Nous sommes extrêmement reconnaissants à tous les membres du laboratoire Mao et Hu, passés et présents, pour les discussions intéressantes et les grandes contributions au projet. Nous sommes reconnaissants au Centre national de recherche clinique pour la santé de l’enfant pour son grand soutien. Cette étude a été financée par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (U20A20351 à Jianhua Mao, 82200784 à Lidan Hu), la Fondation des sciences naturelles de la province chinoise du Zhejiang (No. LQ22C070004 à Lidan Hu).

1. Maintenance des hiPSC
<ol><li>Décongélation de hiPSC<ol><li>Retirez les cellules de l’azote liquide et décongelez-les rapidement dans un bain-marie à 37 °C. Transférer les cellules de décongélation dans un tube de 15 mL préparé avec 3 mL de milieu d’entretien iPSC (Tableau des matériaux). Mélangez délicatement le médium.</li>
		<li>Centrifuger à 300 x g pendant 5 min. Retirer le surnageant et remettre délicatement les cellules en suspension dans 1 mL de milieu d’entretien iPSC avec 10 μM Y-27632 (pipeter les cellules de haut en bas 2 à 3 fois).</li>
		<li>Transférer la suspension cellulaire dans une plaque de culture tissulaire à 6 puits enduite d’un gel de matrice extracellulaire à facteur de croissance réduit (DFG) (1 :100) et de 2 mL de milieu d’entretien iPSC avec 10 μM Y-27632 ajoutés à l’avance (environ 4 x 104 cellules/cm2).</li>
		<li>Cultivez les cellules pendant 5 à 6 jours (confluence de 80 % à 90 %) à 37 °C, 5 % de CO2 et changez de milieu d’entretien iPSC tous les jours.</li>
	</ol></li>
	<li>Passage de hiPSC<ol><li>Retirez le support de maintenance iPSC de la plaque à 6 puits. Lavez les hiPSC une fois avec DPBS.</li>
		<li>Ajouter 700 à 800 μL de solution EDTA à 0,48 mM et incuber pendant 1 min à température ambiante (RT), puis retirer la solution de digestion. Poursuivre l’incubation à une température de 37 °C pendant 3 à 5 min.</li>
		<li>Lorsque les cellules sont digérées en feuilles (ne pas digérer les cellules en cellules individuelles), ajouter 1 mL de milieu d’entretien iPSC avec 10 μM Y-27632 pour mettre fin à la digestion. Pipetez soigneusement les cellules de haut en bas 2 à 3 fois.</li>
		<li>Transférez la suspension cellulaire dans une plaque de culture tissulaire à 6 puits enduite d’un gel de matrice extracellulaire à facteur de croissance réduit (DFG) (1 :100) et de 2 mL de milieu d’entretien iPSC avec 10 μM Y-27632 ajoutés à l’avance. REMARQUE : Le rapport de passage varie de 1 :6 à 1 :20 (environ 4 x 104 cellules/cm2), et la taille moyenne de l’agrégation est d’environ 50 à 200 μm.</li>
		<li>Cultivez les cellules jusqu’à ce qu’elles atteignent une confluence de 80 à 90 % (5 à 6 jours) à 37 °C, 5 % de CO2 et que le milieu d’entretien iPSC change tous les jours.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Différenciation des CSM des CSPhi, via la formation d’EB
NOTE : La méthode est dérivée de la littérature antérieure 21,22,23,24. Une vue d’ensemble de la méthode est illustrée à la figure 1. Les caractéristiques de la méthode sont résumées dans le tableau 1.
<ol><li>Préparation du médium<ol><li>Préparer le milieu de différenciation MSC en complétant le α-MEM avec 1 % (v/v) de GlutaMAX, 10 % (v/v) de FBS, 10 ng/mL de FGF2 et 5 ng/mL de TGFβ.</li>
		<li>Préparer le milieu d’entretien MSC en complétant le α-MEM avec 1 % (v/v) de GlutMAX, 10 % (v/v) de FBS et 1 ng/mL de FGF2.</li>
	</ol></li>
	<li>Préparation des hiPSC<ol><li>Cultures de lignées hiPSCs (passage au moins 2 à 3 fois après décongélation) dans un milieu d’entretien iPSC sur une plaque de culture tissulaire à 6 puits recouverte d’un gel de matrice extracellulaire à facteur de croissance réduit (DFG) (1 :100) à 37 °C, 5 % de CO2 jusqu’à une confluence de 80 % à 90 %.</li>
	</ol></li>
	<li>Jour 0 : Formation de l’EB<ol><li>Retirez le support de maintenance iPSC de la plaque à 6 puits. Lavez les hiPSC une fois avec DPBS.</li>
		<li>Ajouter 700 à 800 μL de solution EDTA à 0,48 mM et incuber pendant 1 min à RT, puis retirer la solution de digestion. Poursuivre l’incubation à une température de 37 °C pendant 3 à 5 min.</li>
		<li>Lorsque les cellules sont digérées en feuilles (ne pas digérer les cellules en cellules individuelles), ajouter 2 mL de milieu d’entretien des cellules iPS (contenant 10 μM d’inhibiteur de roche et 1 :100 de gel de matrice extracellulaire de GFR) pour mettre fin à la digestion.</li>
		<li>Transférez les cellules sur une plaque de fixation basse à 6 puits. Ensemencer les cellules dans un rapport de 2 puits de plaque de culture tissulaire pour 1 puits de plaque de fixation basse. Incuber les cellules dans un agitateur (60 tr/min) à 37 °C, 5% CO2 pendant 24 h pour former des EB sphériques.</li>
	</ol></li>
	<li>Jour 1-Jour 7 : Différenciation EB<ol><li>Transférez les EB dans le tube à centrifuger à l’aide d’une pipette Pasteur (sans détruire les EB) et laissez les EB sédimenter naturellement pendant 5 à 10 min à RT. Ensuite, retirez le surnageant.</li>
		<li>Transférez les EB sur une plaque de fixation basse à 6 puits avec 2 mL de milieu de différenciation MSC. Cultivez les EB sur l’agitateur à 37 °C, 5 % de CO2 pendant 7 jours avec un changement de milieu une fois.</li>
	</ol></li>
	<li>Jour 8-Jour 17 : Inoculation de l’EB<ol><li>Transférez les EB dans le tube à centrifuger à l’aide d’une pipette Pasteur (sans détruire les EB) et laissez les EB sédimenter naturellement pendant 5 à 10 minutes. Ensuite, retirez le surnageant.</li>
		<li>Transférez les EB dans une plaque à 6 puits enduite de gel de matrice extracellulaire DFG avec 2 mL de milieu d’entretien MSC. Culture jusqu’à 90% de confluence (~10 jours) avec changement régulier de milieu après l’adhésion cellulaire.</li>
	</ol></li>
	<li>Jour 18-Jour 27 : Maturation et expansion des CSM<ol><li>Traiter la culture dérivée de l’EB avec une solution de dissociation à 37 °C pendant 5 à 10 minutes (le temps de digestion varie en raison de la présence de différents types de cellules).</li>
		<li>Lorsqu’une partie des cellules est digérée en cellules individuelles, ajouter 2 mL de milieu d’entretien MSC pour mettre fin à la digestion et transférer la suspension cellulaire dans un tube à centrifuger. Lavez les cellules non digérées restantes une fois avec du DPBS et digérez-les à nouveau. Répétez plusieurs fois jusqu’à ce que toutes les cellules soient digérées en cellules individuelles. Centrifuger la suspension cellulaire à 250 x g pendant 5 min, puis retirer le surnageant.</li>
		<li>Semez les cellules sur une plaque de culture enrobée de gélatine (environ 2 x 105 cellules/cm2). Culture jusqu’à 90% de confluence dans un milieu d’entretien MSC avec un changement de milieu régulier. Désignez cette génération de cellules comme le passage 0 (P0) à ce stade.</li>
		<li>Afin de rendre les CSM pures et matures, continuez à faire passer les cellules deux fois dans un rapport de division de 1 :3 en environ 6 jours. La plupart des cellules présentent une morphologie semblable à celle d’un fibroblaste (fusiforme).</li>
	</ol></li>
</ol>3. Différenciation des CSM des HIPs par culture monocouche
NOTE : La méthode est dérivée de la littérature antérieure 25,26,27,28. Une vue d’ensemble de cette méthode est illustrée à la figure 1. Les caractéristiques de la méthode sont résumées dans le tableau 1.
<ol><li>Préparation du médium<ol><li>Préparez le milieu d’entretien MSC en complétant le α-MEM avec 1 % (v/v) de GlutMAX, 10 % (v/v) de FBS et 1 ng/mL de FGF2.</li>
	</ol></li>
	<li>Préparation des hiPSC<ol><li>Cultures de lignées hiPSCs (passage au moins 2 à 3 fois après décongélation) dans le milieu d’entretien iPSC sur une plaque de culture tissulaire à 6 puits recouverte d’un gel de matrice extracellulaire à facteur de croissance réduit (DFG) (1 :100) à 37 °C, 5 % de CO2 jusqu’à une confluence de 50 % à 60 %.</li>
	</ol></li>
	<li>Jour 0-Jour 13 : Différenciation par cultures monocouches directes<ol><li>Retirez le support de maintenance iPSC de la plaque à 6 puits.</li>
		<li>Ajouter directement 2 mL de milieu d’entretien MSC et de culture pendant 14 jours à 37 °C, 5 % de CO2, en changeant le milieu tous les jours.</li>
	</ol></li>
	<li>Jour 14-Jour 35 : Maturation des CSM par passage répété<ol><li>Traiter les cultures monocouches avec une solution de dissociation à 37 °C pendant 5 à 10 min (le temps de digestion varie en raison de la présence de différents types de cellules).</li>
		<li>Lorsque les cellules sont digérées en cellules individuelles, ajoutez 2 mL de milieu d’entretien MSC pour mettre fin à la digestion et transférer la suspension cellulaire dans le tube à centrifuger. Lavez les cellules non digérées restantes une fois avec du DPBS et digérez-les à nouveau. Répétez plusieurs fois jusqu’à ce que toutes les cellules soient digérées en cellules individuelles. Centrifuger la suspension cellulaire à 250 x g pendant 5 min, puis retirer le surnageant.</li>
		<li>Épépinez les cellules sur une boîte de culture enrobée de gélatine (environ 2 x 105 cellules/cm2). Culture jusqu’à 90 % de confluence dans le milieu d’entretien MSC avec un changement de milieu régulier. Désignez cette génération de cellules comme le passage 0 (P0) à ce stade.</li>
		<li>Afin de rendre le MSC pur et mature, continuez à faire passer les cellules 6 fois dans un rapport de division de 1 :3 en environ 18 jours. La plupart des cellules présentent une morphologie semblable à celle d’un fibroblaste (fusiforme).</li>
	</ol></li>
</ol>4. Analyse des antigènes de surface des CSM pilotant les hiPSC par cytométrie en flux
NOTA : Semblables aux antigènes de surface des CSM dérivées de la moelle osseuse, les CSM hiPS qui pilotent les CSM expriment CD105, CD73 et CD90, mais n’expriment pas CD45, CD3429. De plus, les hiPSC peuvent être utilisées comme cellules de contrôle négatives. L’analyse des antigènes de surface des CSM et des CSPhi pilotant les hiPSC par cytométrie en flux est présentée à la figure 2.
<ol><li>Traiter les CSM à l’origine des hiPSC avec une solution de dissociation à 37 °C pendant 2 à 3 min. Traiter les hiPSCs avec un réactif de dissociation EDTA de 0,48 mM et incuber pendant 1 min à RT, puis retirer le réactif de dissociation. Poursuivre l’incubation à une température de 37 °C pendant 3 à 5 min.</li>
	<li>Lorsque les cellules sont digérées en cellules individuelles, ajoutez un milieu (milieu d’entretien MSC aux CSM et milieu d’entretien iPSC aux CSPi) pour mettre fin à la digestion.</li>
	<li>Centrifuger la suspension cellulaire à 350 x g pendant 5 min, puis retirer le surnageant.</li>
	<li>Lavez les cellules une fois avec du DPBS froid, centrifugez à 350 x g pendant 5 min, puis retirez le surnageant.</li>
	<li>Compter et remettre en suspension les cellules dans une solution froide de FBS-DPBS (v/v) à 10 x 106 cellules/mL et distribuer 100 μL/tube de suspension cellulaire (1 x 106 cellules/tube) dans des tubes à centrifuger de 1,5 mL.</li>
	<li>Ajouter 5 μL de solution humaine bloquant les récepteurs Fc à 100 μL de suspension cellulaire. Incuber pendant 5 à 10 min à RT pour effectuer un blocage non spécifique.</li>
	<li>Centrifuger à 350 x g pendant 5 min et retirer le surnageant. Lavez les cellules deux fois avec une solution froide de FBS-DPBS (v/v) à 2 %.</li>
	<li>Remettre les cellules en suspension dans 100 μL de solution froide de FBS-DPBS (v/v) à 2 %.</li>
	<li>Ajouter 5 μL (1 test) d’anti-CD34-FITC et 5 μL (1 test) d’anti-CD45-APC à la cellule de 100 μL Suspension. Ajouter 5 μL (1 test) d’anti-CD73-APC, 5 μL (1 test) d’anti-CD90-FITC et 5 μL (1 test) d’anti-CD105-PE à un autre tube de suspension de cellules de 100 μL. Ajouter 5 μL de contrôle d’isotype d’IgG1 humain FITC, de PE d’isotype d’isotype d’IgG1 humain et d’APC de contrôle d’isotype d’IgG1 humain au troisième tube de suspension de cellules de 100 μL. Incuber pendant 15-20 min sur de la glace dans l’obscurité. Pendant ce temps, préparez les perles à coloration unique.</li>
	<li>Lavez les cellules deux fois avec une solution froide de FBS-DPBS (v/v) à 2 %.</li>
	<li>Ajouter 300 μL de solution froide de FBS-DPBS (v/v) à 2 % pour remettre les cellules en suspension et filtrer à l’aide d’un filtre à tamis à 200 mailles.</li>
	<li>Analyser les échantillons à l’aide de la cytométrie en flux. Analysez la suspension cellulaire colorée avec des anticorps de contrôle isotype et définissez la porte. Analysez ensuite la suspension cellulaire colorée avec des anticorps cibles.</li>
</ol>5. Différenciation ostéogénique des CSM conduisant les hiPSC
NOTE : Les CSM à l’origine des CSPhiPS possèdent un potentiel de différenciation ostéogénique (Figure 3A, B). Le protocole de différenciation ostéogénique est donné ci-dessous.
<ol><li>Préparer un milieu d’induction ostéogénique en complétant le α-MEM avec 10 % de FBS, 100 nM de dexaméthasone, 10 mM de bêta-glycérophosphate et 100 μM d’acide ascorbique.</li>
	<li>Semer 1 x 105 CSM dans une plaque à 48 puits enrobée de gélatine et la cultiver jusqu’à ce qu’elle soit confluente à 60 %-70 %.</li>
	<li>Retirer le milieu et ajouter 0,3 mL de milieu d’induction ostéogénique. Cultiver les cellules dans un milieu d’induction ostéogénique pendant 14 jours à 37 °C, 5% de CO2, avec changement de milieu tous les 3 jours.</li>
	<li>Retirez le liquide et lavez avec DPBS une fois.</li>
	<li>Ajouter 0,3 mL de PFA à 4 % et incuber à RT pendant 30 minutes.</li>
	<li>Retirez les PFA. Rincez les cellules avec 0,3 mL de DPBS pendant 10 min à RT et répétez 3 fois.</li>
	<li>Retirez le DPBS, ajoutez 0,2 mL de solution colorante au rouge d’alizarine et incubez pendant 30 minutes à RT.</li>
	<li>Retirez la solution de coloration, rincez les cellules avec 0,3 mL de DPBS pendant 10 min à RT et répétez 3 fois.</li>
	<li>Observer la coloration des dépôts de calcium au microscope optique.</li>
</ol>6. Différenciation adipogénique des CSM hiPSC
NOTE : Les CSM à moteur hiPSC possèdent un potentiel de différenciation adipogénique (Figure 3C, D). Le protocole de différenciation adipogénique est donné ci-dessous.
<ol><li>Préparer le milieu d’induction adipogénique en complétant le α-MEM avec 10 % de FBS, 1 μM de dexaméthasone, 1 μM d’IBMX, 10 μg/mL d’insuline et 100 μM d’indométacine. Préparer le milieu d’entretien adipogénique en complétant le α-MEM avec 10 % de FBS et 10 μg/mL d’insuline.</li>
	<li>Semez 1 x 105 CSM dans une plaque à 48 puits enrobée de gélatine et cultivez-la jusqu’à ce que la densité cellulaire atteigne 90 %.</li>
	<li>Retirer le milieu et ajouter 0,3 mL de milieu d’induction adipogénique. Poursuivre la culture des cellules en milieu d’induction adipogénique pendant 4 jours à 37 °C, 5% de CO2.</li>
	<li>Retirer le milieu et ajouter 0,3 mL de milieu d’entretien adipogénique. Poursuivre la culture des cellules dans le milieu d’entretien adipogénique pendant 3 jours à 37 °C, 5% de CO2.</li>
	<li>Répétez les étapes 6.3 et 6.4 2 à 3 fois jusqu’à la différenciation et la maturation des adipocytes.</li>
	<li>Retirez le liquide et lavez avec DPBS une fois.</li>
	<li>Ajouter 0,3 mL de PFA à 4 % et incuber à RT pendant 10 min. Retirez le PFA et rincez 2 fois avec du DPBS.</li>
	<li>Appliquez la coloration Oli Red O selon les instructions du fabricant et observez les gouttelettes lipidiques au microscope optique.</li>
</ol>7. Différenciation chondrogénique des CSM hiPSC
NOTE : Les CSM pilotant les hiPSC possèdent un potentiel de différenciation chondrogénique (Figure 3E, F). Le protocole de différenciation chondrogénique est donné ci-dessous.
<ol><li>Préparer le milieu d’induction des chondroblastes en complétant le α-MEM avec 10 % de FBS, 100 nM de dexaméthasone, 1 % d’insuline-transferrine-sélénium (ITS), 10 μM d’acide ascorbique, 1 mM de pyruvate de sodium, 50 μg/mL de proline, 0,02 nM de facteur de croissance transformant β3 (TGFβ3) et 0,5 μg/mL de protéine morphogénétique osseuse 6 (BMP-6).</li>
	<li>Prélever 2,5 x 105 CSM à moteur hiPSC et centrifuger les cellules à 150 x g pendant 5 min, puis retirer le surnageant. Suspendre les cellules dans 1 mL de α-MEM puis centrifuger à 150 x g pendant 5 min.</li>
	<li>Retirer le surnageant et suspendre les cellules dans 0,5 mL de milieu d’induction chondrogène. Centrifuger les cellules à 150 x g pendant 5 min.</li>
	<li>Dévisser directement le couvercle et la culture pendant 21 jours avec un changement de milieu d’induction chondrogénique tous les 3 jours à 37 °C, 5 % de CO2. Agitez doucement le tube de centrifugation pour suspendre les pastilles chondrogènes (sans détruire les pastilles chondrogènes) tous les jours pendant la différenciation chondrogène.</li>
	<li>Retirer le surnageant et laver deux fois avec 0,5 mL de PBS.</li>
	<li>Ajouter 0,3 mL de PFA à 4 % et fixer pendant 24 h.</li>
	<li>La paraffine incorpore les pastilles chondrogènes, puis les coupe (3 μm). Teindre les sections en bleu toluidine (1%) pendant 30 min.</li>
	<li>Observez la matrice extracellulaire des chondrocytes au microscope optique.</li>
</ol>

Caractérisation des antigènes de surface et de la capacité de prolifération dans les CSM pilotant les hiPSC

<ol>
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C., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell+technology:+a+decade+of+progress.">Induced pluripotent stem cell technology: a decade of progress.</a> Nature Reviews. Drug Discovery. 16 (2), 115-130 (2017).</li><li>Levy, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shattering+barriers+toward+clinically+meaningful+MSC+therapies.">Shattering barriers toward clinically meaningful MSC therapies.</a> Science Advances. 6 (30), eaba6884 (2020).</li><li>Zhao, C., Ikeya, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+applications+of+induced+pluripotent+stem+cell-derived+mesenchymal+stem+cells.">Generation and applications of induced pluripotent stem cell-derived mesenchymal stem cells.</a> Stem Cells International. 2018, 9601623 (2018).</li><li>Path, G., Perakakis, N., Mantzoros, C. S., Seufert, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+in+the+treatment+of+diabetes+mellitus+-+Focus+on+mesenchymal+stem+cells.">Stem cells in the treatment of diabetes mellitus - Focus on mesenchymal stem cells.</a> Metabolism. 90, 1-15 (2019).</li><li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+derivation+of+functional+mesenchymal+stem+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">One-step derivation of functional mesenchymal stem cells from human pluripotent stem cells.</a> Bio-Protocol. 8 (22), e3080 (2018).</li><li>Hua, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-intensity+pulsed+ultrasound+promotes+osteogenic+potential+of+iPSC-derived+MSCs+but+fails+to+simplify+the+iPSC-EB-MSC+differentiation+process.">Low-intensity pulsed ultrasound promotes osteogenic potential of iPSC-derived MSCs but fails to simplify the iPSC-EB-MSC differentiation process.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 10, 841778 (2022).</li><li>Dupuis, V., Oltra, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+to+produce+induced+pluripotent+stem+cell-derived+mesenchymal+stem+cells:+Mesenchymal+stem+cells+from+induced+pluripotent+stem+cells.">Methods to produce induced pluripotent stem cell-derived mesenchymal stem cells: Mesenchymal stem cells from induced pluripotent stem cells.</a> World Journal of Stem Cells. 13 (8), 1094-1111 (2021).</li><li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+stem+cells.+A+Werner+syndrome+stem+cell+model+unveils+heterochromatin+alterations+as+a+driver+of+human+aging.">Aging stem cells. A Werner syndrome stem cell model unveils heterochromatin alterations as a driver of human aging.</a> Science. 348 (6239), 1160-1163 (2015).</li><li>Liu, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+Fanconi+anemia+pathogenesis+and+therapeutics+using+integration-free+patient-derived+iPSCs.">Modelling Fanconi anemia pathogenesis and therapeutics using integration-free patient-derived iPSCs.</a> Nature Communications. 5, 4330 (2014).</li><li>Kubben, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repression+of+the+antioxidant+NRF2+pathway+in+premature+aging.">Repression of the antioxidant NRF2 pathway in premature aging.</a> Cell. 165 (6), 1361-1374 (2016).</li><li>Duan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PTEN+deficiency+reprogrammes+human+neural+stem+cells+towards+a+glioblastoma+stem+cell-like+phenotype.">PTEN deficiency reprogrammes human neural stem cells towards a glioblastoma stem cell-like phenotype.</a> Nature Communications. 6, 10068 (2015).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+released+from+human+induced+pluripotent+stem+cells-derived+MSCs+facilitate+cutaneous+wound+healing+by+promoting+collagen+synthesis+and+angiogenesis.">Exosomes released from human induced pluripotent stem cells-derived MSCs facilitate cutaneous wound healing by promoting collagen synthesis and angiogenesis.</a> Journal of Translational Medicine. 13, 49 (2015).</li><li>Hu, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+secreted+by+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+mesenchymal+stem+cells+attenuate+limb+ischemia+by+promoting+angiogenesis+in+mice.">Exosomes secreted by human-induced pluripotent stem cell-derived mesenchymal stem cells attenuate limb ischemia by promoting angiogenesis in mice.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 6 (1), 10 (2015).</li><li>Kang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+retain+adequate+osteogenicity+and+chondrogenicity+but+less+adipogenicity.">Mesenchymal stem cells derived from human induced pluripotent stem cells retain adequate osteogenicity and chondrogenicity but less adipogenicity.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 6 (1), 144 (2015).</li><li>Wang, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+mesenchymal+stem+cells+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+results+in+downregulation+of+c-Myc+and+DNA+replication+pathways+with+immunomodulation+toward+CD4+and+CD8+cells.">Differentiation of mesenchymal stem cells from human induced pluripotent stem cells results in downregulation of c-Myc and DNA replication pathways with immunomodulation toward CD4 and CD8 cells.</a> Stem Cells. 36 (6), 903-914 (2018).</li><li>Dominici, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+criteria+for+defining+multipotent+mesenchymal+stromal+cells.+The+International+Society+for+Cellular+Therapy+position+statement.">Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement.</a> Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).</li><li>Kim, S., Kim, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+mesenchymal+stem-like+cells+for+producing+extracellular+vesicles.">Generation of mesenchymal stem-like cells for producing extracellular vesicles.</a> World Journal of Stem Cells. 11 (5), 270-280 (2019).</li></ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Dans ce protocole, deux méthodes représentatives de différenciation des hiPSC en CSM ont été examinées 20,21,22,23,24,25,26,27,28,30. Les deux méthodes étaient capables de dérive...

Les cellules stromales mésenchymateuses (CSM) sont des cellules souches pluripotentes adultes dérivées du mésoderme1. Les CSM sont présentes dans presque tous les tissus conjonctifs2. Depuis que les CSM ont été découvertes pour la première fois dans les années 1970 et isolées avec succès de la moelle osseuse en 1987 par Friedenstein et al.3,4,5, une variété de tissus somatiques humains (y compris le fœtus et l’adulte) ont été utilisés pour isoler les CSM telles que les os, le cartilage, les tendons, les muscles, le tissu adipeux et le stroma de soutien hématopoïétique 1,2,6,7 . Les CSM présentent des capacités prolifératives et une plasticité élevées pour se différencier en de nombreuses lignées cellulaires somatiques et pourraient migrer vers les tissus lésés et enflammés 2,8,9. Ces propriétés font des CSM un candidat potentiel pour la médecine régénérative10. Cependant, les CSM dérivées de tissus somatiques (CSM-ST) sont limitées par un don limité, une capacité de prolifération cellulaire limitée, des variations de qualité et des préoccupations en matière de biosécurité liées à la transmission possible d’agents pathogènes, le cas échéant, par les donneurs11,12.
Les cellules souches pluripotentes induites humaines (hiPSC) sont dérivées de la reprogrammation de cellules adultes avec des facteurs de transcription (Oct4, Sox2, Klf4 et c-Myc), qui ont des fonctions similaires à celles des cellules souches embryonnaires13,14. Ils peuvent s’auto-renouveler et possèdent le potentiel de se différencier en n’importe quel type de cellules somatiques, y compris les CSM. Par rapport aux CSM-ST, les CSM-iPS présentent l’avantage d’un approvisionnement illimité, d’un coût inférieur, d’une pureté plus élevée, d’une commodité dans le contrôle de la qualité, d’une production à grande échelle et d’une modification génique facile 15,16,17.
En raison de ces avantages des CSM-iPS, diverses méthodes de pilotage des CSM à partir des CSPi ont été rapportées. Ces méthodes de différenciation ont été centrées autour de deux méthodologies de culture : (1) la formation de corps embryoïdes (EB) et (2) l’utilisation de cultures monocouches 11,18,19,20. Une approche représentative pour chacune des deux méthodologies a été caractérisée. De plus, des comparaisons entre deux approches représentatives basées sur le temps, le coût, la capacité de prolifération, l’expression des biomarqueurs MSC et la capacité de différenciation in vitro ont également été effectuées.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alizarin red staining kit</td>
			<td>Beyotime&#160;Biotechnology</td>
			<td>C0148S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human-CD105 (PE)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>323206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human-CD34 (FITC)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>343503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human-CD45 (APC)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>304011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human-CD73( APC)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>344006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human-CD90 (FITC)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>328108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>A8100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMP-6</td>
			<td>Novoprotein</td>
			<td>C012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon dioxide level shaker</td>
			<td>Crystal</td>
			<td>CO-06UC6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compensation Beads</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>424601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoStor CS10</td>
			<td>STEMCELL Technology</td>
			<td>07959</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Beyotime&#160;Biotechnology</td>
			<td>ST1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12&#160; medium</td>
			<td>Servicebio</td>
			<td>G4610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>HAKATA</td>
			<td>HS-FBS-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF2</td>
			<td>Stemcell</td>
			<td>78003.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G2500-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>human IgG1 isotype control APC</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>403505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>human IgG1 isotype control FITC</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>403507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>human IgG1 isotype control PE</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>403503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human TGF-&#946;1</td>
			<td>Stemcell</td>
			<td>78067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human TruStain FcX&#160;</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>422301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IBMX</td>
			<td>Beyotime&#160;Biotechnology</td>
			<td>ST1398</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indomethacin</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>SI9020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Beyotime&#160;Biotechnology</td>
			<td>P3376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iPSC maintenance medium</td>
			<td>STEMCELL Technology</td>
			<td>85850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITS Media Supplement</td>
			<td>Beyotime&#160;Biotechnology</td>
			<td>C0341-10mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel, growth factor reduced</td>
			<td>BD Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oli Red O staining kit</td>
			<td>Beyotime&#160;Biotechnology</td>
			<td>C0158S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proline</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P0011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGF&#946;3</td>
			<td>Novoprotein</td>
			<td>CJ44</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluidine blue staining kit</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G2543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express Enzyme(1x)&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12604013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Low Attachment 6 Well Plate</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Versene</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15040-66</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Stemcell</td>
			<td>72304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-MEM</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-glycerophosphate</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G8100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

comparison of two representative methods for differentiation of human induced pluripotent stem cells into mesenchymal stromal cells

Les cellules stromales mésenchymateuses (CSM) sont des cellules souches pluripotentes adultes qui ont été largement utilisées en médecine régénérative. Étant donné que les CSM dérivées de tissus somatiques sont limitées par des dons limités, des variations de qualité et la biosécurité, les 10 dernières années ont vu une forte augmentation des efforts visant à générer des CSM à partir de cellules souches pluripotentes induites humaines (CSPhi). Les efforts passés et récents visant à différencier les hiPSC en CSM ont été centrés sur deux méthodologies de culture : (1) la formation de corps embryoïdes (EB) et (2) l’utilisation de la culture monocouche. Ce protocole décrit ces deux méthodes représentatives pour dériver les CSM à partir des hiPSC. Chaque méthode présente ses avantages et ses inconvénients, notamment le temps, le coût, la capacité de prolifération cellulaire, l’expression des marqueurs MSC et leur capacité de différenciation in vitro. Ce protocole démontre que les deux méthodes peuvent dériver des CSM matures et fonctionnelles à partir de CSPhi. La méthode monocouche se caractérise par un coût inférieur, un fonctionnement plus simple et une différenciation ostéogénique plus facile, tandis que la méthode EB se caractérise par une consommation de temps plus faible.

Mesenchymal stromal cells (MSCs) are mesoderm-derived adult pluripotent stem cells1. MSCs are present in almost all connective tissues2. Since MSCs were first discovered in the 1970s and successfully isolated from bone marrow in 1987 by Friedenstein et al.3,4,5, a variety of human somatic (including fetal and adult) tissues have been used for isolating MSCs such as bone, cartilage, tendon, muscle, adipose tissue, and hematopoietic-supporting stroma1,2,6,7. MSCs demonstrate high proliferative capabilities and plasticity to differentiate into many somatic cell lineages and could migrate to injured and inflamed tissues2,8,9. These properties make MSCs a potential candidate for regenerative medicine10. However, somatic tissue-derived MSCs (st-MSCs) are restricted by limited donation, limited cell proliferative capacity, quality variations, and biosafety concern for possible transmission of pathogens, if any, from the donors11,12.
Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) are derived from adult cells reprogramming with transcription factors (Oct4, Sox2, Klf4, and c-Myc), which have similar functions as embryonic stem cells13,14. They can self-renew and possess the potential of differentiating into any type of somatic cells, including MSCs. Compared with st-MSCs, iPSC-MSCs has the advantage of unlimited supply, lower cost, higher purity, convenience in quality control, easy for scale production and gene modification15,16,17.
Due to these advantages of iPSC-MSCs, a variety of methods driving MSC from iPSC have been reported. These differentiation methods have been centered around two culture methodologies: (1) the formation of embryoid bodies (EBs) and (2) the use of monolayer cultures11,18,19,20. Herein, a representative approach for each of the two methodologies was characterized. Furthermore, comparisons between two representative approaches based on time, cost, proliferative ability, expression of MSC biomarkers, and differentiation capability in vitro were also accessed.

Pleins feux sur l’auteur : Progrès dans la recherche sur les iPSC et les maladies génétiques 

Comparaison de deux méthodes représentatives pour la différenciation des cellules souches pluripotentes induites humaines en cellules stromales mésenchymateuses

The scope of our study is a mechanism, and a therapeutic strategy research of genetic disease. Our research is based on multilevel disease models, such as cell lines, iPSCs, organoids, and mice. iPSCs have a distinct advantage over other models.iPSCs from patients, and any subsequent derived cells and organoids share the same genome with the patients, which provides a bank of patient cells and models for many disease. Also, with the methods of established iPSCs from patients are quite mature. Many challenges remain in the direction of differentiating of iPSCs into specific cells and organoids, with a deepening understanding of development mechanisms in current development will occur in the field.

Suivant le protocole (Figure 1A), les hiPSC ont été différenciées en CSM par les méthodes de formation d’EB et de culture monocouche. Au cours de la différenciation, les cellules ont montré différentes morphologies représentatives (Figure 1B,C).
Comme le montre la figure 1B, les colonies de hiPSCs présentent une morphologie compacte typique avant la différenciation avec une b...

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Ce protocole décrit et compare deux méthodes représentatives pour différencier les hiPSCs en cellules stromales mésenchymateuses (CSM). La méthode monocouche se caractérise par un coût inférieur, un fonctionnement plus simple et une différenciation ostéogénique plus facile. La méthode des corps embryoïdes (EBs) se caractérise par une consommation de temps plus faible.

Mesenchymal stromal cells (MSCs) are adult pluripotent stem cells which have been widely used in regenerative medicine. As somatic tissue-derived MSCs are ...

Le champ d’application de notre étude est un mécanisme, et une stratégie thérapeutique de recherche sur les maladies génétiques. Notre recherche est basée sur des modèles de maladies à plusieurs niveaux, tels que les lignées cellulaires, les cellules iPS, les organoïdes et les souris. Les cellules iPS présentent un net avantage par rapport aux autres modèles.Les cellules iPS des patients, ainsi que toutes les cellules et organoïdes dérivés ultérieurs, partagent le même génome avec les patients, ce qui fournit une banque de cellules de patients et de modèles pour de nombreuses maladies. De plus, les méthodes d’iPSC établies des patients sont assez matures. De nombreux défis restent à relever dans le sens de la différenciation des cellules iPS en cellules et organoïdes spécifiques, avec une compréhension approfondie des mécanismes de développement dans le développement actuel qui se produira sur le terrain.

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Research

JoVE Journal

Biology

Comparison of Two Representative Methods for Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells into Mesenchymal Stromal Cells

769 vues.  The Children's Hospital, Zhejiang University School of Medicine. Le champ d’application de notre étude est un mécanisme, et une stratégie thérapeutique de recherche sur les maladies génétiques. Notre recherche est basée sur des modèles de maladies à plusieurs niveaux, tels que les lignées cellulaires, les cellules iPS, les organoïdes et les souris. Les cellules iPS présentent un net avantage par rapport aux autres modèles.Les cellules iPS des patients, ainsi que toutes les cellules et organoïdes dérivés ultérieurs, partagent le m?...

Vidéo: Pleins feux sur l’auteur : Progrès dans la recherche sur les iPSC et les maladies génétiques 

Mesenchymal stromal cells (MSCs) are adult pluripotent stem cells which have been widely used in regenerative medicine. As somatic tissue-derived MSCs are restricted by limited donation, quality variations, and biosafety, the past 10 years have seen a great rise in efforts to generate MSCs from human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). Past and recent efforts in the differentiation of hiPSCs into MSCs have been centered around two culture methodologies: (1) the formation of embryoid bodies (EBs) and (2) the use of monolayer culture. This protocol describes these two representative methods in deriving MSC from hiPSCs. Each method presents its advantages and disadvantages, including time, cost, cell proliferation ability, the expression of MSC markers, and their capability of differentiation in vitro. This protocol demonstrates that both methods can derive mature and functional MSCs from hiPSCs. The monolayer method is characterized by lower cost, simpler operation, and easier osteogenic differentiation, while the EB method is characterized by lower time consumption.

This protocol describes and compares two representative methods for differentiating hiPSCs into mesenchymal stromal cells (MSCs). The monolayer method is characterized by lower cost, simpler operation, and easier osteogenic differentiation. The embryoid bodies (EBs) method is characterized by lower time consumption.

Recherche

Biologie

MSCs Differentiation from hiPSCs via EB Formation and Monolayer Culture

To begin, culture hiPSCs in IPSC maintenance medium on a six-well tissue culture plate coated with growth factor reduced extracellular matrix gel. When the cells attain 80 to 90%v, remove the medium from the plate and wash the cells once with DPBS. Then add 700 to 800 microliters of 0.48 millimolar EDTA and incubate for one minute at room temperature.Remove the digestion solution and incubate the plate at 37 degrees Celsius for three to five minutes. When cells are digested into sheets, add two milliliters of IPSCs maintenance medium to terminate digestion. Transfer the cell suspension to a six-well low attachment plate.Incubate the cells at 37 degrees Celsius with 5%carbon dioxide and 60 RPM to form spherical embryo bodies or EBs. After 24 hours, using a past pipette, transfer the EBs to the centrifuge tube and allow it to sediment for five to 10 minutes before removing the supernatant. Add MSC differentiation medium to the tube and transfer the EBs to a six-well low attachment blade with two milliliters of MSCs differentiation medium.Culture the EBs on the shaker at 37 degrees Celsius with 5%carbon dioxide for seven days. On the eighth day, transfer the EBs to the centrifuge tube as demonstrated previously. Once the EBs are sedimented, remove the supernatant from the tube.Add MSC maintenance medium into the tube and transfer the EBs to a growth factor reduced extracellular matrix gel coated six-well plate with two milliliters of MSC maintenance medium. After cell adhesion, change the medium until the culture attains 90%confluency. Next, treat the EB derived culture with a dissociation solution at 37 degrees Celsius.When part of the cells are digested into single cells, add two milliliters of the MSC maintenance medium to terminate digestion and transfer the cell suspension to a centrifuge tube. Wash the remaining undigested cells from the wells once with DPBS. And digest again as demonstrated previously.Then centrifuge the cell suspension at 250g for five minutes. Remove the supernatant and seed the cells in a gelatin coated culture plate. Culture the cells in MSC maintenance medium to 90%confluency with regular medium change.Culture hiIPCs lines as demonstrated previously. When the cells attain 50 to 60%confluency, remove the IPSC maintenance medium from the plate. Add two milliliters of MSC maintenance medium.And culture for 14 days at 37 degrees Celsius and 5%carbon dioxide with daily medium change. For the maturation of MSCs, treat the monolayer culture with a dissociation solution at 37 degrees Celsius. When part of the cells are digested into single cells, add two milliliters of the MSC maintenance medium into the wells to terminate digestion and transfer the cell suspension to a centrifuge tube.Wash the remaining undigested cells once with DPBS and digest them as demonstrated previously. Then centrifuge the cell suspension as demonstrated previously and seed the cells on a gelatin coated culture dish. Culture the cells in MSC maintenance medium to 90%confluency with regular medium change.In the EB formation method, hiIPCs colonies exhibited a compact morphology before differentiation. After dissociation, uniform spherical EBs formed, which drew in volume over time. Subsequently, EBs transformed into adherent monolayer cells achieving 90%confluency by day 18 and acquiring a spindle shape morphology after two passages.Similarly, in the monolayer method, cells proliferated forming multilayer adherent cells. After packaging multiple times, cells matured into MSC with a typical spindle shape and swirling colony. Flow cytometry analysis revealed that hiIPCs were positive for CD90 and negative for CD34, CD45, CD105, and CD73.After differentiation, the hiIPCs driving MSCs expressed CD90, CD73, and CD105, while remaining negative for CD34 and CD45. Monolayer derived MSCs showed higher calcium deposit formation than the EB method. However, no significant differences were observed in adipogenic and chondrogenic differentiation abilities.The proliferation abilities of both methods were maintained for up to 20 passages.