Ces travaux ont été soutenus par une subvention à la découverte du Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada à AK. Les schémas utilisés dans les figures sont créés avec BioRender.com.

1. Préparation expérimentale
<ol><li>Purifier le plasmide pUC18T-mini-Tn7T-LAC-Gm9 (plasmide d’insertion, Figure 2A) avec le gène d’intérêt. NOTE : Ici, le gène d’intérêt est adeIJK. La concentration finale du plasmide doit être de ≥100 ng/μL.</li>
	<li>Purifier le plasmide auxiliaire (pTNS2)9 et le plasmide d’excision (pFLP2ab)6 (Figure 2B,C, respectivement), idéalement jusqu’à une concentration finale d’ADN plasmidique de ≥100 ng/μL.</li>
	<li>Préparez 50 mL d’eau stérile ultrapure et 25 mL de bouillon stérile LB (Lennox) (voir la table des matières).</li>
	<li>Préparez au moins 10 lb de gélose sur plaques, chacune contenant les additifs suivants : ordinaire (sans additifs), gentamicine (Gm) à 50 μg/mL, carbénicilline (Cb) à 200 μg/mL (pour la sélection par le gène de résistance à l’ampicilline) et saccharose à 5 % (voir le tableau des matières).</li>
	<li>Éplucher la souche à utiliser pour l’insertion sur la gélose LB et incuber à 37 °C pendant 16 à 18 h. Ici, A. baumannii AB258 est utilisé. REMARQUE : Ce protocole doit être effectué dans un environnement stérile autant que possible en utilisant un bec Bunsen sur la paillasse ou une enceinte de sécurité biologique. Tous les consommables (pointes de pipette, boucles d’inoculation, tubes de microfuge, etc.) doivent être stériles.</li>
</ol>2. Préparation de la culture
<ol><li>Inoculer une seule colonie d’A. baumannii AB258 dans 4 mL de bouillon LB dans un tube de culture stérile de 13 mL à l’aide d’une anse d’inoculation stérile ou d’un bâtonnet d’inoculation stérile en bois. REMARQUE : Une seule culture de 4 mL est utilisée pour un échantillon et un témoin. Augmentez le nombre de cultures en fonction du nombre d’échantillons nécessaires.</li>
	<li>Incuber une nuit à 37 °C en secouant (250 tr/min).</li>
	<li>Placer une bouteille d’eau distillée stérile (25-50 ml) à 4 °C pendant la nuit pour l’utiliser à l’étape 3.</li>
</ol>3. Préparation des cellules électrocompétentes
<ol><li>Placer tous les tubes de microfuge stériles de 1,5 mL (deux par culture) et les cuvettes d’électroporation stériles (deux par culture) sur de la glace (voir le tableau des matériaux). Gardez les échantillons sur de la glace autant que possible tout au long de la procédure.</li>
	<li>Placez la bouteille d’eau stérile conservée à 4 °C sur de la glace.</li>
	<li>Transvasez 1,5 mL de la culture bactérienne de nuit dans l’un des tubes de microfuge de 1,5 mL.</li>
	<li>Centrifuger à 13 000 x g pendant 2 min pour granuler les cellules. REMARQUE : La centrifugation devrait idéalement être effectuée à 4 °C, mais la centrifugation à température ambiante est acceptable et non préjudiciable.</li>
	<li>À l’aide d’une pipette de 1 ml, retirez tout le surnageant sans perturber la culot cellulaire.</li>
	<li>Ajouter 1,5 mL de culture bactérienne dans le même tube de microfuge. Centrifuger à 13 000 x g pendant 2 min, puis retirer tout le surnageant.</li>
	<li>Répétez l’étape 3.6 une dernière fois avec le 1 ml de culture restant.</li>
	<li>Ajouter 1 mL d’eau stérile glacée à la pastille cellulaire et remettre en suspension avec un pipetage doux jusqu’à ce que la pastille ne repose plus au fond du tube de la microfuge.</li>
	<li>Centrifuger les cellules remises en suspension à 13 000 x g pendant 2 min.</li>
	<li>Retirer délicatement le surnageant à l’aide d’une pipette de 1 mL. Ne versez pas le surnageant, en particulier dans les étapes de lavage suivantes, lorsque les cellules ont tendance à former des granulés moins compacts.</li>
	<li>Répétez cette étape de lavage avec de l’eau stérile glacée, étapes 3.8 à 3.10, deux fois de plus.</li>
	<li>Remettre délicatement en suspension la pastille cellulaire finale dans 200 μL d’eau stérile glacée.</li>
	<li>Transférer 100 μL de la suspension cellulaire finale dans le deuxième tube microfuge glacé de 1,5 mL. Cette deuxième aliquote deviendra le témoin négatif de l’électroporation. Conservez les échantillons de cellules sur de la glace.</li>
</ol>4. Électroporation
<ol><li>Préchauffer 1 mL de bouillon LB et une plaque de gélose LB + Gm50 (préparée à l’étape 1.4) pour chaque échantillon et témoin dans un incubateur statique réglé à 37 °C.</li>
	<li>Dans un volume combiné de 5 μL ou moins, ajouter 100 à 200 ng chacun du plasmide auxiliaire pTNS2 et du plasmide d’insertion pUC18T-mini-Tn7T-LAC-Gm-adeIJK à une aliquote de cellules électrocompétentes.</li>
	<li>Mélanger en tapotant doucement du bout des doigts pour assurer un mélange complet des plasmides avec les cellules électrocompétentes sans introduire de bulles.</li>
	<li>Ajouter un volume équivalent d’eau distillée stérile dans l’aliquote de la cellule témoin négative et mélanger doucement comme ci-dessus.</li>
	<li>Incuber les échantillons sur de la glace pendant 20 min.</li>
	<li>Transférez l’échantillon entier de la cellule dans une cuvette d’électroporation glacée, puis replacez la cuvette sur de la glace. Répétez l’opération pour l’échantillon négatif de la cellule témoin.</li>
	<li>Électroporez l’échantillon de cellule.<ol><li>Allumez l’électroporateur et réglez-le sur 2.0 kV (25 μF, 200 Ω) (voir Tableau des matériaux).</li>
		<li>Essuyez la surface de la cuvette avec un mouchoir en papier pour éliminer toute glace ou humidité adhérente.</li>
		<li>Insérez la cuvette dans l’électroporateur et délivrez le choc électrique.</li>
		<li>Ajouter immédiatement 0,9 ml de bouillon LB préchauffé dans les cellules de la cuvette et pipeter doucement de haut en bas pour mélanger les cellules avec le milieu.</li>
		<li>Transférez toute la suspension cellulaire dans un nouveau tube microfuge de 1,5 mL (température ambiante).</li>
		<li>Vérifiez la valeur de la constante de temps sur l’électroporateur ; Pour de meilleurs résultats, cette valeur doit être comprise entre 4 et 6.</li>
	</ol></li>
	<li>Répéter la procédure d’électroporation (étapes 4.7.1 à 4.7.6) pour l’échantillon de la cellule témoin négative.</li>
	<li>Incuber les échantillons électroporés à 37 °C pendant 1 h à 250 tr/min pour permettre la récupération des cellules.</li>
	<li>À l’aide d’un épandeur d’inoculation, étaler 100 μL de chaque échantillon de cellule électroporatée sur une plaque de gélose LB + Gm50 préchauffée.<ol><li>Centrifuger les échantillons restants à 13 000 x g pendant 2 min pour granuler les cellules.</li>
		<li>Après avoir retiré tout le surnageant à l’aide d’une pipette, remettre les cellules en suspension dans 100 μL de bouillon LB.</li>
		<li>Étaler chaque échantillon entier sur des plaques individuelles de gélose LB + Gm50 préchauffées. REMARQUE : L’efficacité de l’électroporation peut dépendre de la déformation. Lors de l’électroporation d’une souche pour la première fois, il peut être instructif de mettre en plaque différents volumes, voire dilutions, de l’échantillon d’électroporation pour s’assurer que les plaques résultantes ont des colonies isolées.</li>
	</ol></li>
	<li>Incuber les plaques à 37 °C pendant 16-18 h.</li>
</ol>5. Sélection des colonies transformées pour le criblage par PCR
<ol><li>Vérifiez les plaques d’électroporation. Le témoin négatif ne doit pas avoir de colonies ; l’échantillon doit avoir des colonies distinctes. NOTA : Les plaques contenant des colonies, à cette étape et à toutes les étapes ultérieures où des plaques de gélose contenant des colonies ou des plaques sont produites, peuvent être entreposées à 4 °C jusqu’à 3 jours avant d’être traitées.</li>
	<li>À l’aide de cure-dents stériles, prélevez jusqu’à 10 colonies individuelles dans les plaques de gélose LB + Gm50 et patchez-les sur une nouvelle plaque de gélose LB + Gm50 .</li>
	<li>Incuber les plaques à 37 °C pendant 16-18 h.</li>
</ol>6. Vérification de l’insertion chromosomique par PCR de colonie
<ol><li>Retirez les plaques de gélose LB + Gm50 contenant les colonies pansées de l’incubateur.</li>
	<li>À l’aide d’un cure-dent stérile ou d’une pointe de pipette stérile, prélever une petite portion (environ la taille d’une grande colonie) d’un timbre dans 20 μL d’eau distillée stérile dans un tube PCR de 0,2 mL ; Bien mélanger. L’échantillon d’eau doit devenir visiblement trouble lorsque les cellules sont libérées du cure-dent. Préparez un nombre illimité d’échantillons qui doivent être examinés, mais 6 devraient suffire.</li>
	<li>Incuber le tube PCR contenant la suspension bactérienne à 100 °C pendant 5 à 10 min.</li>
	<li>À l’aide d’une mini-centrifugeuse (voir tableau des matériaux), faites tourner l’échantillon à la vitesse maximale fixe pendant 2 min pour granuler les débris cellulaires.</li>
	<li>Transférez le surnageant dans un nouveau tube PCR de 0,2 mL et placez-le sur de la glace. Cet échantillon contient l’ADN matrice pour la réaction PCR. REMARQUE : Cet ADN matrice peut être conservé à -20 °C avant de procéder à la PCR.</li>
	<li>Préparer un mélange réactionnel par PCR contenant 1 tampon de polymérase, 200 μM de dNTP, 0,18 μM ABglmS2_F_New amorce directe, 0,18 μM Tn7R d’amorce inverse (tableau 1), 1 U d’ADN polymérase Taq et 1 μL d’ADN matrice préparé dans un volume total de 25 μL. Préparer un témoin sans matrice (NTC), comprenant tout sauf l’ADN matrice (voir le tableau des matériaux).</li>
	<li>Entrer les conditions de réaction dans un thermocycleur : 95 °C pendant 2 min ; 95 °C pendant 30 s, 49 °C pendant 30 s et 72 °C pendant 30 s pour un total de 35 cycles ; 72 °C pendant 10 min ; Maintien à 12 °C. Exécutez les échantillons.</li>
	<li>Après l’ajout d’un colorant de charge d’ADN à une concentration finale de 1x, chargez 10 μL de chaque réaction de PCR sur un gel d’agarose à 2 % et faites fonctionner à 80 V pendant 40 minutes. La taille d’amplicon prévue pour cette paire d’amorces est de 382 pb. Le NTC ne devrait pas avoir de bandes.</li>
	<li>Identifier les échantillons qui ont produit le produit PCR attendu. Préparez une plaque de stries sur des plaques de gélose LB + Gm50 à partir de l’un des patchs positifs à la PCR ; incuber à 37 °C pendant 16-18 h. L’objectif est de générer une plaque avec des colonies uniques pour la préparation d’un stock de glycérol afin de préserver cette souche marquée et comme point de départ pour créer une souche non marquée (décrite ci-dessous).</li>
</ol>7. Retrait du marqueur GmR à l’aide de pFLP2ab
<ol><li>Suivez la procédure mentionnée à l’étape 2 : Préparation de la culture. L’échantillon utilisé pour préparer la culture de nuit est une seule colonie à partir des plaques de gélose LB + Gm50 préparées pour générer des colonies discrètes à l’étape 6.9.</li>
	<li>Suivez la procédure mentionnée à l’étape 3 : Préparation des cellules électrocompétentes. Préparez les cellules de la culture de nuit pour l’électroporation.</li>
	<li>Suivez la procédure mentionnée à l’étape 4 : Électroporation. Ici, le plasmide à introduire dans les cellules est pFLP2ab (100-200 ng), qui va supprimer le gène de résistance à la gentamicine, flanquant le gène d’intérêt inséré chromosomiquement.</li>
	<li>Une fois que les cellules ont récupéré pendant 1 h (étape 4.9), étalez 100 μL de l’échantillon de cellule électroporée sur une plaque gélosée LB + Cb200 préchauffée (préparée à l’étape 1.4). Cette pression sélective garantit que seules les cellules hébergeant le plasmide d’excisionab pFLP2 se développeront.</li>
	<li>Incuber les plaques à 37 °C pendant 16-18 h.</li>
	<li>Vérifiez la plaque pour les colonies. La plaque de contrôle négative ne doit pas avoir de colonies ; la plaque d’échantillon de gélose LB + Cb200 doit avoir des colonies distinctes.</li>
	<li>À l’aide de cure-dents stériles, répartir jusqu’à 20 colonies isolées sur une plaque de gélose LB + Cb200 et une plaque de gélose LB + Gm50 .</li>
	<li>Incuber les plaques pendant 16-18 h à 37 °C.</li>
	<li>Vérifiez les plaques pour les patchs. Les clones qui se développent sur la plaque de gélose LB + Cb200 mais pas sur la plaque de gélose LB + Gm50 ont eu le gène de résistance à la gentamicine retiré de l’insert d’origine.</li>
	<li>Sélectionner les plaques résistantes à la carbénicilline et à la gentamicine susceptibles de s’étrier sur des plaques de gélose LB individuelles complétées par du saccharose à 5 % (p/v), ce qui force l’expulsion du plasmidepFLP2 ab de la bactérie. Choisissez jusqu’à 10 colonies.</li>
	<li>Incuber les plaques pendant 16-18 h à 37 °C.</li>
	<li>Vérifiez les plaques pour les colonies.</li>
	<li>Comme confirmation finale de la perte du plasmidepFLP2 ab , recouper 4 à 6 colonies isolées des plaques de saccharose à 5 % sur une plaque de gélose LB + Cb200 et une plaque de gélose LB.</li>
	<li>Incuber les plaques pendant 16-18 h à 37 °C.</li>
	<li>Choisissez un clone qui pousse sur la plaque de gélose LB et qui est sensible à la carbénicilline pour la préparation d’un stock de glycérol afin de préserver cette souche non marquée.<ol><li>La vérification génétique de la souche non marquée peut être effectuée par PCR de colonie (étape 6 : Vérification de l’insertion chromosomique par PCR de colonie) en utilisant les amorces qui ciblent le gène de résistance à la gentamicine.</li>
		<li>Préparer un mélange réactionnel par PCR contenant 1 tampon de polymérase, 200 μM de dNTP, 0,18 μM Gm_F amorce directe, 0,18 μM Gm_R amorce inverse (tableau 1), 1 U d’ADN polymérase Taq et 1 μL d’ADN matrice préparé dans un volume total de 25 μL. Préparer un témoin sans matrice (NTC) comprenant tout sauf l’ADN matrice, et un contrôle positif utilisant l’ADN de la souche marquée.</li>
		<li>Entrer les conditions de réaction dans un thermocycleur : 95 °C pendant 2 min ; 95 °C pendant 30 s, 50 °C pendant 30 s et 72 °C pendant 40 s pour un total de 35 cycles ; 72 °C pendant 10 min ; Maintien à 12 °C. Exécutez les échantillons.</li>
		<li>Après l’ajout d’un colorant de charge d’ADN à une concentration finale de 1x, charger 10 μL de chaque réaction PCR sur un gel d’agarose à 1 % et exécuter à 80 V pendant 40 min. La taille d’amplicon prévue pour cette paire d’amorces est de 525 pb. Le témoin positif doit avoir une seule bande ; les échantillons et le NTC ne doivent pas avoir de bandes.</li>
	</ol></li>
</ol>

Expression génique à copie unique pour la caractérisation de systèmes d’efflux de plusieurs médicaments

<ol>
	<li>Prioritization of pathogens to guide research, discovery, research and development of new antibiotics for drug-resistant bacterial infections, including tuberculosis. World Health Organization Available from: <a target="_blank" href="https://www.who.int/publications/i/item/WHO-EMP-IAU-2017.12">https://www.who.int/publications/i/item/WHO-EMP-IAU-2017.12</a> (2017)</li><li>Kornelsen, V., Kumar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+multidrug+resistance+efflux+pumps+in+Acinetobacter+spp.">Update on multidrug resistance efflux pumps in Acinetobacter spp.</a> Antimicrob Agents Chemother. 65 (7), e00514-00521 (2021).</li><li>Sykes, E. M., Deo, S., Kumar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+genetic+tools+for+Acinetobacter+baumannii.">Recent advances in genetic tools for Acinetobacter baumannii.</a> Front Genet. 11, 601380 (2020).</li><li>Kumar, A., Chua, K. L., Schweizer, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+regulated+expression+of+single-copy+efflux+pump+genes+in+a+surrogate+Pseudomonas+aeruginosa+strain:+identification+of+the+BpeEF-OprC+chloramphenicol+and+trimethoprim+efflux+pump+of+Burkholderia+pseudomallei+1026b.">Method for regulated expression of single-copy efflux pump genes in a surrogate Pseudomonas aeruginosa strain: identification of the BpeEF-OprC chloramphenicol and trimethoprim efflux pump of Burkholderia pseudomallei 1026b.</a> Antimicrob Agents Chemother. 50 (10), 3460-3463 (2006).</li><li>Kumar, A., Dalton, C., Cortez-Cordova, J., Schweizer, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mini-Tn7+vectors+as+genetic+tools+for+single+copy+gene+cloning+in+Acinetobacter+baumannii.">Mini-Tn7 vectors as genetic tools for single copy gene cloning in Acinetobacter baumannii.</a> J Microbiol Methods. 82 (3), 296-300 (2010).</li><li>Ducas-Mowchun, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next+generation+of+Tn7-based+single-copy+insertion+elements+for+use+in+multi-+and+pan-drug+resistant+strains+of+Acinetobacter+baumannii.">Next generation of Tn7-based single-copy insertion elements for use in multi- and pan-drug resistant strains of Acinetobacter baumannii.</a> Appl Environ Microbiol. 85 (11), e00066-00119 (2019).</li><li>Ducas-Mowchun, K., De Silva, P. M., Patidar, R., Schweizer, H. P., Kumar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tn7-based+single-copy+insertion+vectors+for+Acinetobacter+baumannii.">Tn7-based single-copy insertion vectors for Acinetobacter baumannii.</a> Methods Mol Biol. 1946, 135-150 (2019).</li><li>Schweizer, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+the+Saccharomyces+cerevisiae+Flp-FRT+system+in+bacterial+genetics.">Applications of the Saccharomyces cerevisiae Flp-FRT system in bacterial genetics.</a> J Mol Microbiol Biotechnol. 5 (2), 67-77 (2003).</li><li>Choi, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Tn7-based+broad-range+bacterial+cloning+and+expression+system.">A Tn7-based broad-range bacterial cloning and expression system.</a> Nat Methods. 2 (6), 443-448 (2005).</li><li>Choi, K. H., Schweizer, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mini-Tn7+insertion+in+bacteria+with+single+attTn7+sites:+example+Pseudomonas+aeruginosa.">Mini-Tn7 insertion in bacteria with single attTn7 sites: example Pseudomonas aeruginosa.</a> Nat Protoc. 1 (1), 153-161 (2006).</li><li>Kornelsen, V., Unger, M., Kumar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atorvastatin+does+not+display+an+antimicrobial+activity+on+its+own+nor+potentiates+the+activity+of+other+antibiotics+against+Acinetobacter+baumannii+ATCC+17978+or+A.+baumannii+AB030.">Atorvastatin does not display an antimicrobial activity on its own nor potentiates the activity of other antibiotics against Acinetobacter baumannii ATCC 17978 or A. baumannii AB030.</a> Access Microbiol. 3, 000288 (2021).</li><li>Reyrat, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Counterselectable+markers:+untapped+tools+for+bacterial+genetics+and+pathogenesis.">Counterselectable markers: untapped tools for bacterial genetics and pathogenesis.</a> Infect Immun. 66 (9), 4011-4017 (1998).</li><li>Gay, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positive+selection+procedure+for+entrapment+of+insertion+sequence+elements+in+gram-negative+bacteria.">Positive selection procedure for entrapment of insertion sequence elements in gram-negative bacteria.</a> J Bacteriol. 164, 918-921 (1985).</li><li>Kyriakidis, I., Vasileiou, E., Pana, Z. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tragiannidis,+Acinetobacter+baumannii+antibiotic+resistance+mechanisms.">Tragiannidis, Acinetobacter baumannii antibiotic resistance mechanisms.</a> Pathogens. 10 (3), 373 (2021).</li><li>Clinical and Laboratory Standards Institute. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performance+standards+for+antimicrobial+susceptibility+testing.">Performance standards for antimicrobial susceptibility testing.</a> CLSI Supplement M100., 31st edn. , (2021).</li><li>Dijkshoorn, L., Nemec, A., Seifert, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+increasing+threat+in+hospitals:+multidrug-resistant+Acinetobacter+baumannii.">An increasing threat in hospitals: multidrug-resistant Acinetobacter baumannii.</a> Nature Reviews Microbiology. 5, 939-951 (2007).</li><li>Yildirim, S., Thompson, M. 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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mini-Tn7+insertion+in+bacteria+with+multiple+glmS-linked+attTn7+sites:+example+Burkolderia+mallei+ATCC+2334.">Mini-Tn7 insertion in bacteria with multiple glmS-linked attTn7 sites: example Burkolderia mallei ATCC 2334.</a> Nat Protoc. 1 (1), 162-169 (2006).</li><li>Jittawuttipoka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mini-Tn7+vectors+as+genetic+tools+for+gene+cloning+at+a+single+copy+number+in+an+industrially+important+and+phytopathogenic+bacteria,+Xanthomonas+spp.">Mini-Tn7 vectors as genetic tools for gene cloning at a single copy number in an industrially important and phytopathogenic bacteria, Xanthomonas spp.</a> FEMS Microbiol Lett. 298 (1), 111-117 (2009).</li><li>P&#233;rez-Varela, M., Tierney, A. R. P., Kim, J. S., V&#225;zquez-Torres, A., Rather, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+RelA+in+Acinetobacter+baumannii.">Characterization of RelA in Acinetobacter baumannii.</a> J Bacteriol. 202 (12), e00045 (2020).</li><li>Williams, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Acinetobacter+baumannii+copper+resistance+reveals+a+role+in+virulence.">Characterization of Acinetobacter baumannii copper resistance reveals a role in virulence.</a> Front Microbiol. 11, 16 (2020).</li></ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Même si cette procédure d’insertion chromosomique d’un système d’expression génique inductible à copie unique chez A. baumannii est techniquement simple et ne demande pas beaucoup de travail, il y a quelques étapes importantes qui doivent être soulignées. Tout d’abord, la préparation des cellules compétentes doit se faire autant que possible sur de la glace car les cellules deviennent fragiles lors du remplacement du milieu par de l’eau glacée. Idéalement, les étapes de centrifugation sont...

Acinetobacter baumannii est un agent pathogène prioritaire de l’Organisation mondiale de la santé en raison de sa résistance globale à toutes les classes d’antibiotiques1. C’est un agent pathogène opportuniste qui touche principalement les personnes hospitalisées, blessées ou immunodéprimées. A. baumannii échappe en grande partie aux antibiotiques via des pompes à efflux, la plus pertinente étant la famille d’exportateurs Résistance-Nodulation-Division (RND)2. Comprendre comment ces pompes d’efflux fonctionnent mécaniquement permettra de développer des options thérapeutiques ciblées.
Une façon courante de distinguer spécifiquement les processus cellulaires est la manipulation génétique. Cependant, les outils disponibles pour les études génétiques d’A. baumannii sont limités et, pour compliquer davantage la conception expérimentale, les isolats cliniques sont souvent résistants aux antibiotiques couramment utilisés pour la sélection dans les manipulations génétiques3. Un deuxième obstacle rencontré lors de l’étude spécifique des pompes d’efflux est qu’elles sont strictement réglementées - souvent par des facteurs inconnus - ce qui rend difficile l’isolement et l’attribution précis de la fonction à une seule pompe4. Voyant ce besoin d’élargir la boîte à outils de recherche, nous avons développé un système d’expression inductible à base de mini-Tn7, à insertion d’une seule copie, qui intègre une cassette de cible de recombinase Flp (FRT), qui permet de supprimer le marqueur de sélection 5,6,7 (Figure 1). Créé à l’origine pour Pseudomonas 8,9,10, cet élégant système de clonage et d’expression a été utilisé pour générer des compléments de pompe d’efflux à copie unique dans une souche déficiente en pompe d’efflux RND d’A. baumannii (ATCC 17978 ::ΔadeIJK,Δ adeFGH,Δ adeAB : ci-après dénommée A. baumannii AB258) que nous avons générée11. En étant capable d’étudier une pompe d’efflux à la fois et de ne pas submerger les cellules bactériennes avec une expression à forte copie (comme on le voit généralement avec les systèmes d’expression à base de plasmides), on peut mieux connaître les aspects physiologiques critiques de chaque pompe d’efflux avec un minimum d’interférence et des complications réduites.
Cet article décrit comment utiliser le système mini-Tn7 pour compléter un gène d’intérêt supprimé, RND efflux pump adeIJK, dans le chromosome d’A. baumannii AB258 par une série d’étapes simples effectuées sur une période de 9 jours7. La première série d’étapes réintroduit les gènes de la pompe d’efflux supprimés clonés dans le plasmide d’insertion à base de mini-Tn7 (Figure 2A) au site d’insertion unique attTn7 en aval du gène glmS bien conservé (Figure 3A). Ce processus est facilité par un plasmide auxiliaire non réplicatif (Figure 2B) qui code pour les gènes de transposase nécessaires à l’insertion de Tn7. La deuxième série d’étapes utilise un plasmide d’excision (figure 2C) pour l’élimination médiée par la recombinase Flp du gène de la gentamicine flanquée de sites FRT (figure 3B) pour créer une souche non marquée. Bien que ce système soit utilisé pour élucider les rôles essentiels et les inhibiteurs possibles des pompes d’efflux RND en ce qui concerne la résistance aux antibiotiques, il peut être utilisé pour étudier n’importe quel gène d’intérêt.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 mL PCR tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20170-012</td>
			<td>For colony boil preparations and PCR reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microfuge tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72-690-301</td>
			<td>General use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13-mL culture tubes, Pyrex</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-957K</td>
			<td>Liquid culture vessels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6x DNA loading buffer</td>
			<td>Froggabio</td>
			<td>LD010</td>
			<td>Agarose gel electrophoresis sample loading dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid, glacial</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>351271-212</td>
			<td>Agarose gel running buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>AGR003</td>
			<td>Solid growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>BioBasic</td>
			<td>D0012</td>
			<td>Electrophoretic separation of PCR reaction products; used at a concentration of 0.8&#8211;2%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose gel electrophoresis unit</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>29-237-54</td>
			<td>Agarose gel electrophoresis; separation of PCR reaction products</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50841231</td>
			<td>Selective media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture tube closures</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-684-138</td>
			<td>Stainless steel closure for 13-mL culture tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxynucleotide triphosphate (dNTP) set</td>
			<td>Biobasic</td>
			<td>DD0058</td>
			<td>PCR reaction component; supplied as 100 mM each dATP, dCTP, dGTP, dTTP; mixed and diluted for 10 mM each dNTP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry bath/block heater</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>88860023</td>
			<td>Isotemp digital dry bath for boil preparations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation cuvettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89047-208</td>
			<td>2 mm electroporation cuvettes with round cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporator</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>940000009</td>
			<td>110 VAC, 60 Hz electroporator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP102-1</td>
			<td>Visualization of PCR reaction products and DNA marker in agarose gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CA-EM4050</td>
			<td>Agarose gel running buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Biobasic</td>
			<td>GB0217</td>
			<td>For the preparation of selective media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>G33</td>
			<td>Preparation of bacterial stocks for long-term storage in an ultra-low freezer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator (shaking)</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>M1352-0000</td>
			<td>Excella E24 Incubator Shaker for liquid culture growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator (static)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>11-690-550D</td>
			<td>Isotemp Incubator Oven Model 550D for solid (LB agar) culture growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inoculation loop</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>86.1562.050</td>
			<td>Streaking colonies onto agar plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inoculation spreader</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>86.1569.005</td>
			<td>Spreading of culture onto agar plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysogeny broth (LB) broth, Lennox</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1427</td>
			<td>Liquid growth media (20 g/L: 5 g/L sodium chloride, 10 g/L tryptone, 5 g/L yeast extract)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>75002431</td>
			<td>Sorvall Legend Micro 17 for centrifugation of samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-centrifuge</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S67601B</td>
			<td>Centrifugation of 0.2 mL PCR tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>SPL Life Sciences</td>
			<td>10090</td>
			<td>For solid growth media (agar plates): 90 x 15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes&#160;</td>
			<td>Mandel</td>
			<td>Various</td>
			<td>Gilson single channel pipettes (P10, P20, P200, P1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power supply</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1645050</td>
			<td>PowerPac Basic power supply for electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers</td>
			<td>IDT</td>
			<td>NA</td>
			<td>PCR reaction component; specific to gene of interest; prepared at 100 &#956;M as directed on the product specification sheet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>BioBasic</td>
			<td>SB0498</td>
			<td>For the preparation of counterselective media for removal of the pFLP2ab plasmid from transformed A. baumannii</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA polymerase</td>
			<td>FroggaBio</td>
			<td>T-500</td>
			<td>PCR reaction component; polymerase supplied with a 10x buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal cycler</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1861096</td>
			<td>Model T100 for PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toothpicks</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S24559</td>
			<td>For patching colonies onto agar plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1503</td>
			<td>Agarose gel running buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>ZLXLSD51040</td>
			<td>MilliQ water purification system: ultra pure water for media and solution preparation, and cell washing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wide range DNA marker</td>
			<td>Biobasic</td>
			<td>M103R-2</td>
			<td>Size determination of PCR products on an agarose gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wooden inoculating sticks</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>29-801-02</td>
			<td>Inoculating cultures with colonies from agar plates</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterizing multidrug efflux systems in acinetobacter baumannii using an efflux&#45;deficient bacterial strain and a single&#45;copy gene expression system

Acinetobacter baumannii est reconnu comme un agent pathogène à Gram négatif difficile en raison de sa résistance généralisée aux antibiotiques. Il est crucial de comprendre les mécanismes à l’origine de cette résistance pour concevoir de nouvelles options thérapeutiques efficaces. Malheureusement, notre capacité à étudier ces mécanismes chez A. baumannii est entravée par le manque d’outils de manipulation génétique appropriés. Ici, nous décrivons des méthodes d’utilisation d’un système chromosomique à base de mini-Tn7 pour obtenir l’expression génique d’une seule copie dans une souche d’A. baumannii dépourvue de mécanismes d’efflux fonctionnels de type RND. L’insertion en copie unique et l’expression inductible de la pompe d’efflux sont très avantageuses, car la présence d’opérons d’efflux RND sur des plasmides à nombre élevé de copies est souvent mal tolérée par les cellules bactériennes. De plus, l’incorporation de vecteurs d’expression mini-Tn7 recombinants dans le chromosome d’un hôte de substitution d’A. baumannii avec une sensibilité accrue à l’efflux aide à contourner les interférences d’autres pompes d’efflux. Ce système est utile non seulement pour étudier les pompes d’efflux bactériennes non caractérisées, mais aussi pour évaluer l’efficacité des inhibiteurs potentiels ciblant ces pompes.

Acinetobacter baumannii is a World Health Organization top priority pathogen due to its encompassing resistance to all classes of antibiotics1. It is an opportunistic pathogen mostly affecting hospitalized, injured, or immunocompromised people. A. baumannii largely evades antibiotics via efflux pumps, the most relevant being the Resistance-Nodulation-Division (RND) family of exporters2. Understanding how these efflux pumps work mechanistically will allow one to develop targeted therapeutic options.
One common way that cellular processes can be specifically distinguished is through genetic manipulation. However, the tools available for A. baumannii genetic studies are limited, and to further confound experimental design, clinical isolates often are resistant to the antibiotics routinely used for selection in genetic manipulations3. A second hurdle encountered when studying efflux pumps specifically is that they are strictly regulated-often by unknown factors-making it difficult to accurately isolate and attribute function to a single pump4. Seeing this need to expand the research toolbox, we developed a mini-Tn7-based, single-copy-insertion, inducible expression system that incorporates a Flp recombinase target (FRT) cassette, which allows for the removal of the selection marker5,6,7 (Figure 1). First created for Pseudomonas8,9,10, this elegant cloning and expression system was used to generate single-copy efflux pump complements into an RND efflux pump-deficient strain of A. baumannii (ATCC 17978::&#916;adeIJK,&#916;adeFGH,&#916;adeAB: hereafter referred to as A. baumannii AB258) that we generated11. Being able to study one efflux pump at a time and not overwhelm the bacterial cells with high-copy expression (as generally seen with plasmid-based expression systems), one can better learn about the critical, physiological aspects of each efflux pump with minimal interference and reduced complications.
This article describes how to use the mini-Tn7 system to complement a deleted gene of interest, RND efflux pump adeIJK, into the chromosome of A. baumannii AB258 through a series of uncomplicated steps performed over the course of 9 days7. The first set of steps re-introduces the deleted efflux pump genes cloned into the mini-Tn7-based insertion plasmid (Figure 2A) at the single attTn7 insertion site downstream of the well-conserved glmS gene (Figure 3A). This process is facilitated by a non-replicative helper plasmid (Figure 2B) that encodes for the transposase genes needed for Tn7-driven insertion. The second set of steps uses an excision plasmid (Figure 2C) for Flp recombinase-mediated removal of the gentamicin gene flanked by FRT sites (Figure 3B) to create an unmarked strain. Though this system is used to elucidate the essential roles and possible inhibitors of RND efflux pumps with respect to antibiotic resistance, it can be used to investigate any gene of interest.

Pleins feux sur l’auteur : Faire progresser la recherche sur la résistance aux antibiotiques à l’aide d’une souche bactérienne déficiente en efflux et d’un système d’expression génique à copie unique

Caractérisation des systèmes d’efflux multimédicamenteux chez Acinetobacter baumannii à l’aide d’une souche bactérienne déficiente en efflux et d’un système d’expression génique à copie unique

We study multi-drug resistance efflux systems in gram-negative bacteria. We are interested in learning about the natural functions of these pumps and how these pumps can be used as a potential drug target. Expression of multi-drug resistance efflux systems is tightly regulated, making it difficult to study their functions.Thus, an expression system that bypasses the regulatory system can be quite useful in the characterization of these pumps. This protocol allows for the expression of genes at levels usually seen in natural settings. Thus, the activity of the gene products mimics what is observed in nature.

La procédure d’insertion chromosomique ne prend que 2 h au total sur 3 jours pour voir un résultat - colonies se développer sur une plaque de gélose sélective (Figure 1A-C). Le nombre attendu de colonies sur la plaque de transformation dépend de la souche : on peut voir 20-30 voire des centaines de colonies car l’insertion de Tn7 sur les sites deTn7 est spécifique et efficace9. Le patchage des colonies de plaques d...

Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Advancing Antibiotic Resistance Research Using an Efflux-Deficient Bacterial Strain and a Single-Copy Gene Expression System at JoVE.com

Nous décrivons une procédure simple pour la complémentation chromosomique à copie unique d’un gène de pompe d’efflux à l’aide d’un système d’expression basé sur mini-Tn7 dans une souche modifiée d’Acinetobacter baumannii déficiente en efflux. Cet outil génétique précis permet une expression génique contrôlée, ce qui est essentiel pour la caractérisation des pompes d’efflux chez les pathogènes multirésistants.

Acinetobacter baumannii is recognized as a challenging Gram-negative pathogen due to its widespread resistance to antibiotics. It is crucial to comprehend ...

Nous étudions les systèmes d’efflux multirésistants chez les bactéries à Gram négatif. Nous souhaitons en savoir plus sur les fonctions naturelles de ces pompes et sur la façon dont elles peuvent être utilisées comme cible potentielle de médicaments. L’expression des systèmes d’efflux multirésistants est étroitement régulée, ce qui rend difficile l’étude de leurs fonctions.Ainsi, un système d’expression qui contourne le système de régulation peut être très utile dans la caractérisation de ces pompes. Ce protocole permet l’expression des gènes à des niveaux habituellement observés dans les milieux naturels. Ainsi, l’activité des produits géniques imite ce qui est observé dans la nature.

characterizing-multidrug-efflux-systems-acinetobacter-baumannii-using

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Characterizing Multidrug Efflux Systems in Acinetobacter baumannii Using an Efflux&#45;Deficient Bacterial Strain and a Single&#45;Copy Gene Expression System

353 vues.  University of Manitoba. Nous étudions les systèmes d’efflux multirésistants chez les bactéries à Gram négatif. Nous souhaitons en savoir plus sur les fonctions naturelles de ces pompes et sur la façon dont elles peuvent être utilisées comme cible potentielle de médicaments. L’expression des systèmes d’efflux multirésistants est étroitement régulée, ce qui rend difficile l’étude de leurs fonctions.Ainsi, un système d’expression qui contourne le système de régulation peut être trè...

Vidéo: Pleins feux sur l’auteur : Faire progresser la recherche sur la résistance aux antibiotiques à l’aide d’une souche bactérienne déficiente en efflux et d’un système d’expression génique à copie unique

Acinetobacter baumannii is recognized as a challenging Gram-negative pathogen due to its widespread resistance to antibiotics. It is crucial to comprehend the mechanisms behind this resistance to design new and effective therapeutic options. Unfortunately, our ability to investigate these mechanisms in A. baumannii is hindered by the paucity of suitable genetic manipulation tools. Here, we describe methods for utilizing a chromosomal mini-Tn7-based system to achieve single-copy gene expression in an A. baumannii strain that lacks functional RND-type efflux mechanisms. Single-copy insertion and inducible efflux pump expression are quite advantageous, as the presence of RND efflux operons on high-copy number plasmids is often poorly tolerated by bacterial cells. Moreover, incorporating recombinant mini-Tn7 expression vectors into the chromosome of a surrogate A. baumannii host with increased efflux sensitivity helps circumvent interference from other efflux pumps. This system is valuable not only for investigating uncharacterized bacterial efflux pumps but also for assessing the effectiveness of potential inhibitors targeting these pumps.

We describe a facile procedure for the single-copy chromosomal complementation of an efflux pump gene using a mini-Tn7-based expression system into an engineered efflux-deficient strain of Acinetobacter baumannii. This precise genetic tool allows for controlled gene expression, which is key for the characterization of efflux pumps in multidrug resistant pathogens.