Diese Arbeit wird von der National Natural Science Foundation of China (82060341,81560304) und dem Academician Innovation Platform Scientific Research Project der Provinz Hainan (YSPTZX202134) unterstützt.

Diese Studie wurde von der Ethikkommission der Hainan Medical University genehmigt. Die in dieser Studie verwendeten Gewebeproben gelten nicht als Studien mit menschlichen Probanden. Diese Proben wurden für die forensische pathologische Diagnose gewonnen, der Rest wurde für die Extraktion von Kieselalgen-DNA in diesem Experiment verwendet. Forscher können nicht ohne weiteres Personen identifizieren, um die informierte Zustimmung der relevanten Interessengruppen einzuholen.
HINWEIS: Um die allgemeine Anwendbarkeit der in diesem Experiment berichteten Forschungsmethode zu gewährleisten, folgte dieses Experiment im Wesentlichen der Bedienungsanleitung des verwendeten Kits, und es wurden nur einige Schritte geändert. Die in diesem Experiment verwendeten Wasserproben wurden nach dem Zufallsprinzip aus Teichen in der Nähe des Labors entnommen (Ergänzende Abbildung 1A). In diesem Experiment wurde das Lungengewebe des ertrunkenen Körpers als Forschungsgewebe bestätigt, um das Extraktionsprotokoll zu demonstrieren (Ergänzende Abbildung 1B). In der forensischen Praxis ist es manchmal auch notwendig, andere Organe und Gewebe von ertrunkenen Körpern (wie Leber, Milz, Niere, Knochenmark usw.) zu verwenden, um die DNA von Kieselalgen zu extrahieren, was geringfügige entsprechende Verbesserungen dieser experimentellen Methode erfordert, die im entsprechenden Abschnitt des Experiments erläutert werden. Die in diesem Experiment verwendeten Lungengewebeproben stammten von Leichen, die eindeutig in forensischen Fällen ertrunken waren. Es wurden morphologische Tests durchgeführt, um nachzuweisen, dass das Lungengewebe Kieselalgen enthält (Ergänzende Abbildung 2).
1. Vorbehandlung der Proben
<ol><li>Vorbehandlung von Wasserproben<ol><li>Nehmen Sie 10 ml Wasserprobe in das Zentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie es 5 Minuten lang bei 13.400 x g . 9,8 ml Überstand vorsichtig mit einer Pipettenpistole entsorgen und etwa 200 μl angereicherte Kieselalgenwasserprobe, die am Boden verbleibt, in ein 2-ml-Zentrifugenröhrchen überführen. HINWEIS: Zuerst kann ein Vorexperiment durchgeführt werden, und die Anfangsmenge kann erhöht werden, wenn eine 10-ml-Wasserprobe für die Anreicherung nicht ausreicht.</li>
	</ol></li>
	<li>Vorbehandlung von Gewebeproben<ol><li>Entnehmen Sie 0,5 g des Lungenrandgewebes aus dem ertrunkenen Körper, hacken oder zerkleinern Sie das Lungengewebe vollständig, bis es schlammig wird. Die Verhinderung der Kontamination von exogenen Kieselalgen ist der Kern dieses Schritts. Schneiden Sie das Gewebe wiederholt mit einer Schere in Stücke.</li>
	</ol></li>
</ol>2. DNA-Extraktion
HINWEIS: Alle Zentrifugationsschritte werden bei Raumtemperatur durchgeführt. Verwendung einer Tischzentrifuge mit einer Zentrifugalkraft von 14.500 x g; Vor Beginn des Experiments muss ein auf 70 °C vorgeheiztes Wasserbad (oder Metallbad) vorbereitet werden. Alle Schritte müssen streng nach den Grundsätzen des aseptischen Betriebs erfolgen.
<ol><li>Zusammenstellung von Wasserproben und Geweben HINWEIS: Die DNA-Extraktionsmethode für Wasserproben und Gewebekieselalgen ist identisch.<ol><li>Glasperlen in ein 2-ml-Zentrifugenröhrchen geben, das die vorbehandelte Wasserprobe enthält. 10x-15x invertieren, um gut zu mischen. Die zugesetzten Glasperlen setzen sich aus großen und kleinen Glasperlen zusammen, die in einem Massenverhältnis von 1:1 gemischt sind. Der Durchmesser der großen Glasperlen beträgt 1,5-2,0 mm und der der kleinen Glasperlen 0,4-0,6 mm.</li>
		<li>Nehmen Sie 0,5 g fein gehacktes Gewebe und geben Sie Glasperlen in ein 2-ml-Zentrifugenröhrchen, das das Gewebe enthält, wie oben beschrieben. 10x-15x invertieren, um zu mischen.</li>
	</ol></li>
	<li>Geben Sie 40 μl Proteinase K (20 mg/ml) in die Röhrchen. 15 Minuten bei Raumtemperatur stellen, in dieser Zeit umdrehen und alle 3 Minuten 10x mischen. HINWEIS: Wenn das Gewebe nicht vollständig verdaut ist, kann die Menge an Proteinase K entsprechend erhöht werden, bis die Lösung klar wird.</li>
	<li>200 μl Bindepuffer in die Zentrifugenröhrchen geben, sofort vortexen und 4 min mischen (Oszillationsmischfrequenz: 3000 U/min). HINWEIS: In diesem Schritt sollten die Schüttelintensität und -zeit streng kontrolliert werden, um eine ausreichende Mischintensität und -zeit zu gewährleisten.</li>
	<li>Die Zentrifugenröhrchen für 10 min in ein 70 °C warmes Wasserbad geben, dann wird die Lösung klar.</li>
	<li>Geben Sie 100 μl Isopropanol in die Zentrifugenröhrchen, wirbeln Sie vor und mischen Sie 15 s lang, zu diesem Zeitpunkt kann es zu einer Ausfällung von Flockungsmitteln kommen. HINWEIS: Es ist sehr wichtig, in den oben genannten Operationsschritten gut mit entsprechender Stärke zu mischen, aber starkes Schütteln sollte vermieden werden, um DNA-Scherungen zu vermeiden.</li>
	<li>Die im vorherigen Schritt erhaltene Lösung wird zusammen mit dem Flockungsmittelniederschlag in die Adsorptionskolonne gegeben (die Adsorptionssäule wird in das Sammelröhrchen gestellt). Die Länge der Adsorptionssäule beträgt 3,0 cm, der Durchmesser 1,0 cm und die Adsorptionsmatrix ist eine Siliziummatrixmembran.</li>
	<li>Bei 8.000 x g 30 s zentrifugieren, die Abfallflüssigkeit im Sammelröhrchen entsorgen und die Adsorptionssäule wieder in das Sammelröhrchen einsetzen.</li>
	<li>500 μl Inhibitorentfernungspuffer in die Adsorptionssäule geben. Bei 13.400 x g 30 s zentrifugieren und die Abfallflüssigkeit im Sammelröhrchen entsorgen.</li>
	<li>700 μl Waschpuffer in die Adsorptionssäule geben. Bei 13.400 x g 30 s zentrifugieren und die Abfallflüssigkeit im Sammelröhrchen entsorgen. HINWEIS: Geben Sie vor dem ersten Gebrauch die angegebene Menge an absolutem Ethanol in die Waschpufferflasche.</li>
	<li>500 μl Waschpuffer in die Adsorptionssäule geben. Bei 13.400 x g 30 s zentrifugieren und die Abfallflüssigkeit im Sammelröhrchen entsorgen.</li>
	<li>Setzen Sie die Adsorptionssäule wieder in das leere Sammelröhrchen ein. Bei 14.500 x g für 2 min zentrifugieren und den Waschpuffer so weit wie möglich entfernen, um zu vermeiden, dass das restliche Ethanol im Waschpuffer nachgeschaltete Reaktionen hemmt.</li>
	<li>Nehmen Sie die Adsorptionssäule heraus und geben Sie sie in ein sauberes Zentrifugenröhrchen. Geben Sie 100 μl Elutionspuffer in den mittleren Teil der Adsorptionsmembran.</li>
	<li>Die Adsorptionssäule wird für 3-5 Minuten bei Raumtemperatur platziert und 1 Minute lang bei 13.400 x g zentrifugiert.</li>
	<li>Die im vorherigen Schritt erhaltene Lösung wird wieder in die zentrifugale Adsorptionskolonne gegeben. Die Zentrifugaladsorptionssäule wird 2 min lang bei Raumtemperatur und 1 min bei 13.400 x g zentrifugiert. HINWEIS: Der Elutionspuffer sollte in einem 70 °C warmen Wasserbad für ca. 10 min vorgewärmt werden. Das Elutionsvolumen sollte nicht weniger als 50 μl betragen; Andernfalls wird die DNA-Ausbeute reduziert.</li>
	<li>Lagern Sie die extrahierte Kieselalgen-DNA für die zukünftige Verwendung bei 2-8 °C. Wenn die DNA-Lösung längere Zeit gelagert werden soll, lagern Sie sie bei -20 °C.</li>
</ol>3. PCR-Test
HINWEIS: Da der Gehalt an Kieselalgen in forensischen Proben oft gering ist, können die Gewebeprobenextrakte der ertrunkenen Leichen auch unterschiedlich starke Gewebe und Organe (wie z.B. die Lunge in diesem Experiment) mit eigener DNA enthalten. Daher spiegelt der direkte Nachweis der Gesamt-DNA in DNA-Extrakten nicht die Situation der Kieselalgen-DNA-Extraktion wider. In diesem Experiment wurden Diatomeen-spezifische Primer ausgewählt und PCR-Produkte verwendet, um die Diatomeen-DNA-Extraktion im Extrakt zu bewerten. Die Produkte können durch Agarose-Gelelektrophorese beobachtet und analysiert werden und können auch durch eine quantitative Echtzeit-Fluoreszenz-PCR-Schmelzkurve analysiert werden, die eine höhere Empfindlichkeit aufweist.
<ol><li>Fügen Sie 2 μl der extrahierten DNA aus Wasserproben und Geweben als Vorlage hinzu. Wählen Sie eine der beiden folgenden Inspektionsmethoden aus.</li>
	<li>Konventioneller PCR-Test<ol><li>Verwenden Sie Primer22 , die Kieselalgen-18S-rDNA-Fragmente spezifisch amplifizieren können. Weitere Informationen finden Sie in Tabelle 1.</li>
		<li>Legen Sie das PCR-Reaktionssystem und die Amplifikationsbedingungen entsprechend den Eigenschaften der Primer fest. Weitere Informationen finden Sie in Tabelle 2.</li>
		<li>Führen Sie die Produkte der PCR-Amplifikation auf 2%igem Agarose-Gel aus. Beobachten und analysieren Sie die Bildgebung mit einem Gel-Imager.</li>
	</ol></li>
	<li>Fluoreszierender quantitativer PCR-Test<ol><li>Verwenden Sie die oben genannten Primer, die Diatomeen-18S-rDNA-Fragmente spezifisch amplifizieren können, um ein quantitatives Echtzeit-Fluoreszenz-PCR-Reaktionssystem herzustellen. Weitere Informationen finden Sie in Tabelle 3.</li>
		<li>Führen Sie eine PCR-Amplifikation durch und analysieren Sie die erhaltene Amplifikationskurve und die Ct-Werte. Stellen Sie gleichzeitig ein Programm ein, schmelzen Sie die Doppelstränge der amplifizierten Produkte schrittweise durch fluoreszierende quantitative PCR-Schmelzkurventechnologie in Einzelstränge und analysieren Sie dann die erhaltenen Schmelzkurven.</li>
	</ol></li>
</ol>

Wirtschaftliche Extraktion von Kieselalgen-DNA mit einem modifizierten Kit

<ol>
	<li>Liu, C., Cong, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+and+prospect+of+diagnosis+of+drowning+deaths+in+water.">Review and prospect of diagnosis of drowning deaths in water.</a> Fa Yi Xue Za Zhi. 38 (1), 3-13 (2022).</li><li>Frisoni, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forensic+diagnosis+of+freshwater+or+saltwater+drowning+using+the+marker+aquaporin+5:+An+immunohistochemical+study.">Forensic diagnosis of freshwater or saltwater drowning using the marker aquaporin 5: An immunohistochemical study.</a> Medicina (Kaunas). 58 (10), 1458 (2022).</li><li>Mann, D. G., Vanormelingen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+inordinate+fondness?+The+number,+distributions,+and+origins+of+diatom+species.">An inordinate fondness? The number, distributions, and origins of diatom species.</a> J Eukaryot Microbiol. 60 (4), 414-420 (2013).</li><li>Pfister, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Terrestrial+diatoms+as+tracers+in+catchment+hydrology:+a+review.">Terrestrial diatoms as tracers in catchment hydrology: a review.</a> WIREs Water. 4, 1241 (2017).</li><li>Yu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+automated+diatom+detection+method+based+on+YOLOv5+framework+and+its+preliminary+study+for+taxonomy+recognition+in+the+forensic+diatom+test.">An improved automated diatom detection method based on YOLOv5 framework and its preliminary study for taxonomy recognition in the forensic diatom test.</a> Front Microbiol. 13, 963059 (2022).</li><li>Zhang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+length+and+width+of+diatoms+in+drowning+cases+as+the+evidence+of+diatoms+penetrating+the+alveoli-capillary+barrier.">The length and width of diatoms in drowning cases as the evidence of diatoms penetrating the alveoli-capillary barrier.</a> Int J Legal Med. 134 (3), 1037-1042 (2020).</li><li>Kihara, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+water+injection+into+lungs+using+an+animal+model:+Verification+of+the+diatom+concentration+test+to+diagnose+drowning.">Experimental water injection into lungs using an animal model: Verification of the diatom concentration test to diagnose drowning.</a> Forensic Sci Int. 327, 110983 (2021).</li><li>Shen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+false-positive+results+of+diatom+test+in+the+diagnosis+of+drowning-would+not+be+an+impediment.">Analysis of false-positive results of diatom test in the diagnosis of drowning-would not be an impediment.</a> Int J Legal Med. 133 (6), 1819-1824 (2019).</li><li>Manoylov, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taxonomic+identification+of+algae+(morphological+and+molecular):+species+concepts,+methodologies,+and+their+implications+for+ecological+bioassessment.">Taxonomic identification of algae (morphological and molecular): species concepts, methodologies, and their implications for ecological bioassessment.</a> J Phycol. 50 (3), 409-424 (2014).</li><li>Uchiyama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+molecular+approach+to+help+conclude+drowning+as+a+cause+of+death:+simultaneous+detection+of+eight+bacterioplankton+species+using+real-time+PCR+assays+with+TaqMan+probes.">A new molecular approach to help conclude drowning as a cause of death: simultaneous detection of eight bacterioplankton species using real-time PCR assays with TaqMan probes.</a> Forensic Sci Int. 222 (1-3), 11-26 (2012).</li><li>Kakizaki, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+diverse+aquatic+microbes+in+blood+and+organs+of+drowning+victims:+first+metagenomic+approach+using+high-throughput+454-pyrosequencing.">Detection of diverse aquatic microbes in blood and organs of drowning victims: first metagenomic approach using high-throughput 454-pyrosequencing.</a> Forensic Sci Int. 220 (1-3), 135-146 (2012).</li><li>Cai, J., Wang, B., Chen, J. H., Deng, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+Progress+of+High-Throughput+Sequencing+Technology+in+Forensic+Diatom+Detection.">Application Progress of High-Throughput Sequencing Technology in Forensic Diatom Detection.</a> Fa Yi Xue Za Zhi. 38 (1), 20-30 (2022).</li><li>Xiao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+application+of+a+multiplex+PCR+system+for+drowning+diagnosis.">Development and application of a multiplex PCR system for drowning diagnosis.</a> Electrophoresis. 42 (11), 1270-1278 (2021).</li><li>Yarimizu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+absolute+quantification+method+for+ribosomal+RNA+gene+copy+numbers+per+eukaryotic+single+cell+by+digital+PCR.">Development of an absolute quantification method for ribosomal RNA gene copy numbers per eukaryotic single cell by digital PCR.</a> Harmful Algae. 103, 102008 (2021).</li><li>Dalgic, A. D., Atila, D., Karatas, A., Tezcaner, A., Keskin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diatom+shell+incorporated+PHBV/PCL-pullulan+co-electrospun+scaffold+for+bone+tissue+engineering.">Diatom shell incorporated PHBV/PCL-pullulan co-electrospun scaffold for bone tissue engineering.</a> Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 100, 735-746 (2019).</li><li>Malviya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+global+diatom+distribution+and+diversity+in+the+world's+ocean.">Insights into global diatom distribution and diversity in the world's ocean.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (11), 1516-1525 (2016).</li><li>Brunner, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+studies+of+silica+biomineralization:+towards+an+understanding+of+silica+processing+by+diatoms.">Analytical studies of silica biomineralization: towards an understanding of silica processing by diatoms.</a> Appl Microbiol Biotechnol. 84 (4), 607-616 (2009).</li><li>Annunziata, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimised+method+for+intact+nuclei+isolation+from+diatoms.">An optimised method for intact nuclei isolation from diatoms.</a> Sci Rep. 11 (1), 1681 (2021).</li><li>Zhao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+diagnostic+value+of+quantitative+assessment+of+diatom+test+for+drowning:+An+analysis+of+128+water-related+death+cases+using+microwave+digestion-vacuum+filtration-automated+scanning+electron+microscopy.">The diagnostic value of quantitative assessment of diatom test for drowning: An analysis of 128 water-related death cases using microwave digestion-vacuum filtration-automated scanning electron microscopy.</a> J Forensic Sci. 62 (6), 1638-1642 (2017).</li><li>Zhao, J., Liu, C., Hu, S., He, S., Lu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microwave+digestion-vacuum+filtration-automated+scanning+electron+microscopy+as+a+sensitive+method+for+forensic+diatom+test.">Microwave digestion-vacuum filtration-automated scanning electron microscopy as a sensitive method for forensic diatom test.</a> Int J Legal Med. 127 (2), 459-463 (2013).</li><li>Cai, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+glass+bead-vortex+oscillation+method+for+DNA+extraction+from+diatom.">Improved glass bead-vortex oscillation method for DNA extraction from diatom.</a> Fa Yi Xue Za Zhi. 38 (1), 119-126 (2022).</li><li>Zimmermann, J., Jahn, R., Gemeinholzer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Barcoding+diatoms:+evaluation+of+the+V4+subregion+on+the+18S+rRNA+gene,+including+new+primers+and+protocols.">Barcoding diatoms: evaluation of the V4 subregion on the 18S rRNA gene, including new primers and protocols.</a> Org Divers Evol. 11 (3), 173-192 (2011).</li><li>Vinayak, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chloroplast+gene+markers+detect+diatom+DNA+in+a+drowned+mice+establishing+drowning+as+a+cause+of+death.">Chloroplast gene markers detect diatom DNA in a drowned mice establishing drowning as a cause of death.</a> Electrophoresis. , (2020).</li><li>Plante, C. J., Hill-Spanik, K., Cook, M., Graham, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+and+Spatial+Influences+on+Biogeography+and+Community+Structure+of+Saltmarsh+Benthic+Diatoms.">Environmental and Spatial Influences on Biogeography and Community Structure of Saltmarsh Benthic Diatoms.</a> Estuaries and Coasts. 44, 147-161 (2021).</li><li>Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real+time+quantitative+PCR.">Real time quantitative PCR.</a> Genome Res. 6 (10), 986-994 (1996).</li><li>Ben Amor, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+novel+TaqMan+qPCR+assay+for+rapid+detection+and+quantification+of+Gymnodinium+catenatum+for+application+to+harmful+algal+bloom+monitoring+in+coastal+areas+of+Tunisia.">Development of a novel TaqMan qPCR assay for rapid detection and quantification of Gymnodinium catenatum for application to harmful algal bloom monitoring in coastal areas of Tunisia.</a> Environ Sci Pollut Res Int. 29 (42), 63953-63963 (2022).</li><li>Doddaraju, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliable+and+early+diagnosis+of+bacterial+blight+in+pomegranate+caused+by+Xanthomonas+axonopodis+pv.+punicae+using+sensitive+PCR+techniques.">Reliable and early diagnosis of bacterial blight in pomegranate caused by Xanthomonas axonopodis pv. punicae using sensitive PCR techniques.</a> Sci Rep. 9 (1), 10097 (2019).</li><li>Lunetta, P., Miettinen, A., Spilling, K., Sajantila, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=False-positive+diatom+test:+a+real+challenge?+A+post-mortem+study+using+standardized+protocols.">False-positive diatom test: a real challenge? A post-mortem study using standardized protocols.</a> Leg Med (Tokyo). 15 (5), 229-234 (2013).</li><li>Marquesda Silva, J., Cruz, S., Cartaxana, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inorganic+carbon+availability+in+benthic+diatom+communities:+photosynthesis+and+migration.">Inorganic carbon availability in benthic diatom communities: photosynthesis and migration.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 372 (1728), 20160398 (2017).</li><li>Yu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+enzyme+digestion+time+on+the+detection+of+diatom+species.">The effect of enzyme digestion time on the detection of diatom species.</a> Pak J Pharm Sci. 27 (3 Suppl), 691-694 (2014).</li><li>Liu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diatom+DNA+barcodes+for+forensic+discrimination+of+drowning+incidents.">Diatom DNA barcodes for forensic discrimination of drowning incidents.</a> FEMS Microbiol Lett. 367 (17), 145 (2020).</li><li>Mizushima, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+novel+heart-specific+RING+finger+protein+207+is+involved+in+energy+metabolism+in+cardiomyocytes.">The novel heart-specific RING finger protein 207 is involved in energy metabolism in cardiomyocytes.</a> J Mol Cell Cardiol. 100, 43-53 (2016).</li><li>Zimmermann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taxonomic+reference+libraries+for+environmental+barcoding:+a+best+practice+example+from+diatom+research.">Taxonomic reference libraries for environmental barcoding: a best practice example from diatom research.</a> PLoS One. 9 (9), 108793 (2014).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Kieselalgenzellen sind durch harte kieselsäurehaltige Zellwände17 geschützt, und diese Struktur muss zerstört werden, um Kieselalgen-DNA zu extrahieren. Gewöhnliche Kits zerstören die kieselsäurehaltige Schale von Kieselalgen nicht leicht; Daher ist es schwierig, Diatomeen-DNA erfolgreich zu extrahieren21. Unser Labor hat das am häufigsten verwendete Blut-DNA-Extraktionskit verbessert, indem es Glasperlen mit unterschiedlichen Durchmessern und unterschiedlichen Mass...

In der forensischen Praxis ist die Feststellung, ob eine im Wasser gefundene Leiche ertrunken ist oder nach dem Tod ins Wasser geworfen wurde, für die ordnungsgemäße Lösung des Fallesunerlässlich 1. Es ist auch eines der schwierigen Themen, die in der forensischen Praxis dringend gelöst werden müssen2. Kieselalgen sind in der Natur (insbesondere im Wasser) reichlich vorhanden3,4. Während des Prozesses des Ertrinkens haben die Menschen aufgrund von Hypoxie und Stressreaktion intensive Atembewegungen und atmen eine große Menge Ertrinkungsflüssigkeit ein. Daher gelangen die Kieselalgen im Wasser mit der ertrinkenden Flüssigkeit in die Lunge, und einige Kieselalgen können durch die Alveolar-Kapillar-Barriere in den Blutkreislauf gelangen und sich mit dem Blutfluss auf innere Organe ausbreiten 5,6. Der Nachweis von Kieselalgen in inneren Geweben und Organen wie Lunge, Leber und Knochenmark ist ein starker Beweis für das Ertrinken vor dem Tod 7,8. Derzeit basiert die forensische Untersuchung von Kieselalgen hauptsächlich auf morphologischen Testmethoden. Nach einer Reihe von Vorverdauungen des Gewebes werden die morphologischen, qualitativen und quantitativen Schätzungen der unverdauten Kieselalgen unter dem Mikroskop durchgeführt. Während dieser Zeit müssen gefährliche und umweltschädliche Reagenzien wie Salpetersäure verwendet werden. Dieser Prozess ist zeitaufwändig und erfordert von den Forschern ein solides taxonomisches Fachwissen und umfangreiche Erfahrung. All dies stellt das forensische Personal vor gewisse Herausforderungen9. Die Diatomeen-DNA-Testtechnologie ist eine neue Technologie für Diatomeentests, die in den letzten Jahren entwickelt wurde 10,11,12. Diese Technologie realisiert die Speziesidentifikation von Kieselalgen durch Analyse der spezifischen DNA-Sequenzzusammensetzung von Kieselalgen13,14. Die PCR-Technologie und die Sequenzierungstechnologie sind häufig verwendete technische Methoden, deren Grundlage jedoch die erfolgreiche Extraktion von DNA aus Kieselalgen ist. Kieselalgen haben jedoch eine spezielle Struktur, die sich von anderen Organismen unterscheidet, wodurch sich auch ihre DNA-Extraktionstechniken unterscheiden.
Die Zellwand der Kieselalge weist einen hohen Verkieselungsgrad auf, und ihr Hauptbestandteil ist Siliziumdioxid 15,16,17. Die kieselsäurehaltige Zellwand ist sehr hart und muss zerstört werden, bevor die DNA extrahiert werden kann. Gewöhnliche DNA-Extraktionskits sind oft schwierig direkt für die Extraktion von Kieselalgen-DNA zu verwenden, da sie die kieselsäurehaltige Schale von Kieselalgen nicht zerstören können18. Daher ist die Zerstörung der kieselsäurehaltigen Schale von Kieselalgen eines der wichtigsten technischen Probleme, die bei der Extraktion von Kieselalgen-DNA gelöst werden müssen.
Da die Anzahl der Kieselalgen, die in forensischen Forschungsproben enthalten sind, seien es Wasserproben oder Organe und Gewebe von ertrunkenen Körpern, oft begrenzt ist, ist es gleichzeitig notwendig, Kieselalgen anzureichern. Das Wesen der Anreicherung ist die Trennung von Substanzen. Wenn Sie versuchen, Kieselalgen zu sammeln, minimieren Sie den Gehalt an anderen Materialkomponenten (störende Komponenten). Bei forensischen Arbeiten verwenden Laboratorien häufig Zentrifugations- oder Membranfiltrationsanreicherungsmethoden, um Diatomeenzellen zu trennen19. Da Vakuumpumpen jedoch nicht weit verbreitet sind, wird die Methode der Membrananreicherung in gewöhnlichen forensischen Primärlabors nicht häufig eingesetzt. Daher ist die Zentrifugationsmethode immer noch üblicherweise die Anreicherung von Kieselalgen in forensischen Laboratorien20.
Die DNA-Extraktion aus Kieselalgen wird derzeit vor allem in der forensischen Praxis eingesetzt, und es gibt erhebliche Einschränkungen bei ihrer Anwendung. Derzeit gibt es auf dem Markt nur wenige DNA-Extraktionskits für Kieselalgen, die in der Forensik verwendet werden, und sie sind im Allgemeinen teuer21. In diesem Artikel wird eine verbesserte Methode zur Extraktion von Kieselalgen-DNA vorgestellt, die die Extraktion von Kieselalgen-DNA einfach, bequem und kostengünstig macht. Dies erhöht die Anwendung der anschließenden molekularbiologischen Untersuchung von Kieselalgen und kann Probleme im Zusammenhang mit dem Ertrinken in der Gerichtsmedizin durch Kieselalgentests besser lösen. Diese Methode bricht die kieselsäurehaltigen Zellwände von Kieselalgen auf, indem Glasperlen hinzugefügt und eine geeignete Zeit für den Wirbel festgelegt wird. Auf diese Weise lysieren die Proteinase K und die Bindungslösung die Zellen schnell und inaktivieren verschiedene Enzyme in den Zellen. Die genomische DNA wird in der Matrixmembran in der Adsorptionssäule absorbiert und schließlich durch den Elutionspuffer eluiert. Ein solches verbessertes Vollblut-Genextraktionskit verbessert den Diatomeen-DNA-Extraktionseffekt des Blutkits in forensischen Untersuchungsmaterialien, reduziert die Kosten für die Diatomeen-DNA-Extraktion in der forensischen Praxis und kann besser auf die forensische Forschung an der Basis angewendet werden.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Binding Buffer</td>
			<td>BioTeke</td>
			<td>B010006022</td>
			<td>rapidly lysing cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemoHS qPCR Mix</td>
			<td>Monad</td>
			<td>00007547-120506</td>
			<td>qPCR Mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D2000 DNA ladder</td>
			<td>Real-Times(Beijing) Biotechnology</td>
			<td>RTM415</td>
			<td>Measure the position of electrophoretic bands</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D512</td>
			<td>Taihe Biotechnology</td>
			<td>TW21109196</td>
			<td>forword primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D978</td>
			<td>Taihe Biotechnology</td>
			<td>TW21109197</td>
			<td>reverse primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elution buffer</td>
			<td>BioTeke</td>
			<td>B010006022</td>
			<td>A low-salt elution buffer washes off the DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bead</td>
			<td>Yingxu Chemical Machinery(Shanghai)&#160;</td>
			<td>70181000</td>
			<td>Special glass beads for dispersing and grinding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Import adsorption column</td>
			<td>BioTeke</td>
			<td>B2008006022</td>
			<td>Adsorption column with silica matrix membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inhibitor Removal Buffer</td>
			<td>BioTeke</td>
			<td>B010006022</td>
			<td>Removal of Inhibitors in DNA Extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>BioTeke</td>
			<td>B010006022</td>
			<td>Precipitate or isolate DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIX-30S Mini Mixer</td>
			<td>Miulab</td>
			<td>MUC881206</td>
			<td>oscillatory action</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>BioTeke</td>
			<td>B010006022</td>
			<td>Inactivation of intracellular nucleases and other proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotor-Gene Q 5plex HRM</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>R1116175</td>
			<td>real-time fluorescence quantification PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Speed Micro-Centrifuge</td>
			<td>Scilogex</td>
			<td>9013001121</td>
			<td>centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tanon 3500R Gel Imager</td>
			<td>Tanon</td>
			<td>16T5553R-455</td>
			<td>gel imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq Mix Pro</td>
			<td>Monad</td>
			<td>00007808-140534</td>
			<td>PCR Mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Cycler</td>
			<td>Zhuhai Hema</td>
			<td>VRB020A</td>
			<td>ordinary PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash Buffer</td>
			<td>BioTeke</td>
			<td>B010006022</td>
			<td>Remove impurities such as cell metabolites</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extraction of diatom dna from water samples and tissues

Die Untersuchung von Kieselalgen ist ein wesentliches Hilfsmittel in der forensischen Praxis, um festzustellen, ob die Leiche im Wasser ertrunken ist, und um auf den Ertrinkungsort zu schließen. Auch im Bereich Umwelt und Plankton ist die Untersuchung von Kieselalgen ein wichtiger Forschungsinhalt. Die molekularbiologische Testtechnologie für Kieselalgen, die sich auf die Kieselalgen-DNA als primäres Forschungsobjekt konzentriert, ist eine neue Methode der Kieselalgen-Testung. Die DNA-Extraktion von Kieselalgen ist die Grundlage für molekulare Tests von Kieselalgen. Derzeit sind die Kits, die üblicherweise für die DNA-Extraktion von Kieselalgen verwendet werden, teuer, was die Kosten für die Durchführung entsprechender Forschungen erhöht. Unser Labor hat das allgemeine Vollblut-Genom-DNA-Schnellextraktionskit verbessert und einen zufriedenstellenden DNA-Extraktionseffekt für Kieselalgen erzielt, wodurch eine alternative, wirtschaftliche und erschwingliche DNA-Extraktionslösung auf der Basis von Glasperlen für verwandte Forschungen bereitgestellt wird. Die mit diesem Protokoll extrahierte Diatomeen-DNA könnte viele nachgelagerte Anwendungen wie PCR und Sequenzierung erfüllen.

In forensic practice, determining whether a corpse found in the water drowning or was thrown into the water after death is essential for the proper resolution of the case1. It is also one of the difficult issues that need to be solved urgently in forensic practice2. Diatoms are abundant in the natural environment (especially in water)3,4. In the process of drowning, due to hypoxia and stress response, people will have intense breathing movements and inhale a large amount of drowning liquid. Therefore, the diatoms in the water enter the lung with the drowning liquid, and some diatoms can enter the blood circulation through the alveolar-capillary barrier and spread to internal organs with the blood flow5,6. The detection of diatoms in internal tissues and organs such as lung, liver, and bone marrow is a strong evidence of drowning before death7,8. Currently, forensic diatom testing is mainly based on morphological testing methods. After a series of pre-digestion of the tissue, the morphological qualitative and quantitative estimations of undigested diatoms are carried out under the microscope. During this period, dangerous and environmentally unfriendly reagents such as nitric acid need to be used. This process is time-consuming and requires researchers to have solid taxonomic expertise and extensive experience. These all bring certain challenges to the forensic staff9. Diatom DNA testing technology is a new technology for diatom testing developed in recent years10,11,12. This technology realizes the species identification of diatoms by analyzing the specific DNA sequence composition of diatoms13,14. PCR technology and sequencing technology are commonly used technical methods, but their basis is the successful extraction of DNA from diatoms. However, diatoms have a special structure different from other organisms, making their DNA extraction techniques also different.
The cell wall of diatom has a high degree of silicification, and its main component is silicon dioxide15,16,17. The siliceous cell wall is very hard, and it must be destroyed before extract the DNA. Ordinary DNA extraction kits are often difficult to use directly for the extraction of diatom DNA because they cannot destroy the siliceous shell of diatoms18. Therefore, destroying the siliceous shell of diatoms is one of the key technical problems to be solved in extracting diatom DNA.
At the same time, since the number of diatoms contained in forensic research samples, whether water samples or organs and tissues of drowned bodies, is often limited, it is necessary to enrich diatoms. The essence of enrichment is the separation of substances. While trying to gather diatoms together, minimize the content of other material components (interfering components). In forensic work, laboratories often use centrifugation or membrane filtration enrichment methods to separate diatom cells19. However, since vacuum pumping equipment is not widely used, the membrane enrichment method is not often used in ordinary primary forensic laboratories. So, the centrifugation method is still commonly diatom enrichment in forensic laboratories20.
DNA extraction from diatoms is currently used primarily in forensic practice, and there are significant limitations to its application. At present, there are few diatom DNA extraction kits used in forensic science on the market and they are generally expensive21. This article provides an improved diatom DNA extraction method, making diatom DNA extraction simple, convenient and cost effective. This increases the application of subsequent molecular biology testing of diatoms and can better solve problems related to drowning in forensic medicine through diatom testing. This method breaks the siliceous cell walls of diatoms by adding glass beads and setting an appropriate time for vortex. In this way, the proteinase K and the binding solution rapidly lyse the cells and inactivate various enzymes in the cells. The genomic DNA is absorbed in the matrix membrane in the adsorption column and finally eluted by the elution buffer. Such an improved whole blood gene extraction kit improves the diatom DNA extraction effect of the blood kit in forensic examination materials, reduces the cost of diatom DNA extraction in forensic practice, and can be better applied to grassroot forensic research.

Autor im Rampenlicht: Kieselalgen-Tests für forensische Ertrinkungsuntersuchungen 

Extraktion von Diatomeen-DNA aus Wasserproben und Geweben

Da die DNA-Lösung, die mit der derzeit verwendeten DNA-Extraktionsmethode extrahiert wird, alle DNA-Bestandteile aus verschiedenen Quellen in der Probe enthält, war die durch dieses Protokoll gewonnene DNA keine Ausnahme. Die DNA-Lösung war also nicht nur eine Lösung der genomischen DNA von Kieselalgen. Die Primer, die Diatomeen-18S-rDNA-Fragmente spezifisch amplifizieren können, wurden unter Konsultation der Literaturausgewählt 22,23,24.<sup cla...

Watch this Scientific Journal Video about Diatom Testing for Forensic Drowning Examination at JoVE.com

Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll für die DNA-Extraktion von Kieselalgen unter Verwendung eines modifizierten gemeinsamen DNA-Extraktionskits.

Diatom testing is an essential auxiliary means in forensic practice to determine whether the corpse drowned in water and to infer the drowning location. ...

Unsere Forschung konzentriert sich hauptsächlich auf das Thema Ertrinken. Wir wollten die Frage beantworten, ob die im Wasser gefundene Leiche durch Ertrinken gestorben ist, und auch eine andere Frage beantworten, wo die Person ins Wasser gefallen ist. Das bedeutet, den Ort des Ertrinkens zu kennen.Im Vergleich zu anderen Technologien bieten wir ein einfaches, bequemes und kostengünstiges DNA-Extraktionsprotokoll für Kieselalgen, das wir in der forensischen Forschung, insbesondere in der forensischen Grundlagenpraxis, besser einsetzen können. Unser Labor wird sich weiter auf die Probleme konzentrieren, die mit dem Ertrinken verbunden sind, basierend auf dem Muster im Wasser, wie z. B. Todesursache, Post-mortem-Intervall und so weiter. Darüber hinaus betreiben wir auch die Forschung durch die forensische Entomologie und einige spezielle Phänomene in der tropischen forensischen Medizin.

extraction-of-diatom-dna-from-water-samples-and-tissues

Research

JoVE Journal

Medicine

Extraction of Diatom DNA from Water Samples and Tissues

1.5K Aufrufe.  Hainan Medical University, Hainan Provincial Academician Workstation (tropical forensic medicine). Unsere Forschung konzentriert sich hauptsächlich auf das Thema Ertrinken. Wir wollten die Frage beantworten, ob die im Wasser gefundene Leiche durch Ertrinken gestorben ist, und auch eine andere Frage beantworten, wo die Person ins Wasser gefallen ist. Das bedeutet, den Ort des Ertrinkens zu kennen.Im Vergleich zu anderen Technologien bieten wir ein einfaches, bequemes und kostengünstiges DNA-Extraktionsprotokoll für Kieselalgen, das wir in der forensischen Forschung, insbesondere i...

Serie: Autor im Rampenlicht: Kieselalgen-Tests für forensische Ertrinkungsuntersuchungen 

Diatom testing is an essential auxiliary means in forensic practice to determine whether the corpse drowned in water and to infer the drowning location. Diatom testing is also an important research content in the field of the environment and plankton. The diatom molecular biology testing technology, which focuses on diatom DNA as the primary research object, is a new method of diatom testing. Diatom DNA extraction is the basis of diatom molecular testing. At present, the kits commonly used for diatom DNA extraction are expensive, which increases the cost of carrying out related research. Our laboratory improved the general whole blood genomic DNA rapid extraction kit and obtained a satisfactory diatom DNA extraction effect, thus providing an alternative economical and affordable DNA extraction solution based on glass beads for related research. The diatom DNA extracted using this protocol could satisfy many downstream applications, such as PCR and sequencing.

This article describes a protocol for diatom DNA extraction using a modified common DNA extraction kit.