’autres emplacements dans l’insert pour mieux s’adapter à l’imagerie d’un tissu particulier et/ou d’un modèle animal d’intérêt. Cette invention peut ainsi permettre à des laboratoires individuels, ou à des chercheurs disposant d’un accès confocal à une installation centrale, d’adapter cet outil à leurs besoins uniques en matière d’imagerie intravitale, rationalisant ainsi l’évaluation de diverses biologies cellulaires in vivo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3D Printer</td>
			<td>Qudi Tech</td>
			<td>i-Fast</td>
			<td>3D prints using PLA material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40x 1.25NA silicone objective lens</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AxR Laser Scanning Confocal Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Tipped Swab</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76337-046</td>
			<td>Cream/ointment application</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycycline hyclate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9891</td>
			<td>Induces GFP labeling of fibroblast nuclei in Pdgfra-rtTA; pTRE-H2B-GFP mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flathead Screwdriver (2.5 mm)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Affiix insert to microscope stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flathead Screws x 4 (#6-32)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Screw insert into microscope stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Bottom Culture Dish</td>
			<td>chemglass Life Sciences</td>
			<td>CLS-1811-002</td>
			<td>Modified by removing walls of dish for use as coverslip disk compatible with live insert; 35 mm wide disk contains 20 mm wide glass coverslip; dish walls were removed by machine shop</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Plate controller</td>
			<td>Physitemp</td>
			<td>TCAT-2LV</td>
			<td>Animal Temperature Controller - Low Voltage; anal prob attachment for mouse body temperature monitoring</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hex Wrench (1.5 mm)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For M3 setscrew adjustments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hex Wrench (2.5 mm)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Adjust tension on metal ear clip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intravital Imaging Insert</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Med-Vet International</td>
			<td>HPA030782-100uL</td>
			<td>Mouse anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labeling Tape (or Scotch Tape)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10127-458</td>
			<td>Alternative to metal ear clip to immobilize ear to coverslip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal fastener</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>used as ear clip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse: C57BL/6-Pdgfraem1(rtTA)Xsun/J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>RRID: IMSR_JAX:034459</td>
			<td>Fibrroblast-specific promoter driving doxycycline-inducible rtTA expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse: K14-H2BPAmCherry</td>
			<td>Courtesy of Dr. Valentina Greco at Yale University</td>
			<td></td>
			<td>Labels epidermal epithelial cell nuclei with mCherry; referred to in text as &#34;K14-H2B-mCherry&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse: pTRE-H2B-GFP: STOCK 
			Tg(tetO-HIST1H2BJ/GFP)47Efu/J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>RRID: IMSR_JAX:005104</td>
			<td>&#160;Labels fibroblast nuclei with GFP when combined with Pdgfra-rtTA and induced with doxycycline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multipurpose Sealing Wrap</td>
			<td>Glad</td>
			<td></td>
			<td>Enhance mouse warmth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optixcare</td>
			<td>VWR</td>
			<td>MSPP-078932779</td>
			<td>Eye lubricant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Set screws x 3 (M3; 6 mm)</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SS3M6</td>
			<td>Attachment for heatplate module</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Immersion Oil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Applied to 40x silicone objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Animal Heating Plate</td>
			<td>Physitemp</td>
			<td>HP-4M</td>
			<td>Provides heat to animal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Somnoflow Low-Flow Electronic Vaporizer</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>SF-01</td>
			<td>Mouse anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Grease</td>
			<td>Flinn Scientific</td>
			<td>AP1095</td>
			<td>Seals coverslip disk to insert</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Veet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>hair removal&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water circulating heat pad</td>
			<td>Stryker Medical</td>
			<td>TP700</td>
			<td>for mouse revival post-imaging</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

streamlined intravital imaging approach for long-term monitoring of epithelial tissue dynamics on an inverted confocal microscope

Comprendre les comportements normaux et aberrants des cellules in vivo est nécessaire pour développer des interventions cliniques visant à contrecarrer l’initiation et la progression de la maladie. Il est donc essentiel d’optimiser les approches d’imagerie qui facilitent l’observation de la dynamique cellulaire in situ, où la structure et la composition des tissus restent inchangées. L’épiderme est la barrière la plus externe de l’organisme, ainsi que la source des cancers humains les plus répandus, à savoir les carcinomes cutanés de la peau. L’accessibilité des tissus cutanés offre une occasion unique de surveiller les comportements des cellules épithéliales et dermiques chez les animaux intacts à l’aide de la microscopie intravitale non invasive. Néanmoins, cette approche d’imagerie sophistiquée a été principalement réalisée à l’aide de microscopes multiphotoniques verticaux, qui représentent une barrière importante à l’entrée pour la plupart des chercheurs. Cette étude présente un insert de platine de microscope conçu sur mesure, imprimé en 3D, adapté à une utilisation avec des microscopes confocaux inversés, rationalisant l’imagerie intravitale à long terme de la peau de l’oreille chez des souris transgéniques vivantes. Nous pensons que cette invention polyvalente, qui peut être personnalisée pour s’adapter à la marque et au modèle de microscope inversé de votre choix et adaptée à l’imagerie de systèmes d’organes supplémentaires, s’avérera inestimable pour l’ensemble de la communauté de la recherche scientifique en améliorant considérablement l’accessibilité de la microscopie intravitale. Cette avancée technologique est essentielle pour renforcer notre compréhension de la dynamique des cellules vivantes dans des contextes normaux et pathologiques.

Intravital microscopy is a powerful tool that allows the monitoring of cell behaviors in their unperturbed in vivo environments. This unique method has provided key insights into the inner workings of complex mammalian organ systems, including the lung1, brain2, liver3, mammary gland4, intestine5, and skin6. Furthermore, this approach has revealed cell behavioral alterations during tumor development7, wound healing8,9, inflammation10, and other diverse pathologies in situ. In this study, we focus on enhancing the accessibility of intravital microscopy to image live epithelial and stromal dynamics in intact mouse skin. Understanding cell behaviors in mammalian skin is of high clinical importance due to the remarkable regenerative and tumorigenic capacity of this tissue.
Intravital imaging in mice has&#160;been primarily performed using upright multiphoton microscopes due to their ability to provide high-resolution imaging at tissue depths &#62;100 &#181;m11,12. Nevertheless, these instruments&#160;lack the workhorse versatility and more general accessibility of inverted confocal microscopes, which are more user-friendly and cost-effective, provide the ability to image cultured cells, do not require complete darkness during image acquisition, and are generally safer, among other notable advantages13,14. In this study, we present a new tool that significantly enhances intravital imaging accessibility by adapting this approach for inverted confocal microscopes.
Here, we present a 3D-printed custom stage insert design that incorporates several key features to facilitate stable, long-term intravital imaging of mouse ear skin on an inverted confocal microscope (Figure 1, Figure 2, Figure 3, Figure 4, and Figure 5). These specialized features include an offset objective hole that allows the full body of an adult mouse to lay entirely flat during imaging. This minimizes the vibrational interference of mouse body movements on imaging and eliminates the need to administer ketamine and xylazine to dampen breathing, a practice often coupled with intravital imaging6. In addition, corner brackets on the insert correctly position an isoflurane nose cone to align with the face of the mouse, a metal ear clip immobilizes the mouse ear to a custom-built coverslip disk, and an optional detachable closed-loop biofeedback heat plate lies flush within the insert to support the mouse body temperature during long imaging sessions. The custom coverslip disk, which provides a flat surface essential for the mouse head and ear to lay flat, was generated in a machine shop by removing the walls of a generic coverslip-containing cell culture dish. The use of a 40x silicone oil immersion lens (1.25 numerical aperture [N.A.], 0.3 mm working distance) in conjunction with the coverslip disk and custom stage insert provides high resolution images &#62;50 &#181;m deep into the ear dermis.
To test the functionality of this new inverted microscope stage insert, we captured z-stacks spanning all epidermal epithelial layers over a 3 h time course in the ear of a live transgenic K14-H2B-mCherry15 adult mouse (epithelial nuclei in this mouse line contain a red fluorescent label) (Figure 6A-A&#39;). We also captured z-stacks spanning several fibroblast layers within the skin dermis over a 3 h time course in the ear of a live transgenic Pdgfra-rtTA16; pTRE-H2B-GFP17 adult mouse (fibroblast nuclei in this mouse line contain a green fluorescent label following doxycycline induction) (Figure 6B-D&#39;). Our high-resolution data demonstrate consistent stability by lack of drift in the x-, y-, and z-planes, thus proving the effectiveness of this new intravital imaging tool for use on inverted microscopes. Importantly, the dimensions of this 3D-printed stage insert can be adjusted, as described in Supplementary File 1, Supplementary File 2, and Supplementary File&#160;3, to fit any inverted microscope, and the positioning of the objective opening can be moved to alternative locations within the insert to better suit imaging a particular tissue and/or animal model of interest. This invention can thus empower individual laboratories, or investigators with core facility confocal access, to adapt this tool for their unique intravital imaging needs, thereby streamlining evaluation of diverse in vivo cell biology.

Pleins feux sur l’auteur : Développement d’un outil pour l’utilisation de microscopes confocaux inversés pour l’imagerie intravitale in vivo 

Approche simplifiée de l’imagerie intravitale pour la surveillance à long terme de la dynamique du tissu épithélial sur un microscope confocal inversé

We developed a tool to perform intravital imaging on live mice using an inverted confocal microscope. This enables us to track skin cell dynamics throughout homeostasis and compare cell behaviors during disease onset and progression. Multiphoton microscopy is the primary approach applied to achieve intravital cell tracking.However, the disadvantages of these microscopes include limited day-to-day imaging versatility, high cost, and technical complexity. Our new tool enables the use of versatile inverted confocal microscopes for in vivo intravital imaging. By modifying the design file, the stage insert dimensions can be customized to fit any make of inverted microscope.The objective hole can be resized and repositioned to fit any animal model and tissue of choice.

L’assemblage correct de l’insert d’imagerie en direct sur un microscope confocal inversé et l’orientation appropriée d’une souris transgénique au sommet de l’insert sont validés par l’acquisition d’empilements z de tissu auriculaire vivant marqué par fluorescence sur une période ≥1 h avec un minimum de signes de dérive dans les axes x, y et z. Les images doivent être capturées à intervalles réguliers (le temps d’intervalle dépendra de la question biologique, de la force du signal de fluore...

Watch this Scientific Journal Video about Developing a Tool for Using Inverted Confocal Microscopes for In Vivo Intravital Imaging at JoVE.com

Le protocole présente un nouvel outil pour simplifier l’imagerie intravitale à l’aide de la microscopie confocale inversée.

Understanding normal and aberrant in vivo cell behaviors is necessary to develop clinical interventions to thwart disease initiation and progression. It ...

Nous avons développé un outil permettant de réaliser une imagerie intravitale sur des souris vivantes à l’aide d’un microscope confocal inversé. Cela nous permet de suivre la dynamique des cellules de la peau tout au long de l’homéostasie et de comparer les comportements cellulaires au cours de l’apparition et de la progression de la maladie. La microscopie multiphotonique est la principale approche appliquée pour réaliser le suivi des cellules intravitales.Cependant, les inconvénients de ces microscopes comprennent une polyvalence d’imagerie quotidienne limitée, un coût élevé et une complexité technique. Notre nouvel outil permet l’utilisation de microscopes confocaux inversés polyvalents pour l’imagerie intravitale in vivo. En modifiant le fichier de conception, les dimensions de l’insert de platine peuvent être personnalisées pour s’adapter à n’importe quelle marque de microscope inversé.Le trou d’objectif peut être redimensionné et repositionné pour s’adapter à n’importe quel modèle animal et tissu de votre choix.

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Research

JoVE Journal

Biology

Streamlined Intravital Imaging Approach for Long-Term Monitoring of Epithelial Tissue Dynamics on an Inverted Confocal Microscope

1.1K vues.  Emory University School of Medicine. Nous avons développé un outil permettant de réaliser une imagerie intravitale sur des souris vivantes à l’aide d’un microscope confocal inversé. Cela nous permet de suivre la dynamique des cellules de la peau tout au long de l’homéostasie et de comparer les comportements cellulaires au cours de l’apparition et de la progression de la maladie. La microscopie multiphotonique est la principale approche appliquée pour réaliser le suivi des cellules intravitales.Cependant, l...

Vidéo: Pleins feux sur l’auteur : Développement d’un outil pour l’utilisation de microscopes confocaux inversés pour l’imagerie intravitale in vivo 

Understanding normal and aberrant in vivo cell behaviors is necessary to develop clinical interventions to thwart disease initiation and progression. It is therefore critical to optimize imaging approaches that facilitate the observation of cell dynamics in situ, where tissue structure and composition remain unperturbed. The epidermis is the body&#39;s outermost barrier, as well as the source of the most prevalent human cancers, namely cutaneous skin carcinomas. The accessibility of skin tissue presents a unique opportunity to monitor epithelial and dermal cell behaviors in intact animals using noninvasive intravital microscopy. Nevertheless, this sophisticated imaging approach has primarily been achieved using upright multiphoton microscopes, which represent a significant barrier for entry for most investigators. This study presents a custom-designed, 3D-printed microscope stage insert suitable for use with inverted confocal microscopes, streamlining the long-term intravital imaging of ear skin in live transgenic mice. We believe this versatile invention, which may be customized to fit the inverted microscope brand and model of choice and adapted to image additional organ systems, will prove invaluable to the greater scientific research community by significantly enhancing the accessibility of intravital microscopy. This technological advancement is critical for bolstering our understanding of live cell dynamics in normal and disease contexts.

The protocol presents a new tool to simplify intravital imaging using inverted confocal microscopy.

Recherche

Biologie

Installing the Live Imaging Insert on an Inverted Microscope Stage

To begin installing the 3D printed live imaging insert on the inverted microscope stage, carefully place the insert into the large microscope stage groove. Using screws, secure each corner of the insert. Slide the heat plate into the side opening of the insert in a plug side down orientation, so the plate lays atop the lower insert grooves with the plug port underneath the stage.Align the grooved circular opening in the insert with a 40 x silicone oil immersion objective and apply silicone oil to the center of the objective. Then using a syringe, apply a small amount of vacuum grease along the grooved circular opening. Lay the cover slip disk on top of the opening to seal it onto the insert.Finally, raise the 40 x objective until it barely touches the bottom of the glass cover slip.

Installation de l’insert d’imagerie en direct sur une platine de microscope inversée

Mounting the Mouse on the Live Imaging Insert for Intravital Imaging

Before placing the anesthetized mouse on the live imaging insert installed on the inverted microscope stage, thread the isoflurane tubing with the attached nose cone through the corner tubing bracket on the insert. After plugging the heat plate into the controller containing an attached anal thermometer probe and switching it on, transfer the anesthetized mouse from the induction chamber onto the heat plate. Then secure the nose cone onto the mouse.Insert the anal probe into the animal and adjust the controller to maintain a stable body temperature of about 36 degrees Celsius. Cover the properly-positioned mouse with a plastic cling wrap to trap body heat and elevate the body temperature. Position the mouse such that its head aligns with the cover slip disc and immobilize its ear onto the center of the glass cover slip using a metal ear clip or tape.After completing imaging, select the Low Flow option on the electronic vaporizer to cease isoflurane delivery. Transfer the mouse to a heating pad until it becomes ambulatory. After removing the cover slip disc, wipe it clean with lens paper and lens solution.Store it properly to avoid scratches for reuse. Next, detach the anesthetic tubing from the insert bracket and unscrew the insert from the microscope stage. The acquired Z-stacks of fluorescently-labeled live mouse ear tissue showed minimal drift in the x, y and z axes over time, validating the custom 3D printed live imaging inserts.The time points from a three hour time lapse movie of the mCherry positive mouse ear epidermal cells of an adult male mouse revealed a single z plane remaining in focus over the extended time. Similar observations were made from another three-hour time lapse movie of GFP positive ear dermal fibroblasts of an adult female mouse.