Ce travail est soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (82060341,81560304) et par le projet de recherche scientifique de la plate-forme d’innovation académicienne de la province de Hainan (YSPTZX202134).

Cette étude a été approuvée par le comité d’éthique de l’Université de médecine de Hainan. Les échantillons de tissus utilisés dans cette étude ne sont pas considérés comme des études impliquant des sujets humains. Ces spécimens ont été obtenus à des fins de diagnostic de médecine légale, et le reste a été utilisé pour l’extraction de l’ADN des diatomées dans cette expérience. Les chercheurs ne peuvent pas facilement identifier les personnes pour obtenir le consentement éclairé des parties prenantes concernées.
REMARQUE : Pour assurer l’applicabilité générale de la méthode de recherche rapportée dans cette expérience, cette expérience a essentiellement suivi les instructions d’utilisation de la trousse utilisée, et seules certaines étapes ont été modifiées. Les échantillons d’eau utilisés dans cette expérience ont été prélevés au hasard dans des étangs situés à proximité du laboratoire (figure supplémentaire 1A). Dans cette expérience, il a été confirmé que le tissu pulmonaire du corps noyé était le tissu de recherche pour démontrer le protocole d’extraction (figure supplémentaire 1B). Dans la pratique médico-légale, il est parfois nécessaire d’utiliser d’autres organes et tissus de corps noyés (tels que le foie, la rate, les reins, la moelle osseuse, etc.) pour extraire l’ADN des diatomées, ce qui nécessite des améliorations mineures correspondantes de cette méthode expérimentale, qui seront expliquées dans la section correspondante de l’expérience. Les échantillons de tissus pulmonaires utilisés dans cette expérience provenaient de cadavres qui étaient clairement noyés dans des cas médico-légaux. Des tests morphologiques ont été effectués pour prouver que le tissu pulmonaire contient des diatomées (figure supplémentaire 2).
1. Prétraitement des échantillons
<ol><li>Prétraitement des échantillons d’eau<ol><li>Prélever 10 mL d’échantillon d’eau dans le tube à centrifuger et centrifuger à 13 400 x g pendant 5 min. Jeter délicatement 9,8 mL de surnageant à l’aide d’un pistolet à pipette et transférer environ 200 μL d’échantillon d’eau de diatomée enrichie restant au fond dans un tube à centrifuger de 2 mL. REMARQUE : Une expérience préliminaire peut être effectuée en premier, et la quantité initiale peut être augmentée si un échantillon d’eau de 10 ml n’est pas suffisant pour l’enrichissement.</li>
	</ol></li>
	<li>Prétraitement d’échantillons de tissus<ol><li>Prélevez 0,5 g de tissu de bord pulmonaire du corps noyé, hachez ou broyez complètement le tissu pulmonaire jusqu’à ce qu’il devienne boueux. La prévention de la contamination des diatomées exogènes est au cœur de cette étape. Coupez le tissu en morceaux à plusieurs reprises à l’aide de ciseaux.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Extraction de l’ADN
REMARQUE : Toutes les étapes de centrifugation sont effectuées à température ambiante. Utilisation d’une centrifugeuse de bureau avec une force centrifuge de 14 500 x g ; un bain-marie (ou bain métallique) préchauffé à 70 °C doit être préparé avant le début de l’expérience. Toutes les étapes doivent suivre strictement les principes d’un fonctionnement aseptique.
<ol><li>Assemblage d’échantillons d’eau et de tissus REMARQUE : La méthode d’extraction de l’ADN des diatomées de l’échantillon d’eau et des tissus est la même.<ol><li>Ajouter les billes de verre dans un tube à centrifuger de 2 mL contenant l’échantillon d’eau prétraitée. Inversez 10x-15x pour bien mélanger. Les billes de verre ajoutées sont composées de grosses et de petites billes de verre mélangées dans un rapport de masse de 1 :1. Le diamètre des grosses perles de verre est de 1,5 à 2,0 mm et celui des petites perles de verre est de 0,4 à 0,6 mm.</li>
		<li>Prenez 0,5 g de tissu finement haché, ajoutez des billes de verre dans un tube à centrifuger de 2 ml contenant le tissu comme décrit ci-dessus. Inversez 10x-15x pour mélanger.</li>
	</ol></li>
	<li>Ajouter 40 μL de protéinase K (20 mg/mL) dans les tubes. Placez à température ambiante pendant 15 min, pendant cette période, inversez et mélangez 10x toutes les 3 min. REMARQUE : Si le tissu n’est pas complètement digéré, la quantité de protéinase K peut être augmentée de manière appropriée jusqu’à ce que la solution devienne claire.</li>
	<li>Ajouter 200 μL de tampon de liaison dans les tubes à centrifuger, immédiatement vortex, et mélanger pendant 4 min (fréquence de mélange d’oscillation : 3000 tr/min). REMARQUE : Dans cette étape, l’intensité et le temps d’agitation doivent être strictement contrôlés pour assurer une intensité et un temps de mélange suffisants.</li>
	<li>Mettez les tubes à centrifuger dans un bain-marie à 70 °C pendant 10 min et la solution devient claire.</li>
	<li>Ajouter 100 μL d’isopropanol dans les tubes à centrifuger, vortex et mélanger pendant 15 s, une précipitation floculante peut apparaître à ce moment-là. REMARQUE : Il est très important de bien mélanger avec une force appropriée dans les étapes d’opération ci-dessus, mais une agitation vigoureuse doit être évitée pour éviter le cisaillement de l’ADN.</li>
	<li>Mettez la solution obtenue à l’étape précédente avec le précipité floculant dans la colonne d’adsorption (la colonne d’adsorption est placée dans le tube de collecte). La longueur de la colonne d’adsorption est de 3,0 cm, le diamètre est de 1,0 cm et la matrice d’adsorption est une membrane à matrice de silicium.</li>
	<li>Centrifuger à 8 000 x g pendant 30 s, jeter le liquide usé dans le tube de collecte et remettre la colonne d’adsorption dans le tube de collecte.</li>
	<li>Ajouter 500 μL de tampon d’élimination de l’inhibiteur dans la colonne d’adsorption. Centrifuger à 13 400 x g pendant 30 s et jeter le liquide usé dans le tube de collecte.</li>
	<li>Ajouter 700 μL de tampon de lavage dans la colonne d’adsorption. Centrifuger à 13 400 x g pendant 30 s et jeter le liquide usé dans le tube de collecte. REMARQUE : Ajoutez la quantité spécifiée d’éthanol absolu dans la bouteille tampon de lavage avant la première utilisation.</li>
	<li>Ajouter 500 μL de tampon de lavage dans la colonne d’adsorption. Centrifuger à 13 400 x g pendant 30 s et jeter le liquide usé dans le tube de collecte.</li>
	<li>Remettez la colonne d’adsorption dans le tube de collecte vide. Centrifuger à 14 500 x g pendant 2 min et retirer autant que possible le tampon de lavage pour éviter que l’éthanol résiduel contenu dans le tampon de lavage n’inhibe les réactions en aval.</li>
	<li>Retirez la colonne d’adsorption et placez-la dans un tube de centrifugation propre. Ajouter 100 μL de tampon d’élution dans la partie centrale de la membrane d’adsorption.</li>
	<li>Placez la colonne d’adsorption à température ambiante pendant 3 à 5 minutes et centrifugez à 13 400 x g pendant 1 minute.</li>
	<li>Ajouter à nouveau la solution obtenue à l’étape précédente dans la colonne d’adsorption centrifuge. Placez la colonne d’adsorption centrifuge à température ambiante pendant 2 min et la centrifugeuse à 13 400 x g pendant 1 min. REMARQUE : Le tampon d’élution doit être préchauffé dans un bain-marie à 70 °C pendant environ 10 minutes. Le volume d’élution ne doit pas être inférieur à 50 μL ; sinon, le rendement en ADN sera réduit.</li>
	<li>Conservez l’ADN de la diatomée extrait à une température comprise entre 2 et 8 °C pour une utilisation ultérieure. Si la solution d’ADN doit être conservée pendant une longue période, conservez-la à -20 °C.</li>
</ol>3. Test PCR
REMARQUE : Étant donné que la teneur en diatomées dans les échantillons médico-légaux est souvent faible, les extraits d’échantillons de tissus des corps noyés peuvent également contenir divers degrés de tissus et d’organes (tels que les poumons dans cette expérience) avec leur propre ADN. Par conséquent, la détection directe de l’ADN total dans les extraits d’ADN ne reflète pas la situation de l’extraction de l’ADN des diatomées. Dans cette expérience, des amorces spécifiques aux diatomées ont été sélectionnées et des produits de PCR ont été utilisés pour évaluer l’extraction de l’ADN des diatomées dans l’extrait. Les produits peuvent être observés et analysés par électrophorèse sur gel d’agarose et peuvent également être analysés par une courbe de fusion PCR quantitative fluorescente en temps réel, qui a une sensibilité plus élevée.
<ol><li>Ajouter 2 μL de l’ADN extrait d’échantillons d’eau et de tissus comme modèle. Choisissez l’une des deux méthodes d’inspection suivantes.</li>
	<li>Test PCR conventionnel<ol><li>Utilisez des amorces22 qui peuvent amplifier spécifiquement les fragments d’ADNr de la diatomée 18S. Pour plus de détails, voir le tableau 1.</li>
		<li>Etablir le système de réaction PCR et les conditions d’amplification en fonction des caractéristiques des amorces. Pour plus de détails, voir le tableau 2.</li>
		<li>Exécuter les produits d’amplification PCR sur du gel d’agarose à 2%. Observez et analysez l’imagerie à l’aide d’un imageur à gel.</li>
	</ol></li>
	<li>Test PCR quantitatif fluorescent<ol><li>Utilisez les amorces ci-dessus qui peuvent amplifier spécifiquement les fragments d’ADNr de la diatomée 18S pour préparer un système de réaction PCR quantitative fluorescente en temps réel. Pour plus de détails, voir le tableau 3.</li>
		<li>Effectuer l’amplification PCR et analyser la courbe d’amplification obtenue et les valeurs Ct. Dans le même temps, définissez un programme, faites fondre progressivement les doubles brins des produits amplifiés en monobrins grâce à la technologie de courbe de fusion PCR quantitative fluorescente, puis analysez les courbes de fusion obtenues.</li>
	</ol></li>
</ol>

Extraction économique de l’ADN de diatomées à l’aide d’un kit modifié

<ol>
	<li>Liu, C., Cong, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+and+prospect+of+diagnosis+of+drowning+deaths+in+water.">Review and prospect of diagnosis of drowning deaths in water.</a> Fa Yi Xue Za Zhi. 38 (1), 3-13 (2022).</li><li>Frisoni, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forensic+diagnosis+of+freshwater+or+saltwater+drowning+using+the+marker+aquaporin+5:+An+immunohistochemical+study.">Forensic diagnosis of freshwater or saltwater drowning using the marker aquaporin 5: An immunohistochemical study.</a> Medicina (Kaunas). 58 (10), 1458 (2022).</li><li>Mann, D. G., Vanormelingen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+inordinate+fondness?+The+number,+distributions,+and+origins+of+diatom+species.">An inordinate fondness? The number, distributions, and origins of diatom species.</a> J Eukaryot Microbiol. 60 (4), 414-420 (2013).</li><li>Pfister, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Terrestrial+diatoms+as+tracers+in+catchment+hydrology:+a+review.">Terrestrial diatoms as tracers in catchment hydrology: a review.</a> WIREs Water. 4, 1241 (2017).</li><li>Yu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+automated+diatom+detection+method+based+on+YOLOv5+framework+and+its+preliminary+study+for+taxonomy+recognition+in+the+forensic+diatom+test.">An improved automated diatom detection method based on YOLOv5 framework and its preliminary study for taxonomy recognition in the forensic diatom test.</a> Front Microbiol. 13, 963059 (2022).</li><li>Zhang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+length+and+width+of+diatoms+in+drowning+cases+as+the+evidence+of+diatoms+penetrating+the+alveoli-capillary+barrier.">The length and width of diatoms in drowning cases as the evidence of diatoms penetrating the alveoli-capillary barrier.</a> Int J Legal Med. 134 (3), 1037-1042 (2020).</li><li>Kihara, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+water+injection+into+lungs+using+an+animal+model:+Verification+of+the+diatom+concentration+test+to+diagnose+drowning.">Experimental water injection into lungs using an animal model: Verification of the diatom concentration test to diagnose drowning.</a> Forensic Sci Int. 327, 110983 (2021).</li><li>Shen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+false-positive+results+of+diatom+test+in+the+diagnosis+of+drowning-would+not+be+an+impediment.">Analysis of false-positive results of diatom test in the diagnosis of drowning-would not be an impediment.</a> Int J Legal Med. 133 (6), 1819-1824 (2019).</li><li>Manoylov, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taxonomic+identification+of+algae+(morphological+and+molecular):+species+concepts,+methodologies,+and+their+implications+for+ecological+bioassessment.">Taxonomic identification of algae (morphological and molecular): species concepts, methodologies, and their implications for ecological bioassessment.</a> J Phycol. 50 (3), 409-424 (2014).</li><li>Uchiyama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+molecular+approach+to+help+conclude+drowning+as+a+cause+of+death:+simultaneous+detection+of+eight+bacterioplankton+species+using+real-time+PCR+assays+with+TaqMan+probes.">A new molecular approach to help conclude drowning as a cause of death: simultaneous detection of eight bacterioplankton species using real-time PCR assays with TaqMan probes.</a> Forensic Sci Int. 222 (1-3), 11-26 (2012).</li><li>Kakizaki, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+diverse+aquatic+microbes+in+blood+and+organs+of+drowning+victims:+first+metagenomic+approach+using+high-throughput+454-pyrosequencing.">Detection of diverse aquatic microbes in blood and organs of drowning victims: first metagenomic approach using high-throughput 454-pyrosequencing.</a> Forensic Sci Int. 220 (1-3), 135-146 (2012).</li><li>Cai, J., Wang, B., Chen, J. H., Deng, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+Progress+of+High-Throughput+Sequencing+Technology+in+Forensic+Diatom+Detection.">Application Progress of High-Throughput Sequencing Technology in Forensic Diatom Detection.</a> Fa Yi Xue Za Zhi. 38 (1), 20-30 (2022).</li><li>Xiao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+application+of+a+multiplex+PCR+system+for+drowning+diagnosis.">Development and application of a multiplex PCR system for drowning diagnosis.</a> Electrophoresis. 42 (11), 1270-1278 (2021).</li><li>Yarimizu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+absolute+quantification+method+for+ribosomal+RNA+gene+copy+numbers+per+eukaryotic+single+cell+by+digital+PCR.">Development of an absolute quantification method for ribosomal RNA gene copy numbers per eukaryotic single cell by digital PCR.</a> Harmful Algae. 103, 102008 (2021).</li><li>Dalgic, A. D., Atila, D., Karatas, A., Tezcaner, A., Keskin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diatom+shell+incorporated+PHBV/PCL-pullulan+co-electrospun+scaffold+for+bone+tissue+engineering.">Diatom shell incorporated PHBV/PCL-pullulan co-electrospun scaffold for bone tissue engineering.</a> Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 100, 735-746 (2019).</li><li>Malviya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+global+diatom+distribution+and+diversity+in+the+world's+ocean.">Insights into global diatom distribution and diversity in the world's ocean.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (11), 1516-1525 (2016).</li><li>Brunner, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+studies+of+silica+biomineralization:+towards+an+understanding+of+silica+processing+by+diatoms.">Analytical studies of silica biomineralization: towards an understanding of silica processing by diatoms.</a> Appl Microbiol Biotechnol. 84 (4), 607-616 (2009).</li><li>Annunziata, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimised+method+for+intact+nuclei+isolation+from+diatoms.">An optimised method for intact nuclei isolation from diatoms.</a> Sci Rep. 11 (1), 1681 (2021).</li><li>Zhao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+diagnostic+value+of+quantitative+assessment+of+diatom+test+for+drowning:+An+analysis+of+128+water-related+death+cases+using+microwave+digestion-vacuum+filtration-automated+scanning+electron+microscopy.">The diagnostic value of quantitative assessment of diatom test for drowning: An analysis of 128 water-related death cases using microwave digestion-vacuum filtration-automated scanning electron microscopy.</a> J Forensic Sci. 62 (6), 1638-1642 (2017).</li><li>Zhao, J., Liu, C., Hu, S., He, S., Lu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microwave+digestion-vacuum+filtration-automated+scanning+electron+microscopy+as+a+sensitive+method+for+forensic+diatom+test.">Microwave digestion-vacuum filtration-automated scanning electron microscopy as a sensitive method for forensic diatom test.</a> Int J Legal Med. 127 (2), 459-463 (2013).</li><li>Cai, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+glass+bead-vortex+oscillation+method+for+DNA+extraction+from+diatom.">Improved glass bead-vortex oscillation method for DNA extraction from diatom.</a> Fa Yi Xue Za Zhi. 38 (1), 119-126 (2022).</li><li>Zimmermann, J., Jahn, R., Gemeinholzer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Barcoding+diatoms:+evaluation+of+the+V4+subregion+on+the+18S+rRNA+gene,+including+new+primers+and+protocols.">Barcoding diatoms: evaluation of the V4 subregion on the 18S rRNA gene, including new primers and protocols.</a> Org Divers Evol. 11 (3), 173-192 (2011).</li><li>Vinayak, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chloroplast+gene+markers+detect+diatom+DNA+in+a+drowned+mice+establishing+drowning+as+a+cause+of+death.">Chloroplast gene markers detect diatom DNA in a drowned mice establishing drowning as a cause of death.</a> Electrophoresis. , (2020).</li><li>Plante, C. J., Hill-Spanik, K., Cook, M., Graham, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+and+Spatial+Influences+on+Biogeography+and+Community+Structure+of+Saltmarsh+Benthic+Diatoms.">Environmental and Spatial Influences on Biogeography and Community Structure of Saltmarsh Benthic Diatoms.</a> Estuaries and Coasts. 44, 147-161 (2021).</li><li>Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real+time+quantitative+PCR.">Real time quantitative PCR.</a> Genome Res. 6 (10), 986-994 (1996).</li><li>Ben Amor, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+novel+TaqMan+qPCR+assay+for+rapid+detection+and+quantification+of+Gymnodinium+catenatum+for+application+to+harmful+algal+bloom+monitoring+in+coastal+areas+of+Tunisia.">Development of a novel TaqMan qPCR assay for rapid detection and quantification of Gymnodinium catenatum for application to harmful algal bloom monitoring in coastal areas of Tunisia.</a> Environ Sci Pollut Res Int. 29 (42), 63953-63963 (2022).</li><li>Doddaraju, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliable+and+early+diagnosis+of+bacterial+blight+in+pomegranate+caused+by+Xanthomonas+axonopodis+pv.+punicae+using+sensitive+PCR+techniques.">Reliable and early diagnosis of bacterial blight in pomegranate caused by Xanthomonas axonopodis pv. punicae using sensitive PCR techniques.</a> Sci Rep. 9 (1), 10097 (2019).</li><li>Lunetta, P., Miettinen, A., Spilling, K., Sajantila, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=False-positive+diatom+test:+a+real+challenge?+A+post-mortem+study+using+standardized+protocols.">False-positive diatom test: a real challenge? A post-mortem study using standardized protocols.</a> Leg Med (Tokyo). 15 (5), 229-234 (2013).</li><li>Marquesda Silva, J., Cruz, S., Cartaxana, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inorganic+carbon+availability+in+benthic+diatom+communities:+photosynthesis+and+migration.">Inorganic carbon availability in benthic diatom communities: photosynthesis and migration.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 372 (1728), 20160398 (2017).</li><li>Yu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+enzyme+digestion+time+on+the+detection+of+diatom+species.">The effect of enzyme digestion time on the detection of diatom species.</a> Pak J Pharm Sci. 27 (3 Suppl), 691-694 (2014).</li><li>Liu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diatom+DNA+barcodes+for+forensic+discrimination+of+drowning+incidents.">Diatom DNA barcodes for forensic discrimination of drowning incidents.</a> FEMS Microbiol Lett. 367 (17), 145 (2020).</li><li>Mizushima, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+novel+heart-specific+RING+finger+protein+207+is+involved+in+energy+metabolism+in+cardiomyocytes.">The novel heart-specific RING finger protein 207 is involved in energy metabolism in cardiomyocytes.</a> J Mol Cell Cardiol. 100, 43-53 (2016).</li><li>Zimmermann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taxonomic+reference+libraries+for+environmental+barcoding:+a+best+practice+example+from+diatom+research.">Taxonomic reference libraries for environmental barcoding: a best practice example from diatom research.</a> PLoS One. 9 (9), 108793 (2014).</li></ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Les cellules de diatomées sont protégées par des parois cellulaires siliceuses dures17, et cette structure doit être détruite pour extraire l’ADN des diatomées. Les kits ordinaires ne détruisent pas facilement la coquille siliceuse des diatomées ; il est donc difficile d’extraire avec succès l’ADN21 des diatomées. Notre laboratoire a amélioré le kit d’extraction d’ADN sanguin le plus couramment utilisé, en ajoutant des billes de verre de différents ...

Dans la pratique médico-légale, il est essentiel de déterminer si un cadavre retrouvé dans l’eau en train de se noyer ou s’il a été jeté à l’eau après la mort est essentiel pour la bonne résolution de l’affaire1. C’est aussi l’une des questions difficiles qui doivent être résolues de toute urgence dans la pratique médico-légale2. Les diatomées sont abondantes dans le milieu naturel (en particulier dans l’eau)3,4. Au cours du processus de noyade, en raison de l’hypoxie et de la réponse au stress, les gens auront des mouvements respiratoires intenses et inhaleront une grande quantité de liquide de noyade. Par conséquent, les diatomées dans l’eau pénètrent dans les poumons avec le liquide de noyade, et certaines diatomées peuvent pénétrer dans la circulation sanguine à travers la barrière alvéolaire-capillaire et se propager aux organes internes avec le flux sanguin 5,6. La détection de diatomées dans les tissus internes et les organes tels que les poumons, le foie et la moelle osseuse est une preuve solide de noyade avant la mort 7,8. À l’heure actuelle, les tests médico-légaux des diatomées sont principalement basés sur des méthodes de tests morphologiques. Après une série de pré-digestion des tissus, les estimations morphologiques qualitatives et quantitatives des diatomées non digérées sont effectuées au microscope. Pendant cette période, des réactifs dangereux et peu respectueux de l’environnement tels que l’acide nitrique doivent être utilisés. Ce processus prend beaucoup de temps et exige des chercheurs qu’ils disposent d’une solide expertise taxonomique et d’une vaste expérience. Tout cela pose certains défis au personnel médico-légal9. La technologie de test d’ADN des diatomées est une nouvelle technologie de test des diatomées développée ces dernières années 10,11,12. Cette technologie permet d’identifier les espèces de diatomées en analysant la composition spécifique des séquences d’ADN des diatomées13,14. La technologie PCR et la technologie de séquençage sont des méthodes techniques couramment utilisées, mais leur base est l’extraction réussie de l’ADN des diatomées. Cependant, les diatomées ont une structure spéciale différente des autres organismes, ce qui rend leurs techniques d’extraction de l’ADN également différentes.
La paroi cellulaire de la diatomée a un degré élevé de silicification et son composant principal est le dioxyde de silicium 15,16,17. La paroi cellulaire siliceuse est très dure et doit être détruite avant d’extraire l’ADN. Les kits d’extraction d’ADN ordinaires sont souvent difficiles à utiliser directement pour l’extraction de l’ADN des diatomées car ils ne peuvent pas détruire la coquille siliceuse des diatomées18. Par conséquent, la destruction de la coquille siliceuse des diatomées est l’un des principaux problèmes techniques à résoudre dans l’extraction de l’ADN des diatomées.
Dans le même temps, étant donné que le nombre de diatomées contenues dans les échantillons de recherche médico-légale, qu’il s’agisse d’échantillons d’eau ou d’organes et de tissus de corps noyés, est souvent limité, il est nécessaire d’enrichir les diatomées. L’essence de l’enrichissement est la séparation des substances. Lorsque vous essayez de rassembler les diatomées, minimisez le contenu des autres composants matériels (composants interférents). Dans le domaine de la médecine légale, les laboratoires utilisent souvent des méthodes de centrifugation ou d’enrichissement par filtration membranaire pour séparer les cellules de diatomées19. Cependant, étant donné que l’équipement de pompage sous vide n’est pas largement utilisé, la méthode d’enrichissement membranaire n’est pas souvent utilisée dans les laboratoires médico-légaux primaires ordinaires. Ainsi, la méthode de centrifugation est encore couramment l’enrichissement en diatomées dans les laboratoires médico-légaux20.
L’extraction de l’ADN à partir de diatomées est actuellement utilisée principalement dans la pratique médico-légale, et son application présente des limites importantes. À l’heure actuelle, il existe peu de kits d’extraction d’ADN de diatomées utilisés en médecine légale sur le marché et ils sont généralement coûteux21. Cet article fournit une méthode améliorée d’extraction de l’ADN des diatomées, rendant l’extraction de l’ADN des diatomées simple, pratique et rentable. Cela augmente l’application des tests de biologie moléculaire ultérieurs des diatomées et peut mieux résoudre les problèmes liés à la noyade en médecine légale grâce aux tests de diatomées. Cette méthode brise les parois cellulaires siliceuses des diatomées en ajoutant des billes de verre et en fixant un moment approprié pour le vortex. De cette façon, la protéinase K et la solution de liaison lysent rapidement les cellules et inactivent diverses enzymes dans les cellules. L’ADN génomique est absorbé dans la membrane matricielle de la colonne d’adsorption et finalement élué par le tampon d’élution. Un tel kit amélioré d’extraction de gènes de sang total améliore l’effet d’extraction de l’ADN des diatomées du kit de sang dans les matériaux d’examen médico-légal, réduit le coût de l’extraction de l’ADN des diatomées dans la pratique médico-légale et peut être mieux appliqué à la recherche médico-légale de base.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Binding Buffer</td>
			<td>BioTeke</td>
			<td>B010006022</td>
			<td>rapidly lysing cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemoHS qPCR Mix</td>
			<td>Monad</td>
			<td>00007547-120506</td>
			<td>qPCR Mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D2000 DNA ladder</td>
			<td>Real-Times(Beijing) Biotechnology</td>
			<td>RTM415</td>
			<td>Measure the position of electrophoretic bands</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D512</td>
			<td>Taihe Biotechnology</td>
			<td>TW21109196</td>
			<td>forword primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D978</td>
			<td>Taihe Biotechnology</td>
			<td>TW21109197</td>
			<td>reverse primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elution buffer</td>
			<td>BioTeke</td>
			<td>B010006022</td>
			<td>A low-salt elution buffer washes off the DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bead</td>
			<td>Yingxu Chemical Machinery(Shanghai)&#160;</td>
			<td>70181000</td>
			<td>Special glass beads for dispersing and grinding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Import adsorption column</td>
			<td>BioTeke</td>
			<td>B2008006022</td>
			<td>Adsorption column with silica matrix membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inhibitor Removal Buffer</td>
			<td>BioTeke</td>
			<td>B010006022</td>
			<td>Removal of Inhibitors in DNA Extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>BioTeke</td>
			<td>B010006022</td>
			<td>Precipitate or isolate DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIX-30S Mini Mixer</td>
			<td>Miulab</td>
			<td>MUC881206</td>
			<td>oscillatory action</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>BioTeke</td>
			<td>B010006022</td>
			<td>Inactivation of intracellular nucleases and other proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotor-Gene Q 5plex HRM</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>R1116175</td>
			<td>real-time fluorescence quantification PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Speed Micro-Centrifuge</td>
			<td>Scilogex</td>
			<td>9013001121</td>
			<td>centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tanon 3500R Gel Imager</td>
			<td>Tanon</td>
			<td>16T5553R-455</td>
			<td>gel imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq Mix Pro</td>
			<td>Monad</td>
			<td>00007808-140534</td>
			<td>PCR Mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Cycler</td>
			<td>Zhuhai Hema</td>
			<td>VRB020A</td>
			<td>ordinary PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash Buffer</td>
			<td>BioTeke</td>
			<td>B010006022</td>
			<td>Remove impurities such as cell metabolites</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extraction of diatom dna from water samples and tissues

Le test des diatomées est un moyen auxiliaire essentiel dans la pratique médico-légale pour déterminer si le cadavre s’est noyé dans l’eau et pour déduire le lieu de la noyade. L’analyse des diatomées est également un élément de recherche important dans le domaine de l’environnement et du plancton. La technologie de test de biologie moléculaire des diatomées, qui se concentre sur l’ADN des diatomées en tant qu’objet de recherche principal, est une nouvelle méthode de test des diatomées. L’extraction de l’ADN des diatomées est la base des tests moléculaires des diatomées. À l’heure actuelle, les kits couramment utilisés pour l’extraction de l’ADN des diatomées sont coûteux, ce qui augmente le coût de la recherche connexe. Notre laboratoire a amélioré le kit général d’extraction rapide d’ADN génomique du sang total et a obtenu un effet d’extraction d’ADN de diatomée satisfaisant, fournissant ainsi une solution d’extraction d’ADN alternative économique et abordable à base de billes de verre pour la recherche connexe. L’ADN des diatomées extrait à l’aide de ce protocole pourrait satisfaire de nombreuses applications en aval, telles que la PCR et le séquençage.

In forensic practice, determining whether a corpse found in the water drowning or was thrown into the water after death is essential for the proper resolution of the case1. It is also one of the difficult issues that need to be solved urgently in forensic practice2. Diatoms are abundant in the natural environment (especially in water)3,4. In the process of drowning, due to hypoxia and stress response, people will have intense breathing movements and inhale a large amount of drowning liquid. Therefore, the diatoms in the water enter the lung with the drowning liquid, and some diatoms can enter the blood circulation through the alveolar-capillary barrier and spread to internal organs with the blood flow5,6. The detection of diatoms in internal tissues and organs such as lung, liver, and bone marrow is a strong evidence of drowning before death7,8. Currently, forensic diatom testing is mainly based on morphological testing methods. After a series of pre-digestion of the tissue, the morphological qualitative and quantitative estimations of undigested diatoms are carried out under the microscope. During this period, dangerous and environmentally unfriendly reagents such as nitric acid need to be used. This process is time-consuming and requires researchers to have solid taxonomic expertise and extensive experience. These all bring certain challenges to the forensic staff9. Diatom DNA testing technology is a new technology for diatom testing developed in recent years10,11,12. This technology realizes the species identification of diatoms by analyzing the specific DNA sequence composition of diatoms13,14. PCR technology and sequencing technology are commonly used technical methods, but their basis is the successful extraction of DNA from diatoms. However, diatoms have a special structure different from other organisms, making their DNA extraction techniques also different.
The cell wall of diatom has a high degree of silicification, and its main component is silicon dioxide15,16,17. The siliceous cell wall is very hard, and it must be destroyed before extract the DNA. Ordinary DNA extraction kits are often difficult to use directly for the extraction of diatom DNA because they cannot destroy the siliceous shell of diatoms18. Therefore, destroying the siliceous shell of diatoms is one of the key technical problems to be solved in extracting diatom DNA.
At the same time, since the number of diatoms contained in forensic research samples, whether water samples or organs and tissues of drowned bodies, is often limited, it is necessary to enrich diatoms. The essence of enrichment is the separation of substances. While trying to gather diatoms together, minimize the content of other material components (interfering components). In forensic work, laboratories often use centrifugation or membrane filtration enrichment methods to separate diatom cells19. However, since vacuum pumping equipment is not widely used, the membrane enrichment method is not often used in ordinary primary forensic laboratories. So, the centrifugation method is still commonly diatom enrichment in forensic laboratories20.
DNA extraction from diatoms is currently used primarily in forensic practice, and there are significant limitations to its application. At present, there are few diatom DNA extraction kits used in forensic science on the market and they are generally expensive21. This article provides an improved diatom DNA extraction method, making diatom DNA extraction simple, convenient and cost effective. This increases the application of subsequent molecular biology testing of diatoms and can better solve problems related to drowning in forensic medicine through diatom testing. This method breaks the siliceous cell walls of diatoms by adding glass beads and setting an appropriate time for vortex. In this way, the proteinase K and the binding solution rapidly lyse the cells and inactivate various enzymes in the cells. The genomic DNA is absorbed in the matrix membrane in the adsorption column and finally eluted by the elution buffer. Such an improved whole blood gene extraction kit improves the diatom DNA extraction effect of the blood kit in forensic examination materials, reduces the cost of diatom DNA extraction in forensic practice, and can be better applied to grassroot forensic research.

Pleins feux sur l’auteur : Test de diatomées pour l’examen médico-légal de la noyade 

Extraction de l’ADN des diatomées à partir d’échantillons d’eau et de tissus

Our research mainly focus on the topic of drowning. We wanted to answer the question of whether the body found in the water died from drowning, as well to answer another question of where the person fell into the water. That means to know the location of the drowning.Compared with other technologies, we provide a simple, convenient, and economical diatom DNA extraction protocol that we can use better in forensic research, especially in basic forensic practice. Our laboratory will further focus on the drowning related problems based on the pattern in the water, such as reason of death, post mortem interval and so on. What's more, we also carry on the research through the forensic entomology and a some special phenomenons in the tropical forensic medicines.

Étant donné que la solution d’ADN extraite par la méthode d’extraction d’ADN actuellement utilisée contient tous les composants de l’ADN provenant de différentes sources dans l’échantillon, l’ADN obtenu par ce protocole n’a pas fait exception. Ainsi, la solution d’ADN n’était pas seulement une solution d’ADN génomique de diatomées. Les amorces qui peuvent amplifier spécifiquement les fragments d’ADNr de la diatomée 18S ont été sélectionnées en consultant la littérature 22,23,24.<sup ...

Watch this Scientific Journal Video about Diatom Testing for Forensic Drowning Examination at JoVE.com

Cet article décrit un protocole d’extraction de l’ADN des diatomées à l’aide d’un kit d’extraction d’ADN commun modifié.

Diatom testing is an essential auxiliary means in forensic practice to determine whether the corpse drowned in water and to infer the drowning location. ...

Nos recherches portent principalement sur le thème de la noyade. Nous voulions répondre à la question de savoir si le corps retrouvé dans l’eau était mort par noyade, ainsi qu’à une autre question de savoir où la personne était tombée dans l’eau. Cela signifie connaître l’emplacement de la noyade.Par rapport à d’autres technologies, nous fournissons un protocole d’extraction d’ADN de diatomées simple, pratique et économique que nous pouvons mieux utiliser dans la recherche médico-légale, en particulier dans la pratique médico-légale de base. Notre laboratoire se concentrera davantage sur les problèmes liés à la noyade en fonction de la situation dans l’eau, tels que la raison du décès, l’intervalle post-mortem, etc. De plus, nous poursuivons également la recherche à travers l’entomologie médico-légale et quelques phénomènes spéciaux dans les médecines médico-légales tropicales.

extraction-of-diatom-dna-from-water-samples-and-tissues

Research

JoVE Journal

Medicine

Extraction of Diatom DNA from Water Samples and Tissues

1.3K vues.  Hainan Medical University, Hainan Provincial Academician Workstation (tropical forensic medicine). Nos recherches portent principalement sur le thème de la noyade. Nous voulions répondre à la question de savoir si le corps retrouvé dans l’eau était mort par noyade, ainsi qu’à une autre question de savoir où la personne était tombée dans l’eau. Cela signifie connaître l’emplacement de la noyade.Par rapport à d’autres technologies, nous fournissons un protocole d’extraction d’ADN de diatomées simple, pratique et économique que nous pouvons mieux utiliser dan...