Este trabalho foi apoiado por uma Bolsa de Descoberta do Conselho de Ciências Naturais e Engenharia do Canadá para AK. Os esquemas utilizados nas figuras são criados com BioRender.com.

1. Preparação experimental
<ol><li>Purificar o plasmídeo pUC18T-mini-Tn7T-LAC-Gm9 (plasmídeo de inserção, Figura 2A) com o gene de interesse. NOTA: Aqui, o gene de interesse é adeIJK. A concentração final do plasmídeo deve ser de ≥100 ng/μL.</li>
	<li>Purificar o plasmídeo auxiliar (pTNS2)9 e o plasmídeo de excisão (pFLP2ab)6 (Figura 2B,C, respectivamente), idealmente para uma concentração final de DNA plasmidial de ≥100 ng/μL.</li>
	<li>Preparar 50 mL de água ultrapura estéril e 25 mL de caldo LB estéril (Lennox) (ver Tabela de Materiais).</li>
	<li>Preparar um mínimo de 10 placas de ágar LB, cada uma com os seguintes aditivos: simples (sem aditivos), gentamicina (Gm) a 50 μg/ml, carbenicilina (Cb) a 200 μg/ml (para selecção através do gene de resistência à ampicilina) e sacarose a 5% (ver Tabela de Materiais).</li>
	<li>Esticar a cepa a ser usada para inserção em ágar LB e incubar a 37 °C por 16-18 h. Aqui, A. baumannii AB258 é usado. NOTA: Este protocolo deve ser realizado em um ambiente estéril, tanto quanto possível, usando um queimador de Bunsen na bancada ou um armário de segurança biológica. Todos os consumíveis (pontas de pipeta, laços de inoculação, tubos de microfuga, etc.) precisam ser estéreis.</li>
</ol>2. Preparação da cultura
<ol><li>Inocular uma única colônia de A. baumannii AB258 em 4 mL de caldo LB em um tubo de cultura estéril de 13 mL usando uma alça de inoculação estéril ou bastão de inoculação de madeira estéril. NOTA: Uma única cultura de 4 mL é usada para uma amostra e um controle. Aumentar o número de culturas em função do número de amostras necessárias.</li>
	<li>Incubar durante a noite a 37 °C com agitação (250 rpm).</li>
	<li>Coloque um frasco de água destilada estéril (25-50 ml) a 4 °C durante a noite para utilização no passo 3.</li>
</ol>3. Preparação de células eletrocompetentes
<ol><li>Colocar todos os tubos de microfuga estéreis de 1,5 mL (dois por cultura) e cubetas de eletroporação estéreis (dois por cultura) no gelo (ver Tabela de Materiais). Mantenha as amostras no gelo o máximo possível durante todo o procedimento.</li>
	<li>Coloque o frasco de água estéril que foi armazenado a 4 °C sobre gelo.</li>
	<li>Transfira 1,5 mL da cultura bacteriana noturna para um dos tubos de microfuge de 1,5 mL.</li>
	<li>Centrifugar a 13.000 x g por 2 min para pellet as células. NOTA: A centrifugação seria idealmente realizada a 4 °C, mas a centrifugação à temperatura ambiente é aceitável e não prejudicial.</li>
	<li>Usando uma pipeta de 1 mL, remova todo o sobrenadante sem perturbar o pellet celular.</li>
	<li>Adicione mais 1,5 mL de cultura bacteriana no mesmo tubo de microfuga. Centrifugar a 13.000 x g por 2 min e, em seguida, remover todo o sobrenadante.</li>
	<li>Repetir o passo 3,6 uma última vez com o 1 mL restante de cultura.</li>
	<li>Adicione 1 mL de água estéril gelada ao pellet de célula e ressuspenda com pipetagem suave até que o pellet não fique mais no fundo do tubo de microfuga.</li>
	<li>Centrifugar as células ressuspensas a 13.000 x g por 2 min.</li>
	<li>Remova cuidadosamente o sobrenadante usando uma pipeta de 1 mL. Não despeje o sobrenadante, especialmente nas etapas de lavagem subsequentes, quando as células tendem a formar pellets menos compactos.</li>
	<li>Repita esta etapa de lavagem com água estéril gelada, passos 3.8 para passo 3.10, mais duas vezes.</li>
	<li>Ressuspenda suavemente o pellet de célula final em 200 μL de água estéril gelada.</li>
	<li>Transferir 100 μL da suspensão celular final para o segundo tubo de microfuga gelado de 1,5 mL. Esta segunda alíquota se tornará o controle negativo para eletroporação. Mantenha as amostras de células no gelo.</li>
</ol>4. Eletroporação
<ol><li>Pré-aquecer 1 mL de caldo LB e uma placa de ágar LB + Gm50 (preparada na etapa 1.4) para cada amostra e controle em uma estufa estática regulada para 37 °C.</li>
	<li>Em um volume combinado de 5 μL ou menos, adicione 100-200 ng cada um dos plasmídeos auxiliares pTNS2 e o plasmídeo de inserção pUC18T-mini-Tn7T-LAC-Gm-adeIJK a uma alíquota de células eletrocompetentes.</li>
	<li>Misture com batidas suaves na ponta dos dedos para garantir a mistura completa dos plasmídeos com as células eletrocompetentes sem introduzir bolhas.</li>
	<li>Adicione um volume equivalente de água destilada estéril na alíquota da célula de controle negativo e misture delicadamente como acima.</li>
	<li>Incubar as amostras no gelo por 20 min.</li>
	<li>Transfira toda a amostra de células para uma cubeta de eletroporação gelada e, em seguida, coloque a cubeta de volta no gelo. Repita para a amostra de célula de controle negativa.</li>
	<li>Eletroporar a amostra celular.<ol><li>Ligue o eletroporador e regule-o para 2,0 kV (25 μF, 200 Ω) (consulte Tabela de Materiais).</li>
		<li>Limpe a superfície da cubeta com um tecido macio para remover qualquer gelo ou umidade aderente.</li>
		<li>Insira a cubeta no eletroporator e dê o choque elétrico.</li>
		<li>Adicione imediatamente 0,9 mL de caldo LB pré-aquecido às células da cubeta e pipete suavemente para cima e para baixo para misturar as células com o meio.</li>
		<li>Transfira toda a suspensão celular para um novo tubo de microfuga de 1,5 mL (temperatura ambiente).</li>
		<li>Verifique o valor da constante de tempo no eletroporador; Para melhores resultados, esse valor deve estar entre 4 e 6.</li>
	</ol></li>
	<li>Repetir o procedimento de electroporação (passos 4.7.1 a passo 4.7.6) para a amostra de células de controlo negativas.</li>
	<li>Incubar as amostras electroporadas a 37 °C durante 1 h a 250 rpm para permitir a recuperação celular.</li>
	<li>Usando um espalhador de inoculação, espalhe 100 μL de cada amostra de célula eletroporada em uma placa de ágar LB + Gm50 pré-aquecida.<ol><li>Centrifugar as amostras restantes a 13.000 x g por 2 min para peletizar as células.</li>
		<li>Após a remoção de todo o sobrenadante com pipeta, ressuspenda as células em 100 μL de caldo LB.</li>
		<li>Espalhe cada amostra inteira em placas individuais de ágar LB + Gm50 pré-aquecidas. NOTA: A eficiência da eletroporação pode ser dependente da deformação. Ao eletroporar uma cepa pela primeira vez, pode ser informativo plaquear diferentes volumes, ou mesmo diluições, da amostra de eletroporação para garantir que as placas resultantes tenham colônias isoladas.</li>
	</ol></li>
	<li>Incubar as placas a 37 °C durante 16-18 h.</li>
</ol>5. Seleção de colônias transformadas para triagem baseada em PCR
<ol><li>Verifique as placas de eletroporação. O controle negativo não deve ter colônias; a amostra deve ter colônias distintas. NOTA: As placas com colónias, nesta etapa e em todas as etapas subsequentes em que são produzidas placas de ágar com colónias ou remendos, podem ser armazenadas a 4 °C até 3 dias antes de prosseguir.</li>
	<li>Usando palitos estéreis, pegue até 10 colônias únicas das placas de ágar LB + Gm50 e remende-as em uma placa de ágar LB + Gm50 fresca.</li>
	<li>Incubar as placas a 37 °C durante 16-18 h.</li>
</ol>6. Verificação da inserção cromossômica por PCR de colônias
<ol><li>Remova as placas de ágar LB + Gm50 contendo as colônias remendadas da incubadora.</li>
	<li>Usando um palito estéril ou ponta de pipeta estéril, remova uma pequena porção (aproximadamente do tamanho de uma colônia grande) de um adesivo em 20 μL de água destilada estéril em um tubo de PCR de 0,2 mL; misture bem. A amostra de água deve ficar visivelmente turva à medida que as células são liberadas do palito. Prepare qualquer número de amostras que precisem ser examinadas, mas 6 devem ser suficientes.</li>
	<li>Incubar o tubo de PCR contendo a suspensão bacteriana a 100 °C durante 5-10 min.</li>
	<li>Usando uma minicentrífuga (ver Tabela de Materiais), gire a amostra na velocidade máxima fixa por 2 min para pellet de detritos celulares.</li>
	<li>Transfira o sobrenadante para um novo tubo de PCR de 0,2 mL e coloque-o no gelo. Esta amostra contém o DNA do molde para a reação de PCR. NOTA: Este modelo de DNA pode ser armazenado a -20 °C antes de prosseguir com a PCR.</li>
	<li>Preparar uma mistura de reação de PCR contendo 1x tampão polimerase, 200 μM dNTPs, 0,18 μM ABglmS2_F_New primer para frente, 0,18 μM Tn7R primer reverso (Tabela 1), 1 U de Taq DNA polimerase e 1 μL do DNA molde preparado em um volume total de 25 μL. Prepare um controle sem modelo (NTC), incluindo todos, exceto o DNA do modelo (consulte Tabela de Materiais).</li>
	<li>Insira as condições de reação em um termociclador: 95 °C por 2 min; 95 °C por 30 s, 49 °C por 30 s e 72 °C por 30 s para um total de 35 ciclos; 72 °C por 10 min; 12 °C segurar. Execute os exemplos.</li>
	<li>Após a adição do corante de carga de DNA a uma concentração final de 1x, carregar 10 μL de cada reação de PCR em um gel de agarose a 2% e executar a 80 V por 40 min. O tamanho esperado do amplicon para este par de primers é de 382 pb. O NTC não deve ter bandas.</li>
	<li>Identificar as amostras que produziram o produto PCR esperado. Preparar uma placa de estria em placas de ágar LB + Gm50 a partir de qualquer um dos adesivos positivos para PCR; incubar a 37 °C durante 16-18 h. O objetivo é gerar uma placa com colônias únicas para a preparação de um estoque de glicerol para preservar essa cepa marcada e como ponto de partida para a criação de uma cepa não marcada (descrita abaixo).</li>
</ol>7. Remoção do marcador GmR usando pFLP2ab
<ol><li>Siga o procedimento mencionado na etapa 2: Preparação da cultura. A amostra utilizada para o preparo da cultura noturna é uma única colônia a partir das placas de ágar LB + Gm50 preparadas para gerar colônias discretas na etapa 6.9.</li>
	<li>Siga o procedimento mencionado na etapa 3: Preparação de células eletrocompetentes. Preparar as células da cultura noturna para eletroporação.</li>
	<li>Siga o procedimento mencionado no passo 4: Eletroporação. Aqui, o plasmídeo a ser introduzido nas células é o pFLP2ab (100-200 ng), que removerá o gene de resistência à gentamicina, flanqueando o gene cromossomicamente inserido de interesse.</li>
	<li>Após a recuperação das células durante 1 h (passo 4.9), espalhar 100 μL da amostra celular electroporada numa placa de ágar LB + Cb200 pré-aquecida (preparada no passo 1.4). Essa pressão seletiva garante que apenas as células que abrigam o plasmídeo de excisãoab pFLP2 cresçam.</li>
	<li>Incubar as placas a 37 °C durante 16-18 h.</li>
	<li>Verifique a placa para colônias. A placa de controle negativo não deve ter colônias; a placa de amostra de ágar LB + Cb200 deve ter colônias distintas.</li>
	<li>Usando palitos estéreis, remende até 20 colônias isoladas em uma placa de ágar LB + Cb200 e uma placa de ágar LB + Gm50 .</li>
	<li>Incubar as placas durante 16-18 h a 37 °C.</li>
	<li>Verifique se há remendos nas placas. Clones que crescem na placa de ágar LB + Cb200 , mas não na placa de ágar LB + Gm50 , tiveram o gene de resistência à gentamicina removido da inserção original.</li>
	<li>Selecionar as manchas resistentes à carbenicilina e suscetíveis à gentamicina para serem usadas em placas individuais de ágar LB suplementadas com 5% (p/v) de sacarose, o que força a expulsão do plasmídeoab pFLP2 da bactéria. Escolha até 10 colônias.</li>
	<li>Incubar as placas durante 16-18 h a 37 °C.</li>
	<li>Verifique as placas para colônias.</li>
	<li>Como confirmação final da perda de pFLP2ab plasmidial, o patch cruzado 4-6 isolou colônias das placas de sacarose a 5% em uma placa de ágar LB + Cb200 e uma placa de ágar LB.</li>
	<li>Incubar as placas durante 16-18 h a 37 °C.</li>
	<li>Escolha um clone que esteja crescendo na placa de ágar LB, e que seja sensível à carbenicilina para a preparação de um estoque de glicerol para preservar essa cepa não marcada.<ol><li>A verificação genética da cepa não marcada pode ser realizada com PCR de colônia (passo 6: Verificando a inserção cromossômica por PCR de colônia) usando os primers que têm como alvo o gene de resistência à gentamicina.</li>
		<li>Preparar uma mistura de reação de PCR contendo 1x tampão polimerase, 200 μM dNTPs, 0,18 μM Gm_F primer para frente, 0,18 μM Gm_R primer reverso (Tabela 1), 1 U de Taq DNA polimerase e 1 μL do DNA molde preparado em um volume total de 25 μL. Preparar um controle sem modelo (NTC) incluindo todos, exceto o DNA do modelo, e um controle positivo usando DNA da cepa marcada.</li>
		<li>Insira as condições de reação em um termociclador: 95 °C por 2 min; 95 °C por 30 s, 50 °C por 30 s e 72 °C por 40 s para um total de 35 ciclos; 72 °C por 10 min; 12 °C segurar. Execute os exemplos.</li>
		<li>Após a adição do corante de carga de DNA a uma concentração final de 1x, carregar 10 μL de cada reação de PCR em um gel de agarose a 1% e executar a 80 V por 40 min. O tamanho esperado do amplicon para este par de primers é de 525 pb. O controle positivo deve ter uma única banda; as amostras e o NTC não devem ter bandas.</li>
	</ol></li>
</ol>

Expressão gênica de cópia única para caracterização de sistemas de efluxo multidrogas

<ol>
	<li>Prioritization of pathogens to guide research, discovery, research and development of new antibiotics for drug-resistant bacterial infections, including tuberculosis. World Health Organization Available from: <a target="_blank" href="https://www.who.int/publications/i/item/WHO-EMP-IAU-2017.12">https://www.who.int/publications/i/item/WHO-EMP-IAU-2017.12</a> (2017)</li><li>Kornelsen, V., Kumar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+multidrug+resistance+efflux+pumps+in+Acinetobacter+spp.">Update on multidrug resistance efflux pumps in Acinetobacter spp.</a> Antimicrob Agents Chemother. 65 (7), e00514-00521 (2021).</li><li>Sykes, E. M., Deo, S., Kumar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+genetic+tools+for+Acinetobacter+baumannii.">Recent advances in genetic tools for Acinetobacter baumannii.</a> Front Genet. 11, 601380 (2020).</li><li>Kumar, A., Chua, K. L., Schweizer, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+regulated+expression+of+single-copy+efflux+pump+genes+in+a+surrogate+Pseudomonas+aeruginosa+strain:+identification+of+the+BpeEF-OprC+chloramphenicol+and+trimethoprim+efflux+pump+of+Burkholderia+pseudomallei+1026b.">Method for regulated expression of single-copy efflux pump genes in a surrogate Pseudomonas aeruginosa strain: identification of the BpeEF-OprC chloramphenicol and trimethoprim efflux pump of Burkholderia pseudomallei 1026b.</a> Antimicrob Agents Chemother. 50 (10), 3460-3463 (2006).</li><li>Kumar, A., Dalton, C., Cortez-Cordova, J., Schweizer, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mini-Tn7+vectors+as+genetic+tools+for+single+copy+gene+cloning+in+Acinetobacter+baumannii.">Mini-Tn7 vectors as genetic tools for single copy gene cloning in Acinetobacter baumannii.</a> J Microbiol Methods. 82 (3), 296-300 (2010).</li><li>Ducas-Mowchun, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next+generation+of+Tn7-based+single-copy+insertion+elements+for+use+in+multi-+and+pan-drug+resistant+strains+of+Acinetobacter+baumannii.">Next generation of Tn7-based single-copy insertion elements for use in multi- and pan-drug resistant strains of Acinetobacter baumannii.</a> Appl Environ Microbiol. 85 (11), e00066-00119 (2019).</li><li>Ducas-Mowchun, K., De Silva, P. M., Patidar, R., Schweizer, H. P., Kumar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tn7-based+single-copy+insertion+vectors+for+Acinetobacter+baumannii.">Tn7-based single-copy insertion vectors for Acinetobacter baumannii.</a> Methods Mol Biol. 1946, 135-150 (2019).</li><li>Schweizer, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+the+Saccharomyces+cerevisiae+Flp-FRT+system+in+bacterial+genetics.">Applications of the Saccharomyces cerevisiae Flp-FRT system in bacterial genetics.</a> J Mol Microbiol Biotechnol. 5 (2), 67-77 (2003).</li><li>Choi, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Tn7-based+broad-range+bacterial+cloning+and+expression+system.">A Tn7-based broad-range bacterial cloning and expression system.</a> Nat Methods. 2 (6), 443-448 (2005).</li><li>Choi, K. H., Schweizer, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mini-Tn7+insertion+in+bacteria+with+single+attTn7+sites:+example+Pseudomonas+aeruginosa.">Mini-Tn7 insertion in bacteria with single attTn7 sites: example Pseudomonas aeruginosa.</a> Nat Protoc. 1 (1), 153-161 (2006).</li><li>Kornelsen, V., Unger, M., Kumar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atorvastatin+does+not+display+an+antimicrobial+activity+on+its+own+nor+potentiates+the+activity+of+other+antibiotics+against+Acinetobacter+baumannii+ATCC+17978+or+A.+baumannii+AB030.">Atorvastatin does not display an antimicrobial activity on its own nor potentiates the activity of other antibiotics against Acinetobacter baumannii ATCC 17978 or A. baumannii AB030.</a> Access Microbiol. 3, 000288 (2021).</li><li>Reyrat, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Counterselectable+markers:+untapped+tools+for+bacterial+genetics+and+pathogenesis.">Counterselectable markers: untapped tools for bacterial genetics and pathogenesis.</a> Infect Immun. 66 (9), 4011-4017 (1998).</li><li>Gay, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positive+selection+procedure+for+entrapment+of+insertion+sequence+elements+in+gram-negative+bacteria.">Positive selection procedure for entrapment of insertion sequence elements in gram-negative bacteria.</a> J Bacteriol. 164, 918-921 (1985).</li><li>Kyriakidis, I., Vasileiou, E., Pana, Z. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tragiannidis,+Acinetobacter+baumannii+antibiotic+resistance+mechanisms.">Tragiannidis, Acinetobacter baumannii antibiotic resistance mechanisms.</a> Pathogens. 10 (3), 373 (2021).</li><li>Clinical and Laboratory Standards Institute. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performance+standards+for+antimicrobial+susceptibility+testing.">Performance standards for antimicrobial susceptibility testing.</a> CLSI Supplement M100., 31st edn. , (2021).</li><li>Dijkshoorn, L., Nemec, A., Seifert, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+increasing+threat+in+hospitals:+multidrug-resistant+Acinetobacter+baumannii.">An increasing threat in hospitals: multidrug-resistant Acinetobacter baumannii.</a> Nature Reviews Microbiology. 5, 939-951 (2007).</li><li>Yildirim, S., Thompson, M. 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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mini-Tn7+insertion+in+bacteria+with+multiple+glmS-linked+attTn7+sites:+example+Burkolderia+mallei+ATCC+2334.">Mini-Tn7 insertion in bacteria with multiple glmS-linked attTn7 sites: example Burkolderia mallei ATCC 2334.</a> Nat Protoc. 1 (1), 162-169 (2006).</li><li>Jittawuttipoka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mini-Tn7+vectors+as+genetic+tools+for+gene+cloning+at+a+single+copy+number+in+an+industrially+important+and+phytopathogenic+bacteria,+Xanthomonas+spp.">Mini-Tn7 vectors as genetic tools for gene cloning at a single copy number in an industrially important and phytopathogenic bacteria, Xanthomonas spp.</a> FEMS Microbiol Lett. 298 (1), 111-117 (2009).</li><li>P&#233;rez-Varela, M., Tierney, A. R. P., Kim, J. S., V&#225;zquez-Torres, A., Rather, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+RelA+in+Acinetobacter+baumannii.">Characterization of RelA in Acinetobacter baumannii.</a> J Bacteriol. 202 (12), e00045 (2020).</li><li>Williams, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Acinetobacter+baumannii+copper+resistance+reveals+a+role+in+virulence.">Characterization of Acinetobacter baumannii copper resistance reveals a role in virulence.</a> Front Microbiol. 11, 16 (2020).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Embora este procedimento para a inserção cromossômica de um sistema induzível de expressão gênica de cópia única em A. baumannii seja tecnicamente simples e não trabalhoso, existem alguns passos importantes que precisam ser enfatizados. Primeiro, a preparação das células competentes precisa ser feita em gelo, tanto quanto possível, pois as células se tornam frágeis durante a substituição do meio por água gelada. Idealmente, as etapas de centrifugação são realizadas a 4 °C, mas a centrifuga?...

Acinetobacter baumannii é um patógeno prioritário da Organização Mundial da Saúde devido à sua resistência abrangente a todas as classes de antibióticos1. É um patógeno oportunista que afeta principalmente pessoas hospitalizadas, feridas ou imunocomprometidas. A. baumannii evade amplamente antibióticos através de bombas de efluxo, sendo a mais relevante a família de exportadores Resistance-Nodulation-Division (RND)2. Entender como essas bombas de efluxo funcionam mecanisticamente permitirá desenvolver opções terapêuticas direcionadas.
Uma maneira comum de distinguir especificamente os processos celulares é por meio da manipulação genética. No entanto, as ferramentas disponíveis para estudos genéticos de A. baumannii são limitadas e, para confundir ainda mais o desenho experimental, isolados clínicos frequentemente são resistentes aos antibióticos rotineiramente usados para seleção em manipulações genéticas3. Um segundo obstáculo encontrado ao estudar especificamente bombas de efluxo é que elas são estritamente reguladas - muitas vezes por fatores desconhecidos - tornando difícil isolar com precisão e atribuir função a uma única bomba4. Vendo essa necessidade de expandir a caixa de ferramentas de pesquisa, desenvolvemos um sistema de expressão induzível baseado em mini-Tn7, de inserção de cópia única, que incorpora um Flp recombinase target (FRT), que permite a remoção do marcador de seleção 5,6,7 (Figura 1). Criado primeiramente para Pseudomonas 8,9,10, este elegante sistema de clonagem e expressão foi usado para gerar complementos de bomba de efluxo de cópia única em uma cepa deficiente em bomba de efluxo RND de A. baumannii (ATCC 17978::ΔadeIJK,Δ adeFGH,Δ adeAB: doravante referida como A. baumannii AB258) que geramos11. Sendo capaz de estudar uma bomba de efluxo de cada vez e não sobrecarregar as células bacterianas com alta expressão de cópia (como geralmente visto com sistemas de expressão baseados em plasmídeos), pode-se aprender melhor sobre os aspectos fisiológicos críticos de cada bomba de efluxo com interferência mínima e complicações reduzidas.
Este artigo descreve como usar o sistema mini-Tn7 para complementar um gene excluído de interesse, a bomba de efluxo de RND adeIJK, no cromossomo de A. baumannii AB258 através de uma série de etapas não complicadas realizadas ao longo de 9 dias7. O primeiro conjunto de etapas reintroduz os genes deletados da bomba de efluxo clonados no plasmídeo de inserção baseado em mini-Tn7 (Figura 2A) no único sítio de inserção attTn7 a jusante do gene glmS bem conservado (Figura 3A). Esse processo é facilitado por um plasmídeo auxiliar não replicativo (Figura 2B) que codifica os genes de transposase necessários para a inserção impulsionada por Tn7. O segundo conjunto de etapas utiliza um plasmídeo de excisão (Figura 2C) para a remoção mediada pela recombinase de Flp do gene da gentamicina flanqueado por sítios de TAF (Figura 3B) para criar uma cepa não marcada. Embora esse sistema seja usado para elucidar os papéis essenciais e possíveis inibidores das bombas de efluxo de RND com relação à resistência a antibióticos, ele pode ser usado para investigar qualquer gene de interesse.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 mL PCR tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20170-012</td>
			<td>For colony boil preparations and PCR reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microfuge tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72-690-301</td>
			<td>General use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13-mL culture tubes, Pyrex</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-957K</td>
			<td>Liquid culture vessels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6x DNA loading buffer</td>
			<td>Froggabio</td>
			<td>LD010</td>
			<td>Agarose gel electrophoresis sample loading dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid, glacial</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>351271-212</td>
			<td>Agarose gel running buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>AGR003</td>
			<td>Solid growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>BioBasic</td>
			<td>D0012</td>
			<td>Electrophoretic separation of PCR reaction products; used at a concentration of 0.8&#8211;2%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose gel electrophoresis unit</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>29-237-54</td>
			<td>Agarose gel electrophoresis; separation of PCR reaction products</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50841231</td>
			<td>Selective media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture tube closures</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-684-138</td>
			<td>Stainless steel closure for 13-mL culture tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxynucleotide triphosphate (dNTP) set</td>
			<td>Biobasic</td>
			<td>DD0058</td>
			<td>PCR reaction component; supplied as 100 mM each dATP, dCTP, dGTP, dTTP; mixed and diluted for 10 mM each dNTP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry bath/block heater</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>88860023</td>
			<td>Isotemp digital dry bath for boil preparations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation cuvettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89047-208</td>
			<td>2 mm electroporation cuvettes with round cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporator</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>940000009</td>
			<td>110 VAC, 60 Hz electroporator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP102-1</td>
			<td>Visualization of PCR reaction products and DNA marker in agarose gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CA-EM4050</td>
			<td>Agarose gel running buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Biobasic</td>
			<td>GB0217</td>
			<td>For the preparation of selective media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>G33</td>
			<td>Preparation of bacterial stocks for long-term storage in an ultra-low freezer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator (shaking)</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>M1352-0000</td>
			<td>Excella E24 Incubator Shaker for liquid culture growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator (static)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>11-690-550D</td>
			<td>Isotemp Incubator Oven Model 550D for solid (LB agar) culture growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inoculation loop</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>86.1562.050</td>
			<td>Streaking colonies onto agar plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inoculation spreader</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>86.1569.005</td>
			<td>Spreading of culture onto agar plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysogeny broth (LB) broth, Lennox</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1427</td>
			<td>Liquid growth media (20 g/L: 5 g/L sodium chloride, 10 g/L tryptone, 5 g/L yeast extract)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>75002431</td>
			<td>Sorvall Legend Micro 17 for centrifugation of samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-centrifuge</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S67601B</td>
			<td>Centrifugation of 0.2 mL PCR tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>SPL Life Sciences</td>
			<td>10090</td>
			<td>For solid growth media (agar plates): 90 x 15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes&#160;</td>
			<td>Mandel</td>
			<td>Various</td>
			<td>Gilson single channel pipettes (P10, P20, P200, P1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power supply</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1645050</td>
			<td>PowerPac Basic power supply for electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers</td>
			<td>IDT</td>
			<td>NA</td>
			<td>PCR reaction component; specific to gene of interest; prepared at 100 &#956;M as directed on the product specification sheet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>BioBasic</td>
			<td>SB0498</td>
			<td>For the preparation of counterselective media for removal of the pFLP2ab plasmid from transformed A. baumannii</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA polymerase</td>
			<td>FroggaBio</td>
			<td>T-500</td>
			<td>PCR reaction component; polymerase supplied with a 10x buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal cycler</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1861096</td>
			<td>Model T100 for PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toothpicks</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S24559</td>
			<td>For patching colonies onto agar plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1503</td>
			<td>Agarose gel running buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>ZLXLSD51040</td>
			<td>MilliQ water purification system: ultra pure water for media and solution preparation, and cell washing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wide range DNA marker</td>
			<td>Biobasic</td>
			<td>M103R-2</td>
			<td>Size determination of PCR products on an agarose gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wooden inoculating sticks</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>29-801-02</td>
			<td>Inoculating cultures with colonies from agar plates</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterizing multidrug efflux systems in acinetobacter baumannii using an efflux&#45;deficient bacterial strain and a single&#45;copy gene expression system

Acinetobacter baumannii é reconhecido como um patógeno Gram-negativo desafiador devido à sua ampla resistência a antibióticos. É crucial compreender os mecanismos por trás dessa resistência para desenhar novas e eficazes opções terapêuticas. Infelizmente, nossa capacidade de investigar esses mecanismos em A. baumannii é prejudicada pela escassez de ferramentas adequadas de manipulação genética. Aqui, descrevemos métodos para utilizar um sistema cromossômico baseado em mini-Tn7 para obter expressão gênica de cópia única em uma cepa de A. baumannii que não possui mecanismos funcionais de efluxo do tipo RND. A inserção de cópia única e a expressão de bomba de efluxo induzível são bastante vantajosas, pois a presença de operons de efluxo de RND em plasmídeos de alto número de cópias é frequentemente mal tolerada pelas células bacterianas. Além disso, a incorporação de vetores de expressão recombinante de mini-Tn7 no cromossomo de um hospedeiro substituto de A. baumannii com sensibilidade aumentada ao efluxo ajuda a contornar a interferência de outras bombas de efluxo. Este sistema é valioso não apenas para investigar bombas de efluxo bacteriano não caracterizadas, mas também para avaliar a eficácia de potenciais inibidores direcionados a essas bombas.

Acinetobacter baumannii is a World Health Organization top priority pathogen due to its encompassing resistance to all classes of antibiotics1. It is an opportunistic pathogen mostly affecting hospitalized, injured, or immunocompromised people. A. baumannii largely evades antibiotics via efflux pumps, the most relevant being the Resistance-Nodulation-Division (RND) family of exporters2. Understanding how these efflux pumps work mechanistically will allow one to develop targeted therapeutic options.
One common way that cellular processes can be specifically distinguished is through genetic manipulation. However, the tools available for A. baumannii genetic studies are limited, and to further confound experimental design, clinical isolates often are resistant to the antibiotics routinely used for selection in genetic manipulations3. A second hurdle encountered when studying efflux pumps specifically is that they are strictly regulated-often by unknown factors-making it difficult to accurately isolate and attribute function to a single pump4. Seeing this need to expand the research toolbox, we developed a mini-Tn7-based, single-copy-insertion, inducible expression system that incorporates a Flp recombinase target (FRT) cassette, which allows for the removal of the selection marker5,6,7 (Figure 1). First created for Pseudomonas8,9,10, this elegant cloning and expression system was used to generate single-copy efflux pump complements into an RND efflux pump-deficient strain of A. baumannii (ATCC 17978::&#916;adeIJK,&#916;adeFGH,&#916;adeAB: hereafter referred to as A. baumannii AB258) that we generated11. Being able to study one efflux pump at a time and not overwhelm the bacterial cells with high-copy expression (as generally seen with plasmid-based expression systems), one can better learn about the critical, physiological aspects of each efflux pump with minimal interference and reduced complications.
This article describes how to use the mini-Tn7 system to complement a deleted gene of interest, RND efflux pump adeIJK, into the chromosome of A. baumannii AB258 through a series of uncomplicated steps performed over the course of 9 days7. The first set of steps re-introduces the deleted efflux pump genes cloned into the mini-Tn7-based insertion plasmid (Figure 2A) at the single attTn7 insertion site downstream of the well-conserved glmS gene (Figure 3A). This process is facilitated by a non-replicative helper plasmid (Figure 2B) that encodes for the transposase genes needed for Tn7-driven insertion. The second set of steps uses an excision plasmid (Figure 2C) for Flp recombinase-mediated removal of the gentamicin gene flanked by FRT sites (Figure 3B) to create an unmarked strain. Though this system is used to elucidate the essential roles and possible inhibitors of RND efflux pumps with respect to antibiotic resistance, it can be used to investigate any gene of interest.

Autor em destaque: Avançando na pesquisa de resistência a antibióticos usando uma cepa bacteriana deficiente em efluxo e um sistema de expressão gênica de cópia única

Caracterização de Sistemas de Efluxo Multidrogas em Acinetobacter baumannii Usando uma Cepa Bacteriana Deficiente em Efluxo e um Sistema de Expressão Gênica de Cópia Única

We study multi-drug resistance efflux systems in gram-negative bacteria. We are interested in learning about the natural functions of these pumps and how these pumps can be used as a potential drug target. Expression of multi-drug resistance efflux systems is tightly regulated, making it difficult to study their functions.Thus, an expression system that bypasses the regulatory system can be quite useful in the characterization of these pumps. This protocol allows for the expression of genes at levels usually seen in natural settings. Thus, the activity of the gene products mimics what is observed in nature.

O procedimento de inserção cromossômica leva apenas 2 h no total ao longo de 3 dias para ver um resultado-colônias crescendo em uma placa de ágar seletiva (Figura 1A-C). O número esperado de colônias na placa de transformação é dependente da deformação: pode-se ver 20-30 ou mesmo centenas de colônias, pois a inserção de Tn7 nos sítios attTn7 é específica eeficiente9. O patch das colônias da placa de transfo...

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Descrevemos um procedimento fácil para a complementação cromossômica de cópia única de um gene de bomba de efluxo usando um sistema de expressão baseado em mini-Tn7 em uma cepa deficiente em efluxo projetada de Acinetobacter baumannii. Esta ferramenta genética precisa permite a expressão gênica controlada, o que é fundamental para a caracterização de bombas de efluxo em patógenos multirresistentes.

Acinetobacter baumannii is recognized as a challenging Gram-negative pathogen due to its widespread resistance to antibiotics. It is crucial to comprehend ...

Estudamos sistemas de efluxo multirresistência em bactérias gram-negativas. Estamos interessados em aprender sobre as funções naturais dessas bombas e como essas bombas podem ser usadas como um alvo potencial de drogas. A expressão de sistemas de efluxo multirresistência é fortemente regulada, dificultando o estudo de suas funções.Assim, um sistema de expressão que contorne o sistema regulador pode ser bastante útil na caracterização dessas bombas. Este protocolo permite a expressão de genes em níveis normalmente vistos em ambientes naturais. Assim, a atividade dos produtos gênicos mimetiza o que é observado na natureza.

characterizing-multidrug-efflux-systems-acinetobacter-baumannii-using

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Characterizing Multidrug Efflux Systems in Acinetobacter baumannii Using an Efflux&#45;Deficient Bacterial Strain and a Single&#45;Copy Gene Expression System

349 visualizações.  University of Manitoba. Estudamos sistemas de efluxo multirresistência em bactérias gram-negativas. Estamos interessados em aprender sobre as funções naturais dessas bombas e como essas bombas podem ser usadas como um alvo potencial de drogas. A expressão de sistemas de efluxo multirresistência é fortemente regulada, dificultando o estudo de suas funções.Assim, um sistema de expressão que contorne o sistema regulador pode ser bastante útil na caracterização dessas bombas. Este protocolo permite a...

Vídeo: Autor em destaque: Avançando na pesquisa de resistência a antibióticos usando uma cepa bacteriana deficiente em efluxo e um sistema de expressão gênica de cópia única