Nos PROTACs homodimeric sont les premiers inhibiteurs chimiques de Cereblon et peuvent aider à élucider davantage le mécanisme moléculaire des analogues de thalidomide, aussi bien qu’à étudier la fonction physiologique de Cereblon. Cette nouvelle technologie de plate-forme PROTAC peut être très utile pour cibler spécifiquement les protéines d’intérêt qui sont par ailleurs considérées comme irréparables. L’inhibition de CRBN seule n’a aucune activité anti-tumorale.
Cependant, les dégradants de CRBN peuvent avoir des implications cliniques dans l’obésité, les maladies infectieuses, et d’autres désordres. La synthèse est difficile et il est difficile de trouver des liens optimaux et l’attachement pour générer des dégradants de protéines efficaces lors de la conception d’un composé PROTAC. Pour commencer, placez 2,46 grammes de L-glutamine protégée par Boc et 50 millilitres de tétrahydrofuran dans un flacon à fond rond de 100 millilitres, et remuez à 800 rpm pendant une minute.
Ensuite, ajouter 1,95 grammes de 1, 1'carbonyldiimidazole et une quantité catalytique de 4-pyridine. Continuer à remuer pendant 10 heures au reflux pour obtenir une solution incolore claire de composé glutarimide. Laissez refroidir la solution à température ambiante et retirez le solvant à l’évaporateur rotatif.
Redissolvez les résidus en 200 millilitres d’acétate d’éthylique et versez-les dans un entonnoir séparateur. Laver la couche organique avec 50 millilitres chacun d’eau déionisée et de saumure, et sécher la couche organique sur le sulfate de sodium. Gravité filtrer la solution à travers le gel de silice pour enlever le desiccant, puis rincer le gel de silice avec 200 millilitres d’acétate d’éthyle.
Retirer le solvant du filtrate sous vide pour obtenir le composé 1 comme solide incolore. Séchez le produit sous vide pendant la nuit avant de l’utiliser. Ensuite, dissoudre 0,50 grammes d’acétate de sodium dans 20 millilitres d’acide acétique glaciaire dans un flacon à fond rond de 100 millilitres équipé d’une barre de remue-glace.
Ajouter 1,25 grammes d’anhydride 3 fluorophtaliques et 1,14 grammes de glutarimide et remuer au reflux pendant six heures pour obtenir une solution violette du composé 3. Laisser refroidir le mélange à température ambiante, puis le verser dans 100 millilitres d’eau déionisée et remuer pendant 10 minutes pour précipiter le composé 3. Recueillir le solide par filtration, le laver avec de l’eau et de l’éther de pétrole, et le sécher sous vide pendant deux jours.
Ensuite, placez 0,83 gramme de composé trois et 20 millilitres de sulfure de diméthyle sec dans un flacon Schlenk de 50 millilitres et remuer pendant deux minutes. Ajouter 0,22 gramme d’alpha omega diamine linker Compound 6, et 1,05 millilitres de N, N-diisopropyléthylamine et remuer le mélange sous argon à 90 degrés Celsius pendant 18 heures pour obtenir Homodimer 8 dans un mélange vert foncé. Laisser refroidir le mélange à température ambiante et le verser dans 100 millilitres d’eau déionisée.
Extraire le produit en trois portions de 50 millilitres d’acétate d’éthyle, combiner les couches organiques et les laver avec 50 millilitres chacun d’eau et de saumure. Séchez la couche organique lavée sur le sulfate de sodium, filtrez le dessiccant et retirez le solvant sous vide. Redéfinir les résidus dans une quantité minimale de solvant chromatographie et appliquer sur une colonne de gel de silice pour la purification.
Recueillir les fractions du produit fluorescent, les combiner, et enlever le solvant pour obtenir Homodimer 8 comme un solide jaune. Pour commencer, dissoudre 2,28 grammes de Glutarimide 1 dans 25 millilitres de diméthylformamide dans un flacon rond-fond de 100 millilitres. Suspendre 2,76 grammes de carbonate de potassium moulu dans cette solution.
Puis, dessinez 0,62 millilitres d’iodométhane dans une seringue équipée d’une aiguille de calibre 20. Ajouter l’iodomethane drop-wise au cours de 10 secondes. Arrêter le flacon à l’aide d’un septum en caoutchouc et ajouter une aiguille d’évent.
Sonicate le mélange pendant deux heures à température ambiante pour obtenir glutarimide composé 2. Diluer le mélange avec 50 millilitres d’acétate d’éthyle et le verser dans un entonnoir séparateur. Rincer le flacon dans l’entonnoir avec encore 50 millilitres d’acétate d’éthyle.
Travaillez le produit et purifiez-le avec la chromatographie de colonne de gel de silice pour obtenir le Glutarimide 2 comme un solide incolore. Comparez les temps de rétention des composés glutarimides 1 et 2 pour confirmer que la méthylation N a été un succès. Pour commencer la validation, traiter les cellules myélomateuses multiples avec les composés d’intérêt.
Isoler les protéines pertinentes et préparer des échantillons pour une analyse occidentale de la dégradation des protéines. Ensuite, préparez un sandwich au gel pour SDS-PAGE et remplissez le réservoir tampon d’anodes avec une solution tris-HCl pH 8.9. Chargez les échantillons de protéines dans le gel et exécutez-le à 70 Volts pendant 20 minutes, suivis de 115 volts pendant 150 minutes.
Ensuite, préparez un tampon de transfert 1x pour l’immunoblotting et déplacez soigneusement le gel de sa cassette au tampon de transfert pour l’équilibrer. Vous devez être très prudent lorsque vous retirez le gel de la cassette pour l’équilibrage, car il peut éclater et froisser très rapidement. Plonger une membrane de difluoride polyvinylidene de 0,45 micromètre dans du méthanol pur pendant au moins 20 secondes pour l’activer, puis l’immerger dans un tampon de transfert 1x.
Laisser le gel et la membrane s’équilibrer pendant 10 minutes. Ensuite, assemblez la cassette blotting occidentale et appliquez 180 milliamperes pendant 90 minutes pour transférer les protéines à la membrane. Ensuite, visualisez les protéines en immunostaining.
Pour évaluer les effets sur la viabilité des cellules, tout d’abord, les graines 50 000 cellules myélomateuses multiples par puits d’une plaque de puits de 96 dans le triplicate biologique. Ajouter à chaque puits 100 microlitres de supports contenant du DMSO, ou un 0,1, un ou 10 micromolaires de composé 8, composé 9 ou pomalidomide. Pour effectuer l’expérience de sauvetage de viabilité cellulaire, traitez plutôt les cellules avec une solution nanomolaire de 100 du composé 8 pendant trois heures, avant ou après l’ajout d’une solution micromolaire de pomalidomide.
Incuber les cellules pendant 24, 48 ou 96 heures à 37 degrés Celsius dans une atmosphère de dioxyde de carbone de 5 %, et mesurer la viabilité cellulaire à l’essai luminescent. La structure de PROTAC 8 homodimeric a été confirmée avec proton et carbone NMR. Protac 9 heterodimérique a été synthétisé comme un contrôle négatif, comme N-méthylation dans la partie glutarimide entraîne une perte de Cereblon, ou CRBN, capacité contraignante.
L’homo PROTAC 8 induit une dégradation protéosomique presque complète du CRBN avec des effets minimes sur les facteurs de transcription lymphoïde IKZF1 et IKZF3. En revanche, l’hétéro PROTAC 9 a montré un comportement similaire aux pomalidomides. La dégradation du CRBN induite par le composé 8 pourrait être bloquée par un inhibiteur direct du protéasome, ou indirectement bloquée par l’inhibition de la nétylation.
Les cellules prétraitées avec le composé 8 ont résisté de manière significative aux effets de la pomalidomide sur IKZF1 et IKZF3. La dégradation induite par le CRBN composée 8 a eu beaucoup moins d’effet sur la viabilité des cellules du myélome multiple après 96 heures que la dégradation IKZF1 et IKZF3 du composé 9 et du pomalidomide. Les cellules multiples de myélome prétraitées avec le composé 8 ont eu sensiblement plus de viabilité une fois exposées à la pomalidomide que les cellules non traitées, suggérant que le composé 8 pourrait être employé pour imiter la résistance immunomodulatoire de drogue d’IMiD.
Nous avons constaté que le composé 8 induit la dégradation protéasomale complète du cereblon, n’a aucun effet secondaire sur la viabilité et la prolifération cellulaires d’IKZF1 et d’IKZF3. L’extension de la technologie du projet à d’autres cibles a le potentiel d’inactiver et de suivre les protéines liées au cancer et à d’autres maladies. Lors de l’adaptation de cette technique pour d’autres médicaments et protéines, il faut étudier attentivement les structures moléculaires du médicament et la cible protéique pour choisir les liens optimaux et les attachements.
Les IMiD ne fonctionneront pas chez la souris en raison d’une mutation ponctuelle dans Cereblon, mais il existe un modèle transgénique de souris knock-in qui peut être utilisé pour d’autres études sur les animaux. Comme la pomalidomide est une thalidomide analogique, qui est hautement tératogène, nous ne recommandons pas aux femmes enceintes de travailler avec ces médicaments.
