עבודה זו נתמכת על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (82060341,81560304) ועל ידי פרויקט המחקר המדעי של פלטפורמת החדשנות האקדמית של מחוז האינאן (YSPTZX202134).

מחקר זה אושר על ידי ועדת האתיקה של האוניברסיטה הרפואית של היינאן. דגימות הרקמה ששימשו במחקר זה אינן נחשבות למחקרים המערבים נבדקים אנושיים. דגימות אלה הושגו לצורך אבחון פתולוגי פורנזי, והשאר שימשו להפקת DNA דיאטומי בניסוי זה. חוקרים אינם יכולים לזהות בקלות אנשים כדי לקבל הסכמה מדעת מבעלי עניין רלוונטיים.
הערה: כדי להבטיח את התחולה הכללית של שיטת המחקר שדווחה בניסוי זה, ניסוי זה פעל למעשה לפי הוראות ההפעלה של הערכה בה נעשה שימוש, ורק כמה שלבים שונו. דגימות המים ששימשו בניסוי הזה נלקחו באופן אקראי מבריכות ליד המעבדה (איור משלים 1A). בניסוי הזה, רקמת הריאה של הגוף הטבוע אושרה כרקמת המחקר כדי להדגים את פרוטוקול המיצוי (איור משלים 1B). בפרקטיקה המשפטית, לעיתים יש צורך להשתמש גם באיברים ורקמות אחרים של גופות שטבעו (כגון כבד, טחול, כליות, מח עצם וכו ') כדי לחלץ DNA דיאטומים, מה שדורש שיפורים מקבילים קלים לשיטת ניסוי זו, אשר יוסברו בחלק המתאים של הניסוי. דגימות רקמת הריאה ששימשו בניסוי זה הגיעו מגופות שטבעו בבירור במקרים פורנזיים. בדיקות מורפולוגיות נערכו כדי להוכיח שרקמת הריאה מכילה דיאטומים (איור משלים 2).
1. טיפול מקדים בדגימות
<ol><li>טיפול מקדים בדגימות מים<ol><li>קח דגימת מים של 10 מ"ל לתוך צינור הצנטריפוגה והצנטריפוגה ב 13,400 x גרם למשך 5 דקות. יש להשליך בזהירות 9.8 מ"ל סופרנאטנט עם אקדח פיפטה, ולהעביר כ-200 מיקרוליטר של דגימת מים דיאטומית מועשרת שנותרה בתחתית לתוך צינור צנטריפוגה של 2 מ"ל. הערה: ניתן לבצע תחילה קדם-ניסוי, וניתן להגדיל את הכמות הראשונית אם דגימת מים של 10 מ"ל אינה מספיקה להעשרה.</li>
	</ol></li>
	<li>טיפול מקדים בדגימות רקמה<ol><li>קח 0.5 גרם מרקמת שולי הריאה מהגוף הטבוע, קצץ או טחן לחלוטין את רקמת הריאה עד שהיא הופכת לבוצית. מניעת זיהום של דיאטומים אקסוגניים היא הליבה של צעד זה. חותכים את הרקמה לחתיכות שוב ושוב באמצעות מספריים.</li>
	</ol></li>
</ol>2. מיצוי DNA
הערה: כל שלבי הצנטריפוגה מתבצעים בטמפרטורת החדר. שימוש בצנטריפוגה שולחנית בעלת כוח צנטריפוגלי של 14,500 x גרם; אמבט מים (או אמבט מתכת) שחומם מראש ל -70 מעלות צלזיוס צריך להיות מוכן לפני תחילת הניסוי. כל השלבים חייבים להקפיד על עקרונות הפעולה האספטית.
<ol><li>הרכבה של דגימות מים ורקמות הערה: דגימת מים ושיטת מיצוי DNA דיאטום רקמות זהות.<ol><li>הוסף חרוזי זכוכית לצינור צנטריפוגה בנפח 2 מ"ל המכיל את דגימת המים שטופלה מראש. הפוך 10x-15x כדי לערבב היטב. חרוזי הזכוכית שנוספו מורכבים מחרוזי זכוכית גדולים וקטנים מעורבבים ביחס מסה של 1:1. קוטר חרוזי הזכוכית הגדולים הוא 1.5-2.0 מ"מ וקוטר חרוזי הזכוכית הקטנים הוא 0.4-0.6 מ"מ.</li>
		<li>קח 0.5 גרם של רקמה קצוצה דק, להוסיף חרוזי זכוכית לצינור צנטריפוגה 2 מ"ל המכיל את הרקמה כמתואר לעיל. הפוך 10x-15x כדי לערבב.</li>
	</ol></li>
	<li>הוסף 40 μL של proteinase K (20 מ"ג / מ"ל) לצינורות. מניחים בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות, במהלך תקופה זו, הופכים ומערבבים 10x כל 3 דקות. הערה: אם הרקמה אינה מתעכלת במלואה, ניתן להגדיל כראוי את כמות הפרוטאינאז K עד שהתמיסה מתבהרת.</li>
	<li>מוסיפים 200 μL של חיץ קשירה לצינורות הצנטריפוגה, מערבלים מיד, ומערבבים במשך 4 דקות (תדירות ערבוב תנודה: 3000 סל"ד). הערה: בשלב זה, יש לשלוט בקפידה בעוצמת הרעידה ובזמן כדי להבטיח עוצמת ערבוב וזמן מספיקים.</li>
	<li>שים את צינורות הצנטריפוגה באמבט מים של 70 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, והפתרון הופך ברור.</li>
	<li>הוסף 100 μL של isopropanol צינורות צנטריפוגה, מערבולת ומערבבים במשך 15 s, משקעים flocculent עשוי להופיע בשלב זה. הערה: חשוב מאוד לערבב היטב עם חוזק מתאים בשלבי הפעולה הנ"ל, אך יש להימנע מטלטול נמרץ כדי למנוע גזירת DNA.</li>
	<li>שים את הפתרון שהתקבל בשלב הקודם יחד עם המשקע flocculent לתוך עמודת ספיחה (עמודת ספיחה ממוקם בצינור האיסוף). אורך עמוד הספיחה הוא 3.0 ס"מ, הקוטר 1.0 ס"מ, ומטריצת הספיחה היא קרום מטריצת סיליקון.</li>
	<li>צנטריפוגה בעוצמה של 8,000 x גרם למשך 30 שניות, יש להשליך את נוזל הפסולת לצינור האיסוף ולהחזיר את עמוד הספיחה לצינור האיסוף.</li>
	<li>הוסף 500 μL של מאגר להסרת מעכבים לעמודת הספיחה. צנטריפוגה בעוצמה של 13,400 x גרם למשך 30 שניות ולהשליך את נוזל הפסולת לצינור האיסוף.</li>
	<li>הוסיפו 700 מיקרוליטר של חיץ כביסה לעמוד הספיחה. צנטריפוגה בעוצמה של 13,400 x גרם למשך 30 שניות ולהשליך את נוזל הפסולת לצינור האיסוף. הערה: יש להוסיף את הכמות שצוינה של אתנול מוחלט לבקבוק חיץ הכביסה לפני השימוש הראשון.</li>
	<li>הוסף 500 μL של חיץ כביסה לעמוד הספיחה. צנטריפוגה בעוצמה של 13,400 x גרם למשך 30 שניות ולהשליך את נוזל הפסולת לצינור האיסוף.</li>
	<li>החזירו את עמודת הספיחה לצינור האיסוף הריק. צנטריפוגה של 14,500 x גרם למשך 2 דקות, והסר את מאגר הכביסה ככל האפשר, כדי למנוע משאריות האתנול במאגר הכביסה לעכב תגובות במורד הזרם.</li>
	<li>מוציאים את עמוד הספיחה ומכניסים אותו לצינור צנטריפוגה נקי. הוסף 100 μL של חיץ elution לחלק האמצעי של קרום הספיחה.</li>
	<li>מניחים את עמוד הספיחה בטמפרטורת החדר למשך 3-5 דקות, ואת הצנטריפוגה על 13,400 x גרם למשך דקה אחת.</li>
	<li>הוסף שוב את התמיסה שהושגה בשלב הקודם לעמודת הספיחה הצנטריפוגלית. מניחים את עמוד הספיחה הצנטריפוגלי בטמפרטורת החדר למשך 2 דקות, ואת הצנטריפוגה על 13,400 x גרם למשך דקה אחת. הערה: יש לחמם מראש את חיץ האלוציה באמבט מים של 70 מעלות צלזיוס למשך כ-10 דקות. נפח elution לא צריך להיות פחות מ 50 μL; אחרת, תפוקת הדנ"א תפחת.</li>
	<li>אחסן את ה- DNA הדיאטום שחולץ ב- 2-8 ° C לשימוש עתידי. אם תמיסת ה- DNA אמורה להיות מאוחסנת במשך זמן רב, אחסן אותה ב -20 מעלות צלזיוס.</li>
</ol>3. בדיקת PCR
הערה: מאחר שתכולת הדיאטומים בדגימות פורנזיות היא לעתים קרובות נמוכה, תמציות דגימות הרקמה של הגופות הטבועות עשויות להכיל גם דרגות שונות של רקמות ואיברים (כגון הריאות בניסוי זה) עם דנ"א משלהם. לכן, זיהוי ישיר של סך כל הדנ"א בתמציות דנ"א אינו משקף את המצב של מיצוי דנ"א דיאטומי. בניסוי זה נבחרו פריימרים ספציפיים לדיאטומים, ומוצרי PCR שימשו להערכת מיצוי הדנ"א הדיאטום בתמצית. המוצרים ניתן לצפות ולנתח על ידי אלקטרופורזה ג'ל agarose והוא יכול גם להיות מנותח על ידי עקומת התכה PCR כמותית פלואורסצנטית בזמן אמת, אשר יש רגישות גבוהה יותר.
<ol><li>הוסף 2 μL של ה- DNA המופק מדגימות מים ורקמות כתבנית. בחר אחת משתי השיטות הבאות לבדיקה.</li>
	<li>בדיקת PCR קונבנציונלית<ol><li>השתמש פריימרים22 שיכולים להגביר באופן ספציפי מקטעי rDNA diatom 18S. לקבלת פרטים, ראה טבלה 1.</li>
		<li>לקבוע את מערכת תגובת ה-PCR ואת תנאי ההגברה בהתאם למאפייני הפריימרים. לפרטים, ראו טבלה 2.</li>
		<li>הפעל את המוצרים של הגברת PCR על ג'ל אגרוז 2%. התבונן ונתח את ההדמיה עם imager ג'ל.</li>
	</ol></li>
	<li>בדיקת PCR כמותית פלואורסצנטית<ol><li>השתמש בפריימרים לעיל שיכולים להגביר באופן ספציפי מקטעי rDNA diatom 18S כדי להכין מערכת תגובת PCR כמותית פלואורסצנטית בזמן אמת. לפרטים, ראו טבלה 3.</li>
		<li>בצע הגברה PCR ונתח את עקומת ההגברה המתקבלת ואת ערכי Ct. במקביל, הגדר תוכנית, התיך את הגדילים הכפולים של המוצרים המוגברים לגדילים בודדים בהדרגה באמצעות טכנולוגיית עקומת התכה PCR כמותית פלואורסצנטית, ולאחר מכן נתח את עקומות ההתכה המתקבלות.</li>
	</ol></li>
</ol>

מיצוי DNA דיאטומי חסכוני באמצעות ערכה מותאמת

<ol>
	<li>Liu, C., Cong, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+and+prospect+of+diagnosis+of+drowning+deaths+in+water.">Review and prospect of diagnosis of drowning deaths in water.</a> Fa Yi Xue Za Zhi. 38 (1), 3-13 (2022).</li><li>Frisoni, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forensic+diagnosis+of+freshwater+or+saltwater+drowning+using+the+marker+aquaporin+5:+An+immunohistochemical+study.">Forensic diagnosis of freshwater or saltwater drowning using the marker aquaporin 5: An immunohistochemical study.</a> Medicina (Kaunas). 58 (10), 1458 (2022).</li><li>Mann, D. G., Vanormelingen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+inordinate+fondness?+The+number,+distributions,+and+origins+of+diatom+species.">An inordinate fondness? The number, distributions, and origins of diatom species.</a> J Eukaryot Microbiol. 60 (4), 414-420 (2013).</li><li>Pfister, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Terrestrial+diatoms+as+tracers+in+catchment+hydrology:+a+review.">Terrestrial diatoms as tracers in catchment hydrology: a review.</a> WIREs Water. 4, 1241 (2017).</li><li>Yu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+automated+diatom+detection+method+based+on+YOLOv5+framework+and+its+preliminary+study+for+taxonomy+recognition+in+the+forensic+diatom+test.">An improved automated diatom detection method based on YOLOv5 framework and its preliminary study for taxonomy recognition in the forensic diatom test.</a> Front Microbiol. 13, 963059 (2022).</li><li>Zhang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+length+and+width+of+diatoms+in+drowning+cases+as+the+evidence+of+diatoms+penetrating+the+alveoli-capillary+barrier.">The length and width of diatoms in drowning cases as the evidence of diatoms penetrating the alveoli-capillary barrier.</a> Int J Legal Med. 134 (3), 1037-1042 (2020).</li><li>Kihara, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+water+injection+into+lungs+using+an+animal+model:+Verification+of+the+diatom+concentration+test+to+diagnose+drowning.">Experimental water injection into lungs using an animal model: Verification of the diatom concentration test to diagnose drowning.</a> Forensic Sci Int. 327, 110983 (2021).</li><li>Shen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+false-positive+results+of+diatom+test+in+the+diagnosis+of+drowning-would+not+be+an+impediment.">Analysis of false-positive results of diatom test in the diagnosis of drowning-would not be an impediment.</a> Int J Legal Med. 133 (6), 1819-1824 (2019).</li><li>Manoylov, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taxonomic+identification+of+algae+(morphological+and+molecular):+species+concepts,+methodologies,+and+their+implications+for+ecological+bioassessment.">Taxonomic identification of algae (morphological and molecular): species concepts, methodologies, and their implications for ecological bioassessment.</a> J Phycol. 50 (3), 409-424 (2014).</li><li>Uchiyama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+molecular+approach+to+help+conclude+drowning+as+a+cause+of+death:+simultaneous+detection+of+eight+bacterioplankton+species+using+real-time+PCR+assays+with+TaqMan+probes.">A new molecular approach to help conclude drowning as a cause of death: simultaneous detection of eight bacterioplankton species using real-time PCR assays with TaqMan probes.</a> Forensic Sci Int. 222 (1-3), 11-26 (2012).</li><li>Kakizaki, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+diverse+aquatic+microbes+in+blood+and+organs+of+drowning+victims:+first+metagenomic+approach+using+high-throughput+454-pyrosequencing.">Detection of diverse aquatic microbes in blood and organs of drowning victims: first metagenomic approach using high-throughput 454-pyrosequencing.</a> Forensic Sci Int. 220 (1-3), 135-146 (2012).</li><li>Cai, J., Wang, B., Chen, J. H., Deng, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+Progress+of+High-Throughput+Sequencing+Technology+in+Forensic+Diatom+Detection.">Application Progress of High-Throughput Sequencing Technology in Forensic Diatom Detection.</a> Fa Yi Xue Za Zhi. 38 (1), 20-30 (2022).</li><li>Xiao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+application+of+a+multiplex+PCR+system+for+drowning+diagnosis.">Development and application of a multiplex PCR system for drowning diagnosis.</a> Electrophoresis. 42 (11), 1270-1278 (2021).</li><li>Yarimizu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+absolute+quantification+method+for+ribosomal+RNA+gene+copy+numbers+per+eukaryotic+single+cell+by+digital+PCR.">Development of an absolute quantification method for ribosomal RNA gene copy numbers per eukaryotic single cell by digital PCR.</a> Harmful Algae. 103, 102008 (2021).</li><li>Dalgic, A. D., Atila, D., Karatas, A., Tezcaner, A., Keskin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diatom+shell+incorporated+PHBV/PCL-pullulan+co-electrospun+scaffold+for+bone+tissue+engineering.">Diatom shell incorporated PHBV/PCL-pullulan co-electrospun scaffold for bone tissue engineering.</a> Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 100, 735-746 (2019).</li><li>Malviya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+global+diatom+distribution+and+diversity+in+the+world's+ocean.">Insights into global diatom distribution and diversity in the world's ocean.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (11), 1516-1525 (2016).</li><li>Brunner, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+studies+of+silica+biomineralization:+towards+an+understanding+of+silica+processing+by+diatoms.">Analytical studies of silica biomineralization: towards an understanding of silica processing by diatoms.</a> Appl Microbiol Biotechnol. 84 (4), 607-616 (2009).</li><li>Annunziata, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimised+method+for+intact+nuclei+isolation+from+diatoms.">An optimised method for intact nuclei isolation from diatoms.</a> Sci Rep. 11 (1), 1681 (2021).</li><li>Zhao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+diagnostic+value+of+quantitative+assessment+of+diatom+test+for+drowning:+An+analysis+of+128+water-related+death+cases+using+microwave+digestion-vacuum+filtration-automated+scanning+electron+microscopy.">The diagnostic value of quantitative assessment of diatom test for drowning: An analysis of 128 water-related death cases using microwave digestion-vacuum filtration-automated scanning electron microscopy.</a> J Forensic Sci. 62 (6), 1638-1642 (2017).</li><li>Zhao, J., Liu, C., Hu, S., He, S., Lu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microwave+digestion-vacuum+filtration-automated+scanning+electron+microscopy+as+a+sensitive+method+for+forensic+diatom+test.">Microwave digestion-vacuum filtration-automated scanning electron microscopy as a sensitive method for forensic diatom test.</a> Int J Legal Med. 127 (2), 459-463 (2013).</li><li>Cai, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+glass+bead-vortex+oscillation+method+for+DNA+extraction+from+diatom.">Improved glass bead-vortex oscillation method for DNA extraction from diatom.</a> Fa Yi Xue Za Zhi. 38 (1), 119-126 (2022).</li><li>Zimmermann, J., Jahn, R., Gemeinholzer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Barcoding+diatoms:+evaluation+of+the+V4+subregion+on+the+18S+rRNA+gene,+including+new+primers+and+protocols.">Barcoding diatoms: evaluation of the V4 subregion on the 18S rRNA gene, including new primers and protocols.</a> Org Divers Evol. 11 (3), 173-192 (2011).</li><li>Vinayak, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chloroplast+gene+markers+detect+diatom+DNA+in+a+drowned+mice+establishing+drowning+as+a+cause+of+death.">Chloroplast gene markers detect diatom DNA in a drowned mice establishing drowning as a cause of death.</a> Electrophoresis. , (2020).</li><li>Plante, C. J., Hill-Spanik, K., Cook, M., Graham, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+and+Spatial+Influences+on+Biogeography+and+Community+Structure+of+Saltmarsh+Benthic+Diatoms.">Environmental and Spatial Influences on Biogeography and Community Structure of Saltmarsh Benthic Diatoms.</a> Estuaries and Coasts. 44, 147-161 (2021).</li><li>Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real+time+quantitative+PCR.">Real time quantitative PCR.</a> Genome Res. 6 (10), 986-994 (1996).</li><li>Ben Amor, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+novel+TaqMan+qPCR+assay+for+rapid+detection+and+quantification+of+Gymnodinium+catenatum+for+application+to+harmful+algal+bloom+monitoring+in+coastal+areas+of+Tunisia.">Development of a novel TaqMan qPCR assay for rapid detection and quantification of Gymnodinium catenatum for application to harmful algal bloom monitoring in coastal areas of Tunisia.</a> Environ Sci Pollut Res Int. 29 (42), 63953-63963 (2022).</li><li>Doddaraju, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliable+and+early+diagnosis+of+bacterial+blight+in+pomegranate+caused+by+Xanthomonas+axonopodis+pv.+punicae+using+sensitive+PCR+techniques.">Reliable and early diagnosis of bacterial blight in pomegranate caused by Xanthomonas axonopodis pv. punicae using sensitive PCR techniques.</a> Sci Rep. 9 (1), 10097 (2019).</li><li>Lunetta, P., Miettinen, A., Spilling, K., Sajantila, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=False-positive+diatom+test:+a+real+challenge?+A+post-mortem+study+using+standardized+protocols.">False-positive diatom test: a real challenge? A post-mortem study using standardized protocols.</a> Leg Med (Tokyo). 15 (5), 229-234 (2013).</li><li>Marquesda Silva, J., Cruz, S., Cartaxana, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inorganic+carbon+availability+in+benthic+diatom+communities:+photosynthesis+and+migration.">Inorganic carbon availability in benthic diatom communities: photosynthesis and migration.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 372 (1728), 20160398 (2017).</li><li>Yu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+enzyme+digestion+time+on+the+detection+of+diatom+species.">The effect of enzyme digestion time on the detection of diatom species.</a> Pak J Pharm Sci. 27 (3 Suppl), 691-694 (2014).</li><li>Liu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diatom+DNA+barcodes+for+forensic+discrimination+of+drowning+incidents.">Diatom DNA barcodes for forensic discrimination of drowning incidents.</a> FEMS Microbiol Lett. 367 (17), 145 (2020).</li><li>Mizushima, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+novel+heart-specific+RING+finger+protein+207+is+involved+in+energy+metabolism+in+cardiomyocytes.">The novel heart-specific RING finger protein 207 is involved in energy metabolism in cardiomyocytes.</a> J Mol Cell Cardiol. 100, 43-53 (2016).</li><li>Zimmermann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taxonomic+reference+libraries+for+environmental+barcoding:+a+best+practice+example+from+diatom+research.">Taxonomic reference libraries for environmental barcoding: a best practice example from diatom research.</a> PLoS One. 9 (9), 108793 (2014).</li></ol>

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

תאי דיאטום מוגנים על ידי דפנות תאים סיליקיות קשות17, ויש להרוס מבנה זה כדי לחלץ דנ"א דיאטומי. ערכות רגילות אינן הורסות בקלות את הקליפה הסיליקית של דיאטומים; לכן קשה לחלץ בהצלחה DNA דיאטום21. המעבדה שלנו שיפרה את ערכת מיצוי הדנ"א בדם הנפוצה ביותר, והוסיפה חרוזי זכוכית ב...

בפרקטיקה הפורנזית, הקביעה אם גופה שנמצאה במים טובעת או הושלכה למים לאחר המוות חיונית לפתרון הראוי של המקרה1. זהו גם אחד הנושאים הקשים שיש לפתור בדחיפות בפרקטיקה משפטית2. דיאטומים נמצאים בשפע בסביבה הטבעית (במיוחד במים)3,4. בתהליך של טביעה, עקב היפוקסיה ותגובת מתח, אנשים יהיו תנועות נשימה אינטנסיביות לשאוף כמות גדולה של נוזל טביעה. לכן, הדיאטומים במים נכנסים לריאה עם הנוזל הטובע, וחלק מהדיאטומים יכולים להיכנס למחזור הדם דרך מחסום הנאדיות-נימים ולהתפשט לאיברים פנימיים עם זרימת הדם 5,6. גילוי דיאטומים ברקמות ובאיברים פנימיים כגון ריאות, כבד ומח עצם הוא עדות חזקה לטביעה לפני המוות 7,8. כיום, בדיקות דיאטומיות פורנזיות מבוססות בעיקר על שיטות בדיקה מורפולוגיות. לאחר סדרה של עיכול מראש של הרקמה, הערכות מורפולוגיות איכותיות וכמותיות של דיאטומים לא מעוכלים מתבצעות תחת המיקרוסקופ. במהלך תקופה זו, ריאגנטים מסוכנים ולא ידידותיים לסביבה כגון חומצה חנקתית צריך לשמש. תהליך זה גוזל זמן רב ודורש מהחוקרים מומחיות טקסונומית מוצקה וניסיון רב. כל אלה מביאים אתגרים מסוימים לצוות הזיהוי הפלילי9. טכנולוגיית בדיקת DNA Diatom היא טכנולוגיה חדשה לבדיקות דיאטומיות שפותחה בשנים האחרונות 10,11,12. טכנולוגיה זו מממשת את זיהוי המינים של דיאטומים על ידי ניתוח הרכב רצף הדנ"א הספציפי של דיאטומים13,14. טכנולוגיית PCR וטכנולוגיית ריצוף הן שיטות טכניות נפוצות, אך הבסיס שלהן הוא מיצוי מוצלח של DNA מדיאטומים. עם זאת, לדיאטומים יש מבנה מיוחד שונה מאורגניזמים אחרים, מה שהופך את טכניקות מיצוי הדנ"א שלהם גם שונות.
דופן התא של diatom יש רמה גבוהה של סיליקציה, ואת המרכיב העיקרי שלה הוא דו תחמוצת הסיליקון 15,16,17. דופן התא הסיליקסי קשה מאוד, ויש להרוס אותה לפני מיצוי הדנ"א. ערכות מיצוי דנ"א רגילות הן לעתים קרובות קשות לשימוש ישיר להפקת דנ"א דיאטומי מכיוון שהן אינן יכולות להרוס את הקליפה הסיליקית של דיאטומים18. לכן, השמדת הקליפה הסיליקית של דיאטומים היא אחת הבעיות הטכניות העיקריות שיש לפתור בחילוץ דנ"א דיאטומי.
יחד עם זאת, מכיוון שמספר הדיאטומים הכלולים בדגימות מחקר פורנזי, בין אם דגימות מים או איברים ורקמות של גופות שטבעו, מוגבל לעתים קרובות, יש צורך להעשיר דיאאטומים. מהות ההעשרה היא הפרדת חומרים. בעת ניסיון לאסוף דיאטומים יחד, למזער את התוכן של רכיבי חומר אחרים (רכיבים מפריעים). בעבודה משפטית, מעבדות משתמשות לעתים קרובות בשיטות העשרת צנטריפוגה או סינון ממברנות כדי להפריד תאים דיאטומים19. עם זאת, מכיוון שציוד שאיבת ואקום אינו בשימוש נרחב, שיטת העשרת הממברנה אינה משמשת לעתים קרובות במעבדות משפטיות ראשוניות רגילות. לכן, שיטת הצנטריפוגה היא עדיין העשרת דיאטום נפוצה במעבדות פורנזיות20.
מיצוי DNA מדיאטומים משמש כיום בעיקר בפרקטיקה משפטית, ויש מגבלות משמעותיות ליישומו. כיום, יש מעט ערכות מיצוי DNA דיאטומי המשמשות במדע פורנזי בשוק והן בדרך כלל יקרות21. מאמר זה מספק שיטת מיצוי DNA דיאטומית משופרת, מה שהופך את מיצוי ה- DNA של דיאטום לפשוט, נוח וחסכוני. זה מגביר את היישום של בדיקות ביולוגיה מולקולרית עוקבות של דיאטומים ויכול לפתור טוב יותר בעיות הקשורות לטביעה ברפואה משפטית באמצעות בדיקות דיאאטומים. שיטה זו שוברת את דפנות התאים הסיליקטיים של דיאטומים על ידי הוספת חרוזי זכוכית וקביעת זמן מתאים למערבולת. בדרך זו, פרוטאינאז K ותמיסת הקישור מפעילים במהירות את התאים ומשביתים אנזימים שונים בתאים. הדנ"א הגנומי נספג בקרום המטריקס בעמודת הספיחה ולבסוף נמהל על ידי חיץ האלוציה. ערכת מיצוי גנים משופרת כזו משפרת את אפקט מיצוי ה- DNA הדיאטום של ערכת הדם בחומרי בדיקה משפטית, מפחיתה את עלות מיצוי ה- DNA הדיאטום בפרקטיקה המשפטית, וניתן ליישם אותה טוב יותר במחקר פורנזי עממי.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Binding Buffer</td>
			<td>BioTeke</td>
			<td>B010006022</td>
			<td>rapidly lysing cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemoHS qPCR Mix</td>
			<td>Monad</td>
			<td>00007547-120506</td>
			<td>qPCR Mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D2000 DNA ladder</td>
			<td>Real-Times(Beijing) Biotechnology</td>
			<td>RTM415</td>
			<td>Measure the position of electrophoretic bands</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D512</td>
			<td>Taihe Biotechnology</td>
			<td>TW21109196</td>
			<td>forword primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D978</td>
			<td>Taihe Biotechnology</td>
			<td>TW21109197</td>
			<td>reverse primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elution buffer</td>
			<td>BioTeke</td>
			<td>B010006022</td>
			<td>A low-salt elution buffer washes off the DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bead</td>
			<td>Yingxu Chemical Machinery(Shanghai)&#160;</td>
			<td>70181000</td>
			<td>Special glass beads for dispersing and grinding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Import adsorption column</td>
			<td>BioTeke</td>
			<td>B2008006022</td>
			<td>Adsorption column with silica matrix membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inhibitor Removal Buffer</td>
			<td>BioTeke</td>
			<td>B010006022</td>
			<td>Removal of Inhibitors in DNA Extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>BioTeke</td>
			<td>B010006022</td>
			<td>Precipitate or isolate DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIX-30S Mini Mixer</td>
			<td>Miulab</td>
			<td>MUC881206</td>
			<td>oscillatory action</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>BioTeke</td>
			<td>B010006022</td>
			<td>Inactivation of intracellular nucleases and other proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotor-Gene Q 5plex HRM</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>R1116175</td>
			<td>real-time fluorescence quantification PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Speed Micro-Centrifuge</td>
			<td>Scilogex</td>
			<td>9013001121</td>
			<td>centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tanon 3500R Gel Imager</td>
			<td>Tanon</td>
			<td>16T5553R-455</td>
			<td>gel imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq Mix Pro</td>
			<td>Monad</td>
			<td>00007808-140534</td>
			<td>PCR Mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Cycler</td>
			<td>Zhuhai Hema</td>
			<td>VRB020A</td>
			<td>ordinary PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash Buffer</td>
			<td>BioTeke</td>
			<td>B010006022</td>
			<td>Remove impurities such as cell metabolites</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extraction of diatom dna from water samples and tissues

בדיקת דיאטום היא אמצעי עזר חיוני בפרקטיקה המשפטית כדי לקבוע אם הגופה טבעה במים ולהסיק את מקום הטביעה. בדיקות דיאטום הן גם תוכן מחקרי חשוב בתחום הסביבה והפלנקטון. טכנולוגיית בדיקת הביולוגיה המולקולרית הדיאטומית, המתמקדת בדנ"א דיאטומי כאובייקט המחקר העיקרי, היא שיטה חדשה לבדיקת דיאאטומים. מיצוי DNA דיאטומי הוא הבסיס לבדיקה מולקולרית דיאאטומית. כיום, הערכות הנפוצות למיצוי DNA דיאטום הן יקרות, מה שמגדיל את עלות ביצוע המחקר הנלווה. המעבדה שלנו שיפרה את ערכת המיצוי המהירה הכללית של DNA גנומי בדם שלם והשיגה אפקט מיצוי DNA דיאטום משביע רצון, ובכך סיפקה פתרון חלופי, חסכוני ובמחיר סביר למיצוי DNA המבוסס על חרוזי זכוכית למחקר קשור. הדנ"א הדיאטום המופק באמצעות פרוטוקול זה יכול לספק יישומים רבים במורד הזרם, כגון PCR וריצוף.

In forensic practice, determining whether a corpse found in the water drowning or was thrown into the water after death is essential for the proper resolution of the case1. It is also one of the difficult issues that need to be solved urgently in forensic practice2. Diatoms are abundant in the natural environment (especially in water)3,4. In the process of drowning, due to hypoxia and stress response, people will have intense breathing movements and inhale a large amount of drowning liquid. Therefore, the diatoms in the water enter the lung with the drowning liquid, and some diatoms can enter the blood circulation through the alveolar-capillary barrier and spread to internal organs with the blood flow5,6. The detection of diatoms in internal tissues and organs such as lung, liver, and bone marrow is a strong evidence of drowning before death7,8. Currently, forensic diatom testing is mainly based on morphological testing methods. After a series of pre-digestion of the tissue, the morphological qualitative and quantitative estimations of undigested diatoms are carried out under the microscope. During this period, dangerous and environmentally unfriendly reagents such as nitric acid need to be used. This process is time-consuming and requires researchers to have solid taxonomic expertise and extensive experience. These all bring certain challenges to the forensic staff9. Diatom DNA testing technology is a new technology for diatom testing developed in recent years10,11,12. This technology realizes the species identification of diatoms by analyzing the specific DNA sequence composition of diatoms13,14. PCR technology and sequencing technology are commonly used technical methods, but their basis is the successful extraction of DNA from diatoms. However, diatoms have a special structure different from other organisms, making their DNA extraction techniques also different.
The cell wall of diatom has a high degree of silicification, and its main component is silicon dioxide15,16,17. The siliceous cell wall is very hard, and it must be destroyed before extract the DNA. Ordinary DNA extraction kits are often difficult to use directly for the extraction of diatom DNA because they cannot destroy the siliceous shell of diatoms18. Therefore, destroying the siliceous shell of diatoms is one of the key technical problems to be solved in extracting diatom DNA.
At the same time, since the number of diatoms contained in forensic research samples, whether water samples or organs and tissues of drowned bodies, is often limited, it is necessary to enrich diatoms. The essence of enrichment is the separation of substances. While trying to gather diatoms together, minimize the content of other material components (interfering components). In forensic work, laboratories often use centrifugation or membrane filtration enrichment methods to separate diatom cells19. However, since vacuum pumping equipment is not widely used, the membrane enrichment method is not often used in ordinary primary forensic laboratories. So, the centrifugation method is still commonly diatom enrichment in forensic laboratories20.
DNA extraction from diatoms is currently used primarily in forensic practice, and there are significant limitations to its application. At present, there are few diatom DNA extraction kits used in forensic science on the market and they are generally expensive21. This article provides an improved diatom DNA extraction method, making diatom DNA extraction simple, convenient and cost effective. This increases the application of subsequent molecular biology testing of diatoms and can better solve problems related to drowning in forensic medicine through diatom testing. This method breaks the siliceous cell walls of diatoms by adding glass beads and setting an appropriate time for vortex. In this way, the proteinase K and the binding solution rapidly lyse the cells and inactivate various enzymes in the cells. The genomic DNA is absorbed in the matrix membrane in the adsorption column and finally eluted by the elution buffer. Such an improved whole blood gene extraction kit improves the diatom DNA extraction effect of the blood kit in forensic examination materials, reduces the cost of diatom DNA extraction in forensic practice, and can be better applied to grassroot forensic research.

מחבר זרקור: בדיקות דיאטום לבדיקת טביעה משפטית 

מיצוי DNA דיאטום מדגימות מים ורקמות

Our research mainly focus on the topic of drowning. We wanted to answer the question of whether the body found in the water died from drowning, as well to answer another question of where the person fell into the water. That means to know the location of the drowning.Compared with other technologies, we provide a simple, convenient, and economical diatom DNA extraction protocol that we can use better in forensic research, especially in basic forensic practice. Our laboratory will further focus on the drowning related problems based on the pattern in the water, such as reason of death, post mortem interval and so on. What's more, we also carry on the research through the forensic entomology and a some special phenomenons in the tropical forensic medicines.

מכיוון שתמיסת הדנ"א המופקת בשיטת מיצוי הדנ"א הנהוגה כיום מכילה את כל רכיבי הדנ"א ממקורות שונים בדגימה, הדנ"א המתקבל בפרוטוקול זה לא היה יוצא מן הכלל. לכן, פתרון הדנ"א לא היה רק פתרון של דנ"א גנומי דיאטומי. הפריימרים שיכולים להגביר באופן ספציפי מקטעי rDNA diatom 18S נבחרו על ידי עיון בספרות 22,23,24.<sup clas...

Watch this Scientific Journal Video about Diatom Testing for Forensic Drowning Examination at JoVE.com

מאמר זה מתאר פרוטוקול למיצוי DNA דיאטומי באמצעות ערכת מיצוי DNA משותפת שונה.

Diatom testing is an essential auxiliary means in forensic practice to determine whether the corpse drowned in water and to infer the drowning location. ...

המחקר שלנו מתמקד בעיקר בנושא הטביעה. רצינו לענות על השאלה האם הגופה שנמצאה במים מתה מטביעה, וגם לענות על שאלה אחרת היכן האדם נפל למים. כלומר, לדעת את מיקום הטביעה.בהשוואה לטכנולוגיות אחרות, אנו מספקים פרוטוקול מיצוי DNA דיאטום פשוט, נוח וחסכוני שנוכל להשתמש בו טוב יותר במחקר פורנזי, במיוחד בפרקטיקה משפטית בסיסית. המעבדה שלנו תתמקד עוד יותר בבעיות הקשורות לטביעה בהתבסס על הדפוס במים, כגון סיבת המוות, מרווח לאחר המוות וכן הלאה. יתר על כן, אנו גם ממשיכים את המחקר באמצעות אנטומולוגיה משפטית וכמה תופעות מיוחדות בתרופות המשפטיות הטרופיות.

extraction-of-diatom-dna-from-water-samples-and-tissues

Research

JoVE Journal

Medicine

Extraction of Diatom DNA from Water Samples and Tissues

1.4K Views.  Hainan Medical University, Hainan Provincial Academician Workstation (tropical forensic medicine). המחקר שלנו מתמקד בעיקר בנושא הטביעה. רצינו לענות על השאלה האם הגופה שנמצאה במים מתה מטביעה, וגם לענות על שאלה אחרת היכן האדם נפל למים. כלומר, לדעת את מיקום הטביעה.בהשוואה לטכנולוגיות אחרות, אנו מספקים פרוטוקול מיצוי DNA דיאטום פשוט, נוח וחסכוני שנוכל להשתמש בו טוב יותר במח...

Video: מחבר זרקור: בדיקות דיאטום לבדיקת טביעה משפטית 

Diatom testing is an essential auxiliary means in forensic practice to determine whether the corpse drowned in water and to infer the drowning location. Diatom testing is also an important research content in the field of the environment and plankton. The diatom molecular biology testing technology, which focuses on diatom DNA as the primary research object, is a new method of diatom testing. Diatom DNA extraction is the basis of diatom molecular testing. At present, the kits commonly used for diatom DNA extraction are expensive, which increases the cost of carrying out related research. Our laboratory improved the general whole blood genomic DNA rapid extraction kit and obtained a satisfactory diatom DNA extraction effect, thus providing an alternative economical and affordable DNA extraction solution based on glass beads for related research. The diatom DNA extracted using this protocol could satisfy many downstream applications, such as PCR and sequencing.

This article describes a protocol for diatom DNA extraction using a modified common DNA extraction kit.

Diatom DNA Extraction from Water Sample and Human Lung Tissue Using a Modified DNA Extraction Kit

To begin, take 10 milliliters of the diatom water sample in a centrifuge tube. Centrifuge the tube at 13, 400 G for five minutes. With a pipette gun, carefully discard 9.8 milliliters of the supernatant.Then transfer 200 microliters of the enriched diatom water sample into a two-milliliter centrifuge tube. Next, take 0.5 grams of lung margin tissue from a drowned human body. With scissors, cut the lung tissue until it becomes muddy.For DNA extraction off both diatom and lung samples, first add glass beads to both samples. After mixing the samples well, add 40 microliters of proteinase K to the tubes. After a 15-minute incubation at room temperature, add 200 microliters of binding buffer to both tubes.Immediately mix the samples with a vortex mixer for four minutes. Then place the tubes in a water bath at 70 degrees Celsius for 10 minutes. until the solution becomes clear.Next, transfer the clear solution with flocculent precipitate. into a three-centimeter long adsorption column packed with silicon matrix. Centrifuge the column at 8, 000 G for 30 seconds.Then discard the waste liquid in the collection tube and put the column back into the collection tube. Now add 500 microliters of the inhibitor removal buffer into the column and centrifuge at 13, 400 G for 30 seconds. After discarding the waste liquid, add 700 microliters of the washing buffer to the column and centrifuge again.After discarding the waste liquid, place the adsorption column back into the empty collection tube. Centrifuge the column at 14, 500 G for two minutes to remove as much wash buffer as possible. Now take the column out and place it in a clean centrifuge tube.Add 100 microliters of elution buffer to the middle part of the adsorption membrane. Centrifuge the column at 13, 400 G for one minute after a five-minute incubation at room temperature. Transfer the solution obtained in the collection tube back into the adsorption column before centrifuging again.Store the eluted diatom DNA at two to eight degrees Celsius for future use. Agarose gel electrophoresis showed diatom DNA bands between 250 to 500 BP in both water samples and tissues after PCR amplification.