Cette procédure de coulée et d’insertion de fenêtres en silicone abaisse les barrières techniques à l’imagerie intravitale longitudinale. Notre protocole produit des fenêtres robustes, facilement adaptables et bien tolérées par les animaux. En utilisant cette technique, nous avons imagé le cancer et les cellules immunitaires dans le foie, le pancréas et la glande mammaire.
Avec un minimum d’ajustements, il pourrait être adapté à de nombreux emplacements anatomiques et questions biologiques. Pour ceux qui essaient cette technique pour la première fois, entraînez-vous à libérer de petites quantités de colle de la seringue. L’application de trop de colle obscurcira le champ d’imagerie et rendra la zone chirurgicale difficile à travailler.
Commencez à couler la fenêtre en silicone en déposant une petite quantité de polymère de silicone fraîchement préparé, le polydiméthylsiloxane, de PDMS, sur une surface lisse et propre, et ajustez le rapport volume/surface pour obtenir l’épaisseur souhaitée. Une fois que le PDMS est déposé sur la surface de coulée souhaitée, appuyez légèrement sur une grille en acier inoxydable dans le silicone pour fournir des repères pour l’imagerie répétée des mêmes régions tissulaires. Pour éliminer les bulles d’air et dégazer le polymère de silicone, placez la surface revêtue dans un dessiccateur sous vide pendant 45 minutes.
Une fois terminé, durcissez le polymère dans un four à 75 à 80 degrés Celsius pendant 45 minutes. Marquez le polymère sur les bords du moule et utilisez des pinces pour décoller doucement les fenêtres durcies de la surface utilisée pour la coulée. Placez la souris sur la position latérale gauche du décubitus.
Préparer la souris anesthésiée à la chirurgie en appliquant 10% volume par volume de solution d’iode de povidone et 70% volume par volume d’éthanol trois fois consécutivement sur le site chirurgical rasé. Il faut veiller à maintenir un champ chirurgical stérile. Ensuite, utilisez des ciseaux et des pinces stériles pour faire une incision de 10 millimètres sur le flanc droit à trois millimètres sous l’arc costal.
Retirez une section d’un centimètre carré de la peau et utilisez une deuxième paire de ciseaux et de pinces stériles pour enlever une section du péritoine légèrement plus petite que la section de la peau. Déposez une petite quantité d’adhésif chirurgical sur une plaque de puits stérile et retirez-la avec une seringue de calibre 31 à appliquer sur la surface du foie autour des bords de la zone à imager, puis positionnez la fenêtre sur la zone souhaitée et maintenez-la fermement contre le foie pendant environ deux minutes jusqu’à ce que l’adhésif ait séché. Après avoir plié les bords de la fenêtre sous le péritoine, déposez une petite quantité d’adhésif chirurgical sur les bords de la fenêtre qui se trouvent maintenant sous le péritoine, appuyez sur le péritoine avec une pince pour le fixer à la fenêtre.
De même, scellez le péritoine en déposant une petite quantité d’adhésif chirurgical avant de pousser la peau vers le bas, puis appliquez de la colle sur les bords de la fenêtre pour créer un rebord qui empêchera la peau de repousser sur la fenêtre. Pour insérer la fenêtre dans le pancréas, placez la souris sur la position de décubitus latéral droit et faites l’incision sur le flanc gauche avant de retirer une section du péritoine comme démontré précédemment. À l’aide de cotons-tiges stériles imbibés de solution saline stérile, tirez doucement la rate pour visualiser le pancréas.
Repositionnez le pancréas avec les cotons-tiges humidifiés pour rendre plus de surface visible à travers l’incision. Une fois le pancréas accessible, insérez et scellez la fenêtre d’imagerie sur la zone souhaitée comme expliqué précédemment. Pour accéder à la glande mammaire, placez la souris en position couchée et faites une incision médiale de 10 millimètres sur l’un des mamelons inguinaux à l’aide de ciseaux et de pinces stériles.
Retirez une section de 0,5 centimètre carré de la peau au-dessus de la glande mammaire, puis séparez doucement la glande mammaire de la peau en étalant les ciseaux stériles entre les deux surfaces pour perturber l’adhérence. Utilisez une seringue de calibre 31 pour appliquer une petite quantité d’adhésif chirurgical sur la surface de la glande mammaire autour des bords de la zone à imager. Positionnez et maintenez fermement la fenêtre contre la glande mammaire jusqu’à ce que l’adhésif sèche.
Après avoir plié les bords de la fenêtre sous la peau, déposez une petite quantité d’adhésif chirurgical sur les bords de la fenêtre qui sont maintenant sous la peau et appuyez sur la peau avec une pince pour fixer la peau à la fenêtre. Appliquez la colle autour des bords de la fenêtre pour créer un rebord qui empêchera la peau de repousser sur la fenêtre. Avant de commencer la séance d’imagerie, nettoyez la fenêtre de tout débris résiduel en l’essuyant doucement avec un coton-tige trempé dans de l’éthanol à 70%.
Lorsque vous utilisez une lentille d’immersion dans l’eau, appliquez le gel à ultrasons sur la fenêtre en évitant les bulles. Pour démarrer l’imagerie, localisez et placez la grille au point à travers les oculaires. Déterminez ensuite la profondeur approximative de l’imagerie tissulaire en mettant le bas de la grille à zéro.
Les informations aideront à localiser le plan Z correspondant lors de sessions d’imagerie ultérieures. Pour identifier le même emplacement sur plusieurs sessions d’imagerie, utilisez les carrés de la grille comme point de référence. Pendant la séance d’imagerie, notez l’orientation de la grille et l’emplacement de chaque champ de vision imagé dans la grille.
La grille peut être utilisée pour revenir à des zones de grille et des champs d’imagerie spécifiques dans le succès des sessions d’imagerie. Après chaque séance d’imagerie, retirez tout milieu d’immersion résiduel de la lentille et les débris en essuyant doucement la fenêtre avec un coton-tige trempé dans de l’éthanol à 70%. La fenêtre en silicone permet de capturer l’infiltration dynamique des cellules immunitaires au fil du temps.
L’analyse représentative illustre l’infiltration de neutrophiles dans le tissu remodelant de la glande mammaire aux deuxième et quatrième jours. La fenêtre en silicone permet de visualiser les tumeurs à plusieurs moments sur plusieurs semaines après l’insertion de la fenêtre. Les fenêtres coulées avec 200 milligrammes de PDMS sont généralement meilleures pour l’implantation chirurgicale car elles présentaient une ténacité significativement plus grande que les fenêtres coulées avec 150 milligrammes.
Il convient de noter que les fenêtres PDMS n’étaient pas aussi rigides que le verre standard, représenté par le module de Young des fenêtres en verre étant significativement plus grand que le PDMS. L’insertion de fenêtres dans différents organes a été bien tolérée car la plupart des souris ont continué à prendre du poids au fil du temps. La chose la plus importante à retenir lors de cette tentative est de sceller complètement la fenêtre à l’aide de colle.
Cela empêche l’infection, le dessèchement des tissus et le déplacement de la fenêtre. Après la procédure, les injections orthotopiques peuvent être effectuées à travers la fenêtre en silicone, ce qui permet aux chercheurs d’étudier une grande variété de sujets, tels que la prolifération cellulaire, les interactions cellule-cellule et l’efficacité thérapeutique.
