Ce travail a été soutenu par un prix d’innovation et de développement technologique du Center for the Development of Therapeutics du Broad Institute du MIT et de Harvard. Les auteurs tiennent à remercier les membres de l’équipe de la haute direction et du comité d’examen pour leur soutien à ce travail.

Toutes les protéines ont été surexprimées dans E. coli avec un bon rendement et une bonne pureté (>80%) selon les protocoles de la littérature18. La biotinylation a été réalisée à l’aide d’une réaction catalysée par BirA18. Toutes les petites molécules ont été préparées à 1 mM de solutions mères dans du DMSO à 100 %. Les procédures décrites dans le présent document ne nécessitent pas d’équipement de sécurité ou de précautions de laboratoire spécialisés. L’équipement de protection individuelle (EPI) standard de laboratoire doit être utilisé (c’est-à-dire une blouse de laboratoire, des lunettes de sécurité et des gants).
Les protéines utilisées dans cette étude sont énumérées ci-dessous : VHL : complexe VHL(53-213)/ElonginB (1-104)/ElonginC(17-112) biotinylé avec Avi-tag à l’extrémité C de l’ElonginB. Brd4BD2 : Brd4BD2 non étiqueté (333-460) CRBN : CRBN biotinylé(319-442) avec Avi-tag à l’extrémité N PPM1D : PPM1D(1-420) non marqué ou double marqué His8 à l’extrémité N
Les petites molécules utilisées dans cette étude sont énumérées ci-dessous : MZ1 (MW = 1002,6 Da) : PROTAC qui se lie à VHL et Brd4BD2 BRD-2512 (MW = 841,4 Da) : CRBN KD ~3 μM, ne se lie pas à PPM1D BRD-5110 (MW = 872,0 Da) : CRBN K D ~3 μM, PPM1D KD = 1-2 nM BRD-4761 (MW = 476,6 Da) : ne se lie pas à CRBN, PPM1D KD = 1-2 nM
1. Méthode 1 : ITC (calorimétrie de titrage isotherme)
REMARQUE : Les titrages sont effectués à l’aide d’un micro-calorimètre avec auto-injection.
<ol><li>Préparation du tampon : Préparer 3 L de tampon contenant 20 mM HEPES, 150 mM de NaCl, 1 mM de TCEP, pH 7,5.</li>
	<li>Dialyse : Dialyser VHL et Brd4BD2 (~ 500 μL à 150 μM chacun) contre 1 L du tampon préparé à l’étape 1.1, 3 fois à 4 °C, pendant 4 h, 2 h et environ 16 h, respectivement. Conservez le tampon après la dernière dialyse pour l’utiliser dans les étapes suivantes.</li>
	<li>Préparez les échantillons sur une plaque de 96 puits munie d’un couvercle en plastique.<ol><li>Pour chaque titrage, préparez 400 μL de solution pour la cellule, 125 μL pour la seringue et 400 μL de tampon pour le nettoyage. Ajouter des échantillons à trois puits consécutifs sur la plaque. Étant donné que le composé est préparé à 1 mM dans du DMSO à 100 %, ajoutez le même pourcentage de DMSO aux solutions protéiques pour assurer le tampon correspondant dans la cellule et la seringue. Ajoutez 2 % de DMSO aux solutions finales.<ol><li>Échantillon pour le titrage de la VHL en MZ1 : Préparer une solution cellulaire contenant 392 μL de tampon, 4 μL de MZ1 à 1 mM (concentration finale de 10 μM) et 4 μL de DMSO à 100 %. Préparer une solution de seringue contenant 122,5 μL de VHL à 85,7 μM, 2,5 μL de DMSO à 100 % (concentration finale de 84 μM).</li>
			<li>Échantillons pour le titrage de la VHL dans le tampon (les données seront utilisées pour la soustraction de fond des données générées à partir de l’échantillon 1.3.1.1) : Préparer une solution cellulaire contenant 392 μL de tampon, 8 μL de DMSO à 100 %. Préparer une solution de seringue contenant 122,5 μL de VHL à 85,7 μM (concentration finale de 84 μM) et ajouter 2,5 μL de DMSO à 100 %.</li>
			<li>Échantillons pour le titrage du VHL en MZ1 et Brd4 BD2 : Préparer une solution cellulaire contenant 392 μL de 17,1 μM Brd4BD2 (concentration finale de 16,8 μM), 3,36 μL de MZ1 à 1 mM (concentration finale de 8,4 μM) et 4,64 μL de DMSO à 100 %. Préparer une solution de seringue contenant 122,5 μL de VHL à 85,7 μM (concentration finale de 84 μM) et 2,5 μL de DMSO à 100 %.</li>
			<li>Echantillons pour le titrage de la VHL en Brd4 BD2 (bruit de fond du 1.3.1.3) : Préparer une solution cellulaire contenant 392 μL de Brd4BD2 à 17,1 μM (concentration finale de 16,8 μM) et 8 μL de DMSO à 100 %. Préparer une solution de seringue contenant 122,5 μL de VHL à 85,7 μM (concentration finale de 84 μM) et 2,5 μL de DMSO à 100 %.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Exécutez les quatre titrages sur le micro-calorimètre. Chacune consiste en 19 injections de solution de seringue de 2 μL à raison de 2 μL/s à des intervalles de temps de 120 s. Faites une première injection de protéines (0,4 μL) et jetez-la lors de l’analyse des données. Effectuer toutes les expériences à 25 °C, en remuant à 600 tr/min.</li>
	<li>Analyse des données : Ajuster les données à un modèle à site de liaison unique pour obtenir la stœchiométrie (n), la constante de dissociation (KD) et l’enthalpie de liaison (ΔH) à l’aide du logiciel d’analyse fourni par le fabricant (Figure 2).</li>
</ol>2. Méthode 2 : BLI (interférométrie des biocouches)
<ol><li>Réalisez des expériences BLI à l’aide de capteurs enrobés de streptavidine (SA) à température ambiante (RT) avec un taux d’acquisition de 5 Hz. Au cours de l’expérience BLI automatisée, assurez-vous que les capteurs sont stationnaires à l’intérieur d’une seule colonne et se déplacent entre les différentes colonnes d’une plaque noire à fond plat de 96 puits avec un volume de puits maximal de 392 μL. Remplissez chaque puits de la plaque utilisée dans l’expérience avec 200 μL de solution. REMARQUE : Le BLI n’est utile que pour détecter les interactions protéine-protéine (c’est-à-dire la formation de complexes ternaires). Il n’est pas assez sensible pour détecter les interactions entre les protéines et les petites molécules.<ol><li>Préparation du tampon : Préparer 100 mL de tampon contenant 20 mM HEPES, 150 mM de NaCl, 1 mM de TCEP, 0,05 % de P20, pH 7,5.</li>
		<li>Optimisation de l’étape d’immobilisation : Chargez le capteur de test à 1-3 nm, comme recommandé par le fabricant. Une charge de ~1,0 nm est utilisée pour les procédures décrites ici. Pour ce faire, plongez le capteur dans une solution contenant du VHL à 1,5 μg/mL pendant 80 s.</li>
		<li>Effectuez des mesures cinétiques BLI en appliquant sept capteurs SA en utilisant l’ordre suivant :<ol><li>Pour la première phase de référence, plongez dans le tampon pendant 60 s.</li>
			<li>Pour la phase d’immobilisation, tremper dans une solution de VHL à 1,5 μg/mL pendant 80 s.</li>
			<li>Pour la deuxième phase de référence, plongez dans le tampon pendant 60 s.</li>
			<li>Pour la phase d’association, plonger dans une solution d’une concentration fixe de Brd4BD2 à 2 μM, d’une concentration fixe de DMSO à 2 % et de concentrations variables de MZ1 à 100 nM, 50 nM, 25 nM, 12,5 nM, 6,3 nM, 3,1 nM et 0 nM (capteur de référence) pendant 300 s.</li>
			<li>Pour la phase de dissociation, plonger dans le tampon pendant 600 s.</li>
		</ol></li>
		<li>Effectuez l’analyse des données à l’aide du logiciel du fabricant. k on, k off et kd sont signalés pour l’ajustement des données (Figure 3). </li>
	</ol></li>
</ol>3. Méthode 3 : SPR (résonance plasmonique de surface)
REMARQUE : Toutes les expériences SPR sont effectuées à l’aide de puces de capteur enrobées de streptavidine (SA) à RT. Bien que la puce NTA soit utilisée pour la détection entre les protéines et les petites molécules, elle doit être utilisée avec prudence lorsqu’elle est appliquée au complexe ternaire, car un bruit de fond beaucoup plus élevé que celui de la puce SA est observé, peut-être en raison d’interactions électrostatiques entre la surface de la puce chargée et la protéine dans l’analyte.
<ol><li>SPR pour l’interaction VHL-MZ1<ol><li>Préparation du tampon.<ol><li>Préparez un tampon de 1 L contenant 20 mM HEPES, 150 mM de NaCl, 1 mM de TCEP, 0,005 % de P20, pH 7,5 et passez-le dans une unité de filtration de 0,2 μm.</li>
			<li>Retirez 20 mL de tampon pour une utilisation ultérieure (tampon sans DMSO) et remplissez-le avec 20 mL de DMSO (2 % de DMSO dans le tampon final en cours d’exécution). Maintenir le DMSO à 2 % dans tous les échantillons décrits ci-dessous (étapes 3.1 et 3.2)</li>
		</ol></li>
		<li>Activer la puce SA en suivant le protocole du fabricant et immobiliser le VHL à ~2000 RU (injecter une solution protéique de 5 μg/mL à 5 μL/min).</li>
		<li>Préparer MZ1 en 3 fois, 8 points de dilution en série avec la concentration maximale à 10 μM sur une plaque de polypropylène translucide à fond conique de 384 puits d’un volume maximal de 130 μL. Recouvrez la plaque de feuilles de plastique transparentes auto-adhésives compatibles avec les microplaques en polypropylène.<ol><li>Préparez la concentration maximale avec le tampon sans DMSO pour assurer la concentration finale de 2 % de DMSO. À 147 μL de tampon sans DMSO, ajoutez 1,5 μL de stock MZ1 à 1 mM et 1,5 μL de DMSO 100 %.</li>
			<li>Préparez la dilution en série 3 fois avec le tampon de fonctionnement contenant 2 % de DMSO. À 100 μL du tampon courant, ajouter 50 μL de solution à la concentration maximale préparée à l’étape 3.1.3.1 et bien mélanger pour préparer la 2econcentration la plus élevée.</li>
			<li>Transférez ensuite 50 μL de la solution préparée à l’étape 3.1.3.2 dans les 100 μL suivants de tampon courant, mélangez bien pour préparer la 3ème concentration la plus élevée, et ainsi de suite.</li>
		</ol></li>
		<li>Exécutez SPR à l’aide de la configuration multi-cycles : Mode : Haute performance ; Temps de contact : 120 s ; Temps de dissociation : 300 s ; débit : 50 μL/min.</li>
		<li>Effectuer l’analyse des données à l’aide du logiciel d’évaluation fourni par le fabricant de l’instrument. L’analyse en régime permanent a indiqué que KD = 26 (± 3) nM et Rmax de ~91 % (± 5 %) de liaison ont été obtenus (Figure 4A)</li>
	</ol></li>
	<li>SPR pour VHL : MZ1 : Complexe ternaire Brd4BD2<ol><li>Préparez la mémoire tampon comme décrit à l’étape 3.1.1.</li>
		<li>Activez la puce SA en suivant le protocole du fabricant et immobilisez VHL à ~100 RU. Injecter une solution protéique de 0,5 μg/mL VHL à un débit de 5 μL/min et un temps de contact compris entre 1 et 5 min jusqu’à ce qu’une densité de surface de ~100 RU soit atteinte.</li>
		<li>Préparer les échantillons pour deux injections à cycle unique en 5 points et 5 fois dans une plaque à fond rond en polystyrène transparent de 96 puits d’un volume maximal de 323 μL et la recouvrir de feuilles de plastique transparentes autoadhésives compatibles avec les microplaques de polystyrène, comme décrit aux étapes 3.2.3.1 à 3.2.3.2.<ol><li>Contrôle négatif : l’analyte ne contient que Brd4BD2 .<ol><li>Préparer la concentration maximale à 25 μM dans un tampon de fonctionnement d’un volume de 200 μL (#A5)</li>
				<li>Ajouter 160 μL de Brd4BD2 à 2 μM dans le tampon de fonctionnement aux 4 puits suivants à gauche (#A1-A4)</li>
				<li>Transférez 40 μL de A5 sur A4. Bien mélanger.</li>
				<li>Transférez 40 μL de A4 au format A3. Bien mélanger. Continuez ainsi jusqu’à A1.</li>
			</ol></li>
			<li>Formation d’un complexe ternaire : l’analyte contient MZ1 et Brd4BD2.<ol><li>Préparer la concentration maximale en ajoutant 4 μL de MZ1 à 20 μM dans une solution de DMSO à 100 % à 196 μL contenant 25,5 μM de Brd4BD2 dans un tampon sans DMSO (#B5). Les concentrations finales sont de 25 μM Brd4BD2, 100 nM de MZ1 et 2 % de DMSO.</li>
				<li>Ajouter 160 μL de Brd4BD2 à 2 μM dans le tampon de fonctionnement aux 4 puits suivants à gauche (#B1-B4)</li>
				<li>Transférer 40 μL de B5 à B4. Bien mélanger.</li>
				<li>Transférer 40 μL de B4 à B3. Bien mélanger. Continuez ainsi jusqu’à B1.</li>
			</ol></li>
		</ol></li>
		<li>Exécutez SPR à l’aide de la configuration à cycle unique : Temps de contact : 100 s ; Temps de dissociation : 720 s ; débit : 50 μL/min. Appliquez trois injections de tampon avant chaque échantillon pour assurer un fond stable.</li>
		<li>Analyse des données : Appliquer la troisième injection du tampon comme arrière-plan pour la soustraction. En tant que témoin négatif, lorsque MZ1 n’est pas présent, la réponse SPR entre VHL et Brd4BD2 est négligeable. Lorsque MZ1 est présent, l’ajustement cinétique indique que l’interaction entre VHL et le complexe MZ1-Brd4BD2 a k on = 7,9 (± 1,5) *107 /M/s, koff = 0,014 s-1 et KD = 1 nM. (Graphique 4B)</li>
	</ol></li>
	<li>SPR pour les interactions CRBN et petites molécules<ol><li>Préparation du tampon.<ol><li>Préparez un tampon de 1 L contenant 50 mM de Tris, 100 mM de NaCl, 1 mM de MgCl 2, 0,5 mM de TCEP, 0,005 % de P20, pH 7,5 et passez-le dans une unité de filtration de0,2 μm.</li>
			<li>Retirez 20 mL de tampon et remplissez 20 mL de DMSO à 100 % (2 % de DMSO dans le tampon de fonctionnement final). Il est important de maintenir le DMSO à 2 % dans tous les échantillons décrits ci-dessous (étapes 3.3, 3.4 et 3.5).</li>
		</ol></li>
		<li>Activez la puce SA en suivant le protocole du fabricant et immobilisez CRBN à ~800 RU.</li>
		<li>Préparer les composés en dilution en série 3 fois et 6 points sur une plaque à 384 puits avec une concentration maximale de 30 μM, comme décrit au point 3.1.3.</li>
		<li>Exécutez SPR à l’aide de la configuration multicycle : Mode : Haute performance, temps de contact : 60 s, temps de dissociation : 90 s ; débit : 50 μL/min. Pour ce système, trois injections de tampon suffisent pour obtenir un bruit de fond stable. Pour d’autres systèmes de dosage, il peut être nécessaire d’effectuer des injections de tampon supplémentaires.</li>
		<li>Effectuez l’analyse des données à l’aide du logiciel du fabricant. REMARQUE : L’analyse en régime permanent indique que le KD du BRD-2512 et du BRD-5110 est d’environ 3 μM. Cependant, la liaison n’a atteint que ~ 70% de liaisonR max à la concentration maximale. La faible affinité et la forme du sensorgramme indiquent que l’insolubilité du composé à des concentrations élevées est susceptible de se produire. Ainsi, le KD réel pourrait être supérieur à 3 μM. BRD-4761, qui ne se lie pas au CRBN, a été inclus comme témoin négatif.</li>
	</ol></li>
	<li>SPR pour les interactions PPM1D et petites molécules<ol><li>Préparez la mémoire tampon comme décrit à l’étape 3.3.1. Utilisez une puce de capteur d’acide nitriloacétique (NTA).</li>
		<li>Appliquer un cycle unique car l’ogive PPM1D a un k lent activé et kdésactivé. Régénérez la puce NTA en utilisant la configuration par défaut du fabricant et immobilisez PPM1D à ~ 1000 RU après chaque injection de composé (injecter une solution protéique de 5 μg/mL à 5 μL/min).</li>
		<li>Préparer les composés en dilution en série 3 fois et en 5 points avec la concentration maximale à 400 nM comme décrit au point 3.1.3.</li>
		<li>Exécutez SPR à l’aide de la configuration à cycle unique : Mode : haute performance ; Temps de contact : 90 s ; Temps de dissociation : 600 s ; débit : 50 μL/min. Appliquez trois injections de tampon avant chaque composé pour assurer un fond stable.</li>
		<li>Analyse des données. Appliquez la troisième injection du tampon comme arrière-plan pour la soustraction. En tant que témoin négatif, BRD-2512 ne se lie pas à PPM1D. Pour le BRD-4761 et le BRD-5110, l’ajustement cinétique indiquait que le KD pour les deux était de 1 à 2 nM.</li>
	</ol></li>
	<li>SPR pour CRBN :PROTAC : Complexe ternaire PPM1D<ol><li>Préparez la mémoire tampon comme décrit à l’étape 3.3.1.</li>
		<li>Activer la puce SA en suivant le protocole du fabricant et immobiliser le CRBN à ~35 RU (injecter une solution protéique de 0,5 μg/mL à 5 μL/min).</li>
		<li>Préparer trois composés en dilution série 3 fois et 6 points avec une concentration maximale de 30 μM tout en maintenant [PPM1D] à 1 μM dans tous les échantillons, y compris les blancs, en utilisant la méthode décrite à l’étape 3.2.3.</li>
		<li>Exécutez SPR à l’aide de la configuration multi-cycles : Mode : Haute performance ; Temps de contact : 60 s ; Temps de dissociation : 90 s ; débit : 50 μL/min.</li>
		<li>Effectuez l’analyse des données à l’aide du logiciel du fabricant. REMARQUE : Alors que le BRD-2512 et le BRD-4761 ne présentent pas de réponse ou une réponse négligeable, le BRD-5110 montre clairement « l’effet d’accrochage » à l’état stationnaire avec une cinétique marche/arrêt rapide (Figure 5A-C). La réponse expérimentale de liaison de BRD-5110 (Figure 5C) se situe entre la réponse prédite de la simulation en supposant que K D (CRBN, cpd) est de 3 ou 10 μM (Figure 5E), ce qui suggère que le K D ternaire et le KD binaire sont très similaires. Il n’y a pas de coopérativité apparente de PPM1D : BRD-5110 : formation du complexe CRBN.</li>
	</ol></li>
</ol>

Caractérisation de la formation de complexes ternaires dans les PROTAC à l’aide d’essais biophysiques

<ol>
	<li>Balaji, V., Hoppe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+E3+ubiquitin+ligases+by+homotypic+and+heterotypic+assembly.">Regulation of E3 ubiquitin ligases by homotypic and heterotypic assembly.</a> F1000Research. 9, (2020).</li><li>Song, L., Luo, Z. -. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-translational+regulation+of+ubiquitin+signaling.">Post-translational regulation of ubiquitin signaling.</a> Journal of Cell Biology. 218 (6), 1776-1786 (2019).</li><li>Yang, Q., Zhao, J., Chen, D., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E3+ubiquitin+ligases:+styles,+structures+and+functions.">E3 ubiquitin ligases: styles, structures and functions.</a> Molecular Biomedicine. 2 (1), 23 (2021).</li><li>Grice, G. L., Nathan, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+recognition+of+ubiquitinated+proteins+by+the+proteasome.">The recognition of ubiquitinated proteins by the proteasome.</a> Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. 73 (18), 3497-3506 (2016).</li><li>Chirnomas, D., Hornberger, K. R., Crews, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+degraders+enter+the+clinic+-+a+new+approach+to+cancer+therapy.">Protein degraders enter the clinic - a new approach to cancer therapy.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 20 (4), 265-278 (2023).</li><li>Toure, M., Crews, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule+PROTACS:+New+approaches+to+protein+degradation.">Small-molecule PROTACS: New approaches to protein degradation.</a> Angewandte Chemie (International ed. In English). 55 (6), 1966-1973 (2016).</li><li>Ottis, P., Toure, M., Cromm, P. M., Ko, E., Gustafson, J. L., Crews, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+different+E3+ligases+for+small+molecule+induced+protein+ubiquitination+and+degradation.">Assessing different E3 ligases for small molecule induced protein ubiquitination and degradation.</a> ACS Chemical Biology. 12 (10), 2570-2578 (2017).</li><li>Riching, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+live-cell+kinetic+degradation+and+mechanistic+profiling+of+PROTAC+mode+of+action.">Quantitative live-cell kinetic degradation and mechanistic profiling of PROTAC mode of action.</a> ACS Chemical Biology. 13 (9), 2758-2770 (2018).</li><li>Nabet, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dTAG+system+for+immediate+and+target-specific+protein+degradation.">The dTAG system for immediate and target-specific protein degradation.</a> Nature Chemical Biology. 14 (5), 431-441 (2018).</li><li>Paiva, S. -. L., Crews, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+protein+degradation:+elements+of+PROTAC+design.">Targeted protein degradation: elements of PROTAC design.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 50, 111-119 (2019).</li><li>Hershko, A., Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin+system.">The ubiquitin system.</a> Annual Review of Biochemistry. 67, 425-479 (1998).</li><li>Chan, K. -. H., Zengerle, M., Testa, A., Ciulli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+target+warhead+and+linkage+vector+on+inducing+protein+degradation:+Comparison+of+bromodomain+and+extra-terminal+(BET)+degraders+derived+from+triazolodiazepine+(JQ1)+and+tetrahydroquinoline+(I-BET726)+BET+inhibitor+scaffolds.">Impact of target warhead and linkage vector on inducing protein degradation: Comparison of bromodomain and extra-terminal (BET) degraders derived from triazolodiazepine (JQ1) and tetrahydroquinoline (I-BET726) BET inhibitor scaffolds.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 61 (2), 504-513 (2018).</li><li>Roy, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SPR-measured+dissociation+kinetics+of+PROTAC+ternary+complexes+influence+target+degradation+rate.">SPR-measured dissociation kinetics of PROTAC ternary complexes influence target degradation rate.</a> ACS Chemical Biology. 14 (3), 361-368 (2019).</li><li>Pierce, N. W., Kleiger, G., Shan, S., Deshaies, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+sequential+polyubiquitylation+on+a+millisecond+timescale.">Detection of sequential polyubiquitylation on a millisecond timescale.</a> Nature. 462 (7273), 615-619 (2009).</li><li>Gadd, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+PROTAC+cooperative+recognition+for+selective+protein+degradation.">Structural basis of PROTAC cooperative recognition for selective protein degradation.</a> Nature Chemical Biology. 13 (5), 514-521 (2017).</li><li>Nahta, R., Castellino, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatase+magnesium-dependent+1+&#948;+(PPM1D),+serine/threonine+protein+phosphatase+and+novel+pharmacological+target+in+cancer.">Phosphatase magnesium-dependent 1 &#948; (PPM1D), serine/threonine protein phosphatase and novel pharmacological target in cancer.</a> Biochemical Pharmacology. 184, 114362 (2021).</li><li>Douglass, E. F., Miller, C. J., Sparer, G., Shapiro, H., Spiegel, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+mathematical+model+for+three-body+binding+equilibria.">A comprehensive mathematical model for three-body binding equilibria.</a> Journal of the American Chemical Society. 135 (16), 6092-6099 (2013).</li><li>Zorba, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delineating+the+role+of+cooperativity+in+the+design+of+potent+PROTACs+for+BTK.">Delineating the role of cooperativity in the design of potent PROTACs for BTK.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (31), E7285-E7292 (2018).</li><li>Fairhead, M., Howarth, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+biotinylation+of+purified+proteins+using+BirA.">Site-specific biotinylation of purified proteins using BirA.</a> Methods in Molecular Biology. 1266, 171-184 (2015).</li><li>Nowak, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+in+binding+confers+selectivity+in+ligand-induced+protein+degradation.">Plasticity in binding confers selectivity in ligand-induced protein degradation.</a> Nature Chemical Biology. 14 (7), 706-714 (2018).</li></ol>

Les auteurs n’ont pas d’intérêts financiers concurrents ou d’autres conflits d’intérêts.

La caractérisation biophysique des interactions binaires et ternaires entre les molécules PROTAC et leurs partenaires de liaison aux protéines peut fournir des informations uniques et complémentaires par rapport aux systèmes cellulaires largement utilisés. Comprendre l’affinité entre chaque ogive d’une molécule PROTAC et ses partenaires de liaison aux protéines peut aider à orienter les efforts de chimie médicinale vers l’optimisation de ces interactions. Des structures cristallines de complexes PROTAC t...

La polyubiquitination des protéines dans la cellule est un processus étroitement régulé qui implique des enzymes de la famille des ubiquitines ligases 1,2. Les enzymes terminales de la voie sont les ubiquitine ligases E3 qui attachent de manière covalente les molécules d’ubiquitine à leurs partenaires de liaison aux protéines3. La polyubiquitination de ces partenaires de liaison aux protéines les cible pour la dégradation protéolytique par le protéasome4. Ce système fait partie du processus d’homéostasie des protéines qui a été exploité thérapeutiquement pour induire la dégradation des protéines impliquées dans la maladie5. Les petites molécules qui induisent l’interaction entre les ligases de l’ubiquitine E3, telles que la ligase E3 de Von Hippel-Lindau (VHL) ou le cerveau (CRBN), sont généralement composées d’une ogive de liaison à la ligase E3 reliée par un liant flexible à une ogive qui se lie à la protéine ciblée pour la dégradation. Ces molécules hétérobifonctionnelles sont communément appelées chimères ciblant la protéolyse ou PROTACS6.
Le développement de PROTACS consiste à évaluer la capacité des molécules à induire la dégradation des protéines dans les cellules. De nombreux systèmes de dosage cellulaire ont été développés pour surveiller l’interaction induite entre la protéine cible et les composants de la ligase E3, tels que VHL ou CRBN, lors du traitement des cellules avec une molécule PROTAC. L’un de ces tests cellulaires, le système nanoluc-Halotag7, implique une ligase E3 fusionnée à l’accepteur Halotag et une protéine cible marquée avec un donneur nanoluc. La formation d’un complexe ternaire rapproche le donneur nanoluc et l’accepteur Halotag, ce qui permet le transfert d’énergie du donneur à l’accepteur, ce qui entraîne l’émission de lumière. Les variations de ce système peuvent être utilisées pour évaluer la perméabilité cellulaire des molécules PROTACS8 ou les changements dans le niveau relatif d’ubiquitination de la protéine cible9. Bien que ces systèmes cellulaires soient essentiels à l’optimisation de PROTACS, la formation de complexes entre les ligases E3 et les protéines ciblées pour la dégradation est un processus en plusieurs étapes10,11. La cinétique et la thermodynamique des interactions binaires et ternaires impliquées contribuent à l’ubiquitination de l’efficacité et à la dégradation de la protéine12,13,14 qui en résulte.
On y décrit des protocoles qui peuvent être adaptés pour la caractérisation biophysique de la formation de complexes ternaires induite par PROTACS à l’aide de la résonance plasmonique de surface (SPR), de l’interférométrie de biocouche (BLI) et de la calorimétrie de titrage isotherme (ITC). Les protocoles SPR et ITC pour la molécule MZ1 PROTAC qui induit la formation de complexes ternaires entre Brd4BD2 et VHL dérivés des rapports de littérature13,15 et décrits ici ont permis de récapituler les résultats rapportés avec quelques modifications des procédures rapportées, qui seront discutées. Une description d’un test BLI utilisé pour évaluer la formation de complexes ternaires entre MZI, Brd4BD2 et VHL est incluse dans ce rapport. Les mesures d’affinité de BLI étaient cohérentes avec celles observées dans le SPR et l’ITC. Un protocole précédemment publié dans lequel un test SPR a été développé pour évaluer la formation de complexes ternaires induite par PROTAC entre PPM1D, une protéine phosphatase Ser/Thr dont l’expression est induite de manière dépendante de p5316, et CRBN est également décrit. Dans ce cas, la molécule PROTAC a une affinité nanomolaire pour PPM1D mais seulement une affinité micromolaire pour CRBN. Dans ce cas, la liaison de la molécule PROTAC au CRBN n’est pas saturable, ce qui entraîne l'« effet crochet » couramment observé. L’effet d’hameçon est une propriété de trois systèmes corporels dans lesquels il y a deux espèces qui peuvent former un complexe hétérotrimérique lorsque les deux sont liées à une molécule de pontage (Figure 1)17. L’effet d’hameçon est observé lorsque l’espèce pontière est en concentration excessive par rapport aux deux autres espèces. L’état résultant est un état dans lequel les interactions binaires surpassent les interactions ternaires. Les systèmes où l’effet d’hameçon est observé nécessitent des considérations spécifiques sur la conception expérimentale discutées dans le présent rapport. Des concepts généraux et des exigences en réactifs pour l’évaluation de l’utilisation de tests biophysiques pour l’évaluation de la formation de complexes ternaires induite par PROTAC sont fournis.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-plate</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>655076</td>
			<td>flat-bottom, black plates used In BLI experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>73520-120</td>
			<td>Plate use for ITC sample preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>650101</td>
			<td>Plate used to prepare samples for SPR experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Auto iTC200 micro-calorimeter</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td>Instrument used to perform ITC experiments. Product discontinued.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biacore S200</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>29136649</td>
			<td>Instrument used to perform SPR experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MZ1</td>
			<td>ProbeChem</td>
			<td>PC-60099</td>
			<td>PROTAC that binds to VHL and Brd4BD2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTA sensor chip</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>BR100532</td>
			<td>SPR chip used to perform SPR experiments involving PPM1D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octet Red-384</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td></td>
			<td>Instrument used to perform BLI experiments. Product discontinued.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate cover</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>PQA0001</td>
			<td>Cover for Nunc 96-well plate (73520-120)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate cover</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>28975816</td>
			<td>Plate cover for Greiner plate (650101)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Series S SA sensor chip</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>BR100531</td>
			<td>SPR chip used to perform SPR experiments involving MZ1:VHL:BRD4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin (SA) Dip and Read Biosensors</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>18-509</td>
			<td>Coated sensors used in BLI experiments</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the development and application of biophysical assays for evaluating ternary complex formation induced by proteolysis targeting chimeras (protacs)

Les ligases E3 et les protéines ciblées pour la dégradation peuvent être induites à former des complexes par des molécules hétérobifonctionnelles dans un processus en plusieurs étapes. La cinétique et la thermodynamique des interactions impliquées contribuent à l’efficacité de l’ubiquitination et à la dégradation de la protéine qui en résulte. Les techniques biophysiques telles que la résonance plasmonique de surface (SPR), l’interférométrie des biocouches (BLI) et la calorimétrie de titrage isotherme (ITC) fournissent des informations précieuses qui peuvent être utilisées dans l’optimisation de ces interactions. À l’aide de deux systèmes modèles, une boîte à outils de dosage biophysique pour comprendre la coopérativité de la formation de complexes ternaires et l’impact de « l’effet crochet » sur la cinétique de liaison a été établie. Dans un cas, une molécule de protéolyse ciblant la chimère (PROTAC) qui induisait la formation d’un complexe ternaire entre Brd4BD2 et VHL a été évaluée. La molécule hétérobifonctionnelle, MZ1, a des affinités nM à la fois pour la protéine Brd4BD2 (SPR K D = 1 nM, ITC K D = 4 nM) et pour le complexe VHL (SPR K D = 29 nM, ITC K D = 66 nM). Pour ce système, des tests SPR, BLI et ITC robustes ont été développés qui ont reproduit les résultats publiés démontrant la coopérativité de la formation de complexes ternaires. Dans l’autre cas, une molécule induisant des complexes ternaires entre une protéine de 46,0 kDa, PPM1D, et le cerveau [CRBN (319-442)] a été étudiée. La molécule hétérobifonctionnelle, BRD-5110, a un SPR KD = 1 nM pour PPM1D mais une liaison beaucoup plus faible contre le complexe CRBN tronqué (319-442) (SPR KD= ~ 3 μM). Dans ce cas, la liaison pour le CRBN dans le SPR n’était pas saturable, ce qui a entraîné un « effet d’hameçon ». Les exigences en matière de débit et de réactifs pour le SPR, le BLI et l’ITC ont été évaluées, et des recommandations générales pour leur application aux projets PROTAC ont été fournies.

The polyubiquitination of proteins in the cell is a tightly regulated process that involves enzymes in the Ubiquitin Ligase family1,2. The terminal enzymes in the pathway are the E3 ubiquitin ligases that covalently attach ubiquitin molecules to their protein-binding partners3. The polyubiquitination of those protein binding partners targets them for proteolytic degradation by the proteasome4. This system is part of the protein homeostasis process that has been therapeutically leveraged to induce the degradation of proteins involved in disease5. Small molecules that induce the interaction between E3 ubiquitin ligases, such as Von Hippel-Lindau E3 ligase (VHL) or cereblon (CRBN), are typically composed of an E3 ligase binding warhead connected by a flexible linker to a warhead that binds to the protein being targeted for degradation. These heterobifunctional molecules are commonly referred to as proteolysis targeting chimeras or PROTACS6.
The development of PROTACS involves evaluating the ability of molecules to induce the degradation of proteins in cells. Many cellular assay systems have been developed that monitor the induced interaction between the target protein and E3 ligase components, such as VHL or CRBN, upon treatment of the cells with a PROTAC molecule. One such cellular assay, the nanoluc-Halotag system7, involves an E3 ligase fused to the Halotag acceptor and a target protein tagged with a nanoluc donor. Ternary complex formation brings the nanoluc donor and Halotag acceptor into proximity allowing the transfer of energy from the donor to the acceptor resulting in the emission of light. Variations of this system can be used to assess the cellular permeability of PROTACS molecules8 or changes in the relative level of target protein ubiquitination9. While these cellular systems are essential for driving the optimization of PROTACS, the formation of complexes between E3 ligases and proteins targeted for degradation is a multi-step process10,11. The kinetics and thermodynamics of the binary and ternary interactions involved contribute to efficiency ubiquitination and resulting degradation of the protein12,13,14.
Herein are described protocols that can be adapted for the biophysical characterization of ternary complex formation induced by PROTACS using surface plasmon resonance (SPR), biolayer interferometry (BLI), and isothermal titration calorimetry (ITC). SPR and ITC protocols for the MZ1 PROTAC molecule that induces ternary complex formation between Brd4BD2 and VHL derived from literature reports13,15 and described here were able to recapitulate the reported results with some modification of the reported procedures, which will be discussed. A description of a BLI assay used to evaluate ternary complex formation between MZI, Brd4BD2, and VHL is included in this report. Affinity measurements from BLI were consistent with those observed in SPR and ITC. A previously published protocol in which an SPR assay was developed for assessing the PROTAC-induced ternary complex formation between PPM1D, a Ser/Thr protein phosphatase whose expression is induced in a p53-dependent manner16, and CRBN is also described. In this instance, the PROTAC molecule has a nanomolar affinity for PPM1D but only a micromolar affinity for CRBN. In this case, the binding of the PROTAC molecule to CRBN is not saturable, resulting in the commonly observed &#34;hook effect&#34;. The hook effect is a property of three body systems in which there are two species that can form a heterotrimeric complex when both are bound to a bridging molecule (Figure 1)17. The hook effect is observed when the bridging species is in excess concentration relative to the two other species. The resulting state is one in which the binary interactions outcompete the ternary interactions. The systems where the hook effect is observed require specific experimental design considerations discussed in this report. General concepts and reagent requirements for evaluating the utilization of biophysical assays for the evaluation of PROTAC-induced ternary complex formation are provided.

Pleins feux sur l’auteur : Évaluation des essais biophysiques pour la caractérisation des complexes ternaires PROTACS 

le développement et l’application de tests biophysiques pour l’évaluation de la formation de complexes ternaires induite par la protéolyse ciblant les chimères (PROTACS)

Our research focuses on replicating established model systems, validating them through additional assays and adapting these methodologies to suit our specific research context. We aim to demonstrate a versatile approach that can be applied to various projects. The current experimental challenge, licensing strategically selecting the appropriate assay format and conditions based on project specific requirements and existing knowledge gaps.This is essential for achieving efficient and accurate answers in our experiments. Our protocol provides a streamlined approach for seamless adaption to various ProTech systems. Furthermore, we conduct a thorough evaluation of each method, highlighting their respective pros and cons.We offer informed instructions on choosing the most suitable format based on specific conditions.

La caractérisation du complexe binaire VHL : MZ1 et du complexe ternaire VHL : MZ1 : Brd4BD2 peut être trouvée dans la Figure 2 (ITC), la Figure 3 (BLI) et la Figure 4 (SPR) en utilisant un tampon très similaire. Le KD extrait des tests orthogonaux est cohérent. La coopérativité peut être calculée par K D (binaire) / KD (ternaire), ce qui est très positif (15 de l’ITC ou 26 de ...

Watch this Scientific Journal Video about Evaluating Biophysical Assays for Characterizing PROTACS Ternary Complexes at JoVE.com

Nous décrivons ici des protocoles pour la caractérisation biophysique de la formation de complexes ternaires induite par protéolyse ciblant les chimères (PROTACS) qui impliquent les ubiquitine ligases Von Hippel-Lindau, E3 ligase (VHL) et Cereblon (CRBN). Les méthodes biophysiques illustrées ici comprennent la résonance plasmonique de surface (SPR), l’interférométrie de biocouche (BLI) et la calorimétrie de titrage isotherme (ITC).

E3 ligases and proteins targeted for degradation can be induced to form complexes by heterobifunctional molecules in a multi-step process. The kinetics ...

Notre recherche se concentre sur la reproduction de systèmes modèles établis, leur validation par des tests supplémentaires et l’adaptation de ces méthodologies à notre contexte de recherche spécifique. Notre objectif est de démontrer une approche polyvalente qui peut être appliquée à divers projets. Le défi expérimental actuel consiste à obtenir des licences en sélectionnant stratégiquement le format et les conditions d’essai appropriés en fonction des exigences spécifiques du projet et des lacunes existantes dans les connaissances.C’est essentiel pour obtenir des réponses efficaces et précises dans nos expériences. Notre protocole offre une approche simplifiée pour une adaptation transparente aux différents systèmes ProTech. De plus, nous procédons à une évaluation approfondie de chaque méthode, en mettant en évidence leurs avantages et leurs inconvénients respectifs.Nous offrons des instructions éclairées sur le choix du format le plus approprié en fonction de conditions spécifiques.

the-development-application-biophysical-assays-for-evaluating-ternary

Research

JoVE Journal

Biochemistry

The Development and Application of Biophysical Assays for Evaluating Ternary Complex Formation Induced by Proteolysis Targeting Chimeras (PROTACS)

2.3K vues.  The Broad Institute of MIT and Harvard. Notre recherche se concentre sur la reproduction de systèmes modèles établis, leur validation par des tests supplémentaires et l’adaptation de ces méthodologies à notre contexte de recherche spécifique. Notre objectif est de démontrer une approche polyvalente qui peut être appliquée à divers projets. Le défi expérimental actuel consiste à obtenir des licences en sélectionnant stratégiquement le format et les conditions d’essai appropriés en fonction des exigences spécifi...

Vidéo: Pleins feux sur l’auteur : Évaluation des essais biophysiques pour la caractérisation des complexes ternaires PROTACS 

E3 ligases and proteins targeted for degradation can be induced to form complexes by heterobifunctional molecules in a multi-step process. The kinetics and thermodynamics of the interactions involved contribute to efficiency of ubiquitination and resulting degradation of the protein. Biophysical techniques such as surface plasmon resonance (SPR), biolayer interferometry (BLI), and isothermal titration calorimetry (ITC) provide valuable information that can be used in the optimization of those interactions. Using two model systems, a biophysical assay tool kit for understanding the cooperativity of ternary complex formation and the impact of the &#39;hook effect&#39; on binding kinetics was established. In one case, a proteolysis targeting chimera (PROTAC) molecule that induced ternary complex formation between Brd4BD2 and VHL was evaluated. The heterobifunctional molecule, MZ1, has nM affinities for both the Brd4BD2 protein (SPR KD = 1 nM, ITC KD = 4 nM) and the VHL complex (SPR KD = 29 nM, ITC KD = 66 nM). For this system, robust SPR, BLI, and ITC assays were developed that reproduced published results demonstrating the cooperativity of ternary complex formation. In the other case, a molecule that induced ternary complexes between a 46.0 kDa protein, PPM1D, and cereblon [CRBN (319-442)] was studied. The heterobifunctional molecule, BRD-5110, has an SPR KD = 1 nM for PPM1D but much weaker binding against the truncated CRBN (319-442) complex (SPR KD= ~ 3 &#181;M). In that case, the binding for CRBN in SPR was not saturable, resulting in a &#34;hook-effect&#34;. Throughput and reagent requirements for SPR, BLI, and ITC were evaluated, and general recommendations for their application to PROTAC projects were provided.

Here we describe protocols for the biophysical characterization of ternary complex formation induced by proteolysis targeting chimeras (PROTACS) that involve the ubiquitin ligases Von Hippel-Lindau E3 ligase (VHL) and Cereblon (CRBN). Biophysical methods illustrated herein include surface plasmon resonance (SPR), biolayer interferometry (BLI), and isothermal titration calorimetry (ITC).