Diese Arbeit wurde durch einen Discovery Grant des Natural Science and Engineering Council of Canada an AK unterstützt. Die in den Abbildungen verwendeten Schaltpläne werden mit BioRender.com erstellt.

1. Experimentelle Vorbereitung
<ol><li>Reinigen Sie das Plasmid pUC18T-mini-Tn7T-LAC-Gm9 (Insertionsplasmid, Abbildung 2A) mit dem interessierenden Gen. HINWEIS: Hier ist das interessierende Gen adeIJK. Die endgültige Plasmidkonzentration sollte ≥100 ng/μl betragen.</li>
	<li>Reinigen Sie das Helferplasmid (pTNS2)9 und das Exzisionsplasmid (pFLP2ab)6 (Abbildung 2B, C), idealerweise auf eine endgültige Plasmid-DNA-Konzentration von ≥100 ng/μl.</li>
	<li>Bereiten Sie 50 ml steriles Reinstwasser und 25 ml sterile LB-Bouillon (Lennox) vor (siehe Materialtabelle).</li>
	<li>Bereiten Sie mindestens 10 LB-Agarplatten vor, die jeweils die folgenden Zusätze enthalten: einfach (ohne Zusatzstoffe), Gentamicin (Gm) mit 50 μg/ml, Carbenicillin (Cb) mit 200 μg/ml (zur Auswahl über das Ampicillin-Resistenzgen) und 5% Saccharose (siehe Materialtabelle).</li>
	<li>Streichen Sie den Stamm aus, der zum Einsetzen auf LB-Agar verwendet werden soll, und inkubieren Sie ihn bei 37 °C für 16-18 h. Hier wird A. baumannii AB258 verwendet. HINWEIS: Dieses Protokoll muss so weit wie möglich in einer sterilen Umgebung durchgeführt werden, indem ein Bunsenbrenner auf dem Labortisch oder eine biologische Sicherheitswerkbank verwendet wird. Alle Verbrauchsmaterialien (Pipettenspitzen, Impfösen, Mikrofugenröhrchen usw.) müssen steril sein.</li>
</ol>2. Vorbereitung der Kultur
<ol><li>Eine einzelne Kolonie von A. baumannii AB258 in 4 ml LB-Bouillon in einem sterilen 13-ml-Kulturröhrchen mit einer sterilen Impföse oder einem sterilen hölzernen Impfstäbchen impfen. HINWEIS: Eine einzelne 4-ml-Kultur wird für eine Probe und eine Kontrolle verwendet. Erhöhen Sie die Anzahl der Kulturen in Abhängigkeit von der Anzahl der benötigten Proben.</li>
	<li>Über Nacht bei 37 °C unter Schütteln (250 U/min) inkubieren.</li>
	<li>Stellen Sie eine Flasche steriles destilliertes Wasser (25-50 ml) über Nacht auf 4 °C, um sie in Schritt 3 zu verwenden.</li>
</ol>3. Vorbereitung elektrokompetenter Zellen
<ol><li>Legen Sie alle sterilen 1,5-ml-Mikrofugeröhrchen (zwei pro Kultur) und sterilen Elektroporationsküvetten (zwei pro Kultur) auf Eis (siehe Materialtabelle). Halten Sie die Proben während des gesamten Verfahrens so weit wie möglich auf Eis.</li>
	<li>Stellen Sie die Flasche mit sterilem Wasser, die bei 4 °C gelagert wurde, auf Eis.</li>
	<li>Übertragen Sie 1,5 ml der Bakterienkultur über Nacht in eines der 1,5 ml-Mikrofugenröhrchen.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie 2 Minuten lang bei 13.000 x g , um die Zellen zu pelletieren. HINWEIS: Die Zentrifugation würde idealerweise bei 4 °C durchgeführt, aber die Zentrifugation bei Umgebungstemperatur ist akzeptabel und nicht schädlich.</li>
	<li>Entfernen Sie mit einer 1-ml-Pipette den gesamten Überstand, ohne das Zellpellet zu stören.</li>
	<li>Geben Sie weitere 1,5 ml Bakterienkultur in dasselbe Mikrofugenröhrchen. 2 Minuten bei 13.000 x g zentrifugieren und dann den gesamten Überstand entfernen.</li>
	<li>Wiederholen Sie Schritt 3.6 ein letztes Mal mit den verbleibenden 1 ml Kultur.</li>
	<li>Geben Sie 1 ml eiskaltes, steriles Wasser in das Zellpellet und resuspendieren Sie es durch vorsichtiges Pipettieren, bis das Pellet nicht mehr am Boden des Mikrofuge-Röhrchens sitzt.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die resuspendierten Zellen bei 13.000 x g für 2 min.</li>
	<li>Entfernen Sie den Überstand vorsichtig mit einer 1-ml-Pipette. Gießen Sie den Überstand nicht ab, insbesondere in den nachfolgenden Waschschritten, wenn die Zellen dazu neigen, weniger kompakte Pellets zu bilden.</li>
	<li>Wiederholen Sie diesen Waschschritt mit eiskaltem sterilem Wasser, Schritte 3.8 bis Schritt 3.10, noch zweimal.</li>
	<li>Resuspendieren Sie das endgültige Zellpellet vorsichtig in 200 μl eiskaltem, sterilem Wasser.</li>
	<li>100 μl der endgültigen Zellsuspension in das zweite eiskalte 1,5-ml-Mikrofugenröhrchen überführen. Dieses zweite Aliquot wird zur Negativkontrolle für die Elektroporation. Bewahren Sie die Zellproben auf Eis auf.</li>
</ol>4. Elektroporation
<ol><li>1 ml LB-Bouillon und eine LB + Gm50-Agarplatte (hergestellt in Schritt 1.4) für jede Probe vorwärmen und in einem statischen Inkubator auf 37 °C kontrollieren.</li>
	<li>In einem kombinierten Volumen von 5 μl oder weniger werden jeweils 100-200 ng des pTNS2-Helferplasmids und des pUC18T-mini-Tn7T-LAC-Gm-adeIJK-Insertionsplasmids zu einem Aliquot elektrokompetenter Zellen hinzugefügt.</li>
	<li>Mischen Sie mit sanftem Fingertippen, um eine vollständige Vermischung der Plasmide mit den elektrokompetenten Zellen ohne Blasenbildung zu gewährleisten.</li>
	<li>Ein äquivalentes Volumen sterilen destillierten Wassers in das Aliquot der Negativkontrollzelle geben und vorsichtig wie oben beschrieben mischen.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Proben 20 Minuten lang auf Eis.</li>
	<li>Übertragen Sie die gesamte Zellprobe in eine eiskalte Elektroporationsküvette und legen Sie die Küvette dann wieder auf Eis. Wiederholen Sie dies für die Probe der Negativkontrollzelle.</li>
	<li>Elektroporate die Zellprobe.<ol><li>Schalten Sie den Elektroporator ein und stellen Sie ihn auf 2,0 kV (25 μF, 200 Ω) ein (siehe Materialtabelle).</li>
		<li>Wischen Sie die Oberfläche der Küvette mit einem weichen Tuch ab, um anhaftendes Eis oder Feuchtigkeit zu entfernen.</li>
		<li>Führen Sie die Küvette in den Elektroporator ein und geben Sie den Stromschlag ab.</li>
		<li>Geben Sie sofort 0,9 ml vorgewärmte LB-Bouillon zu den Zellen in der Küvette und pipettieren Sie vorsichtig auf und ab, um die Zellen mit dem Medium zu mischen.</li>
		<li>Übertragen Sie die gesamte Zellsuspension in ein neues 1,5-ml-Mikrofugenröhrchen (Raumtemperatur).</li>
		<li>Überprüfen Sie den Zeitkonstantenwert am Elektroporator. Für beste Ergebnisse sollte dieser Wert zwischen 4 und 6 liegen.</li>
	</ol></li>
	<li>Wiederholen Sie das Elektroporationsverfahren (Schritte 4.7.1 bis Schritt 4.7.6) für die Probe der Negativkontrollzelle.</li>
	<li>Inkubieren Sie die elektroporierten Proben bei 37 °C für 1 h bei 250 U/min, um eine Zellrückgewinnung zu ermöglichen.</li>
	<li>Verteilen Sie mit einem Impfstreuer 100 μl jeder elektroporierten Zellprobe auf einer vorgewärmten LB + Gm50 Agarplatte.<ol><li>Zentrifugieren Sie die verbleibenden Proben 2 Minuten lang bei 13.000 x g , um die Zellen zu pelletieren.</li>
		<li>Nachdem Sie den gesamten Überstand mit einer Pipette entfernt haben, resuspendieren Sie die Zellen in 100 μl LB-Brühe.</li>
		<li>Jede gesamte Probe wird auf einzelne vorgewärmte LB + Gm50 Agarplatten verteilt. HINWEIS: Die Effizienz der Elektroporation kann dehnungsabhängig sein. Bei der erstmaligen Elektroporation eines Stammes kann es informativ sein, verschiedene Volumina oder sogar Verdünnungen der Elektroporationsprobe auszuplattieren, um sicherzustellen, dass die resultierenden Platten isolierte Kolonien aufweisen.</li>
	</ol></li>
	<li>Inkubieren Sie die Platten bei 37 °C für 16-18 h.</li>
</ol>5. Auswahl transformierter Kolonien für das PCR-basierte Screening
<ol><li>Überprüfen Sie die Elektroporationsplatten. Die Negativkontrolle sollte keine Kolonien haben; Die Probe sollte unterschiedliche Kolonien haben. HINWEIS: Platten mit Kolonien können in diesem Schritt und in allen nachfolgenden Schritten, in denen Agarplatten mit Kolonien oder Pflastern hergestellt werden, bis zu 3 Tage bei 4 °C gelagert werden, bevor sie fortfahren.</li>
	<li>Entnehmen Sie mit sterilen Zahnstochern bis zu 10 Einzelkolonien von den LB + Gm50 Agarplatten und flicken Sie sie auf eine frische LB + Gm50 Agarplatte.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Platten bei 37 °C für 16-18 h.</li>
</ol>6. Überprüfung der chromosomalen Insertion durch Kolonie-PCR
<ol><li>Entfernen Sie die LB + Gm50 Agarplatten mit den geflickten Kolonien aus dem Inkubator.</li>
	<li>Entfernen Sie mit einem sterilen Zahnstocher oder einer sterilen Pipettenspitze eine kleine Portion (etwa die Größe einer großen Kolonie) aus einem Pflaster in 20 μl steriles destilliertes Wasser in einem 0,2-ml-PCR-Röhrchen. Gut mischen. Die Wasserprobe sollte sichtbar trüb werden, wenn die Zellen aus dem Zahnstocher gelöst werden. Bereiten Sie eine beliebige Anzahl von Proben vor, die gescreent werden müssen, aber 6 sollten ausreichen.</li>
	<li>Inkubieren Sie das PCR-Röhrchen mit der Bakteriensuspension bei 100 °C für 5-10 Minuten.</li>
	<li>Schleudern Sie die Probe mit einer Mini-Zentrifuge (siehe Materialtabelle) 2 Minuten lang mit der festgelegten maximalen Geschwindigkeit, um Zellreste zu pelletieren.</li>
	<li>Übertragen Sie den Überstand in ein neues 0,2-ml-PCR-Röhrchen und legen Sie es auf Eis. Diese Probe enthält die Template-DNA für die PCR-Reaktion. HINWEIS: Diese Template-DNA kann bei -20 °C gelagert werden, bevor mit der PCR fortgefahren wird.</li>
	<li>Bereiten Sie ein PCR-Reaktionsgemisch vor, das 1x Polymerasepuffer, 200 μM dNTPs, 0,18 μM ABglmS2_F_New Forward-Primer, 0,18 μM Tn7R-Reverse-Primer (Tabelle 1), 1 U Taq-DNA-Polymerase und 1 μl der vorbereiteten Template-DNA in einem Gesamtvolumen von 25 μl enthält. Bereiten Sie eine No-Template-Kontrolle (NTC) vor, die alle bis auf die Template-DNA enthält (siehe Materialtabelle).</li>
	<li>Geben Sie die Reaktionsbedingungen in einen Thermocycler ein: 95 °C für 2 min; 95 °C für 30 s, 49 °C für 30 s und 72 °C für 30 s für insgesamt 35 Zyklen; 72 °C für 10 min; 12 °C halten. Führen Sie die Beispiele aus.</li>
	<li>Nach der Zugabe von DNA-Ladefarbstoff zu einer Endkonzentration von 1x werden 10 μl jeder PCR-Reaktion auf ein 2%iges Agarosegel geladen und 40 Minuten lang bei 80 V ausgeführt. Die erwartete Amplikongröße für dieses Primerpaar beträgt 382 bp. Der NTC sollte keine Bänder haben.</li>
	<li>Identifizieren Sie die Proben, die das erwartete PCR-Produkt hergestellt haben. Bereiten Sie eine Streifenplatte auf LB + Gm50-Agarplatten aus einem der PCR-positiven Pflaster vor; Bei 37 °C 16-18 h inkubieren. Ziel ist es, eine Platte mit einzelnen Kolonien für die Herstellung eines Glycerinbestands zu erzeugen, um diesen markierten Stamm zu konservieren und als Ausgangspunkt für die Erzeugung eines unmarkierten Stammes (siehe unten).</li>
</ol>7. Entfernung des GMR-Markers mit pFLP2ab
<ol><li>Befolgen Sie das in Schritt 2: Kulturvorbereitung beschriebene Verfahren. Die zur Vorbereitung der Übernachtkultur verwendete Probe ist eine einzelne Kolonie aus den LB + Gm50-Agarplatten , die in Schritt 6.9 zur Erzeugung diskreter Kolonien vorbereitet wurden.</li>
	<li>Befolgen Sie das in Schritt 3: Vorbereitung elektrokompetenter Zellen beschriebene Verfahren. Bereiten Sie die Zellen aus der Übernachtkultur für die Elektroporation vor.</li>
	<li>Befolgen Sie das in Schritt 4 beschriebene Verfahren: Elektroporation. Hier ist das Plasmid, das in die Zellen eingeführt werden soll, pFLP2ab (100-200 ng), das das Gentamicin-Resistenzgen entfernt und das chromosomal eingefügte Gen von Interesse flankiert.</li>
	<li>Nachdem sich die Zellen 1 h lang erholt haben (Schritt 4.9), verteilen Sie 100 μl der elektroporierten Zellprobe auf einer vorgewärmten LB + Cb200-Agarplatte (hergestellt in Schritt 1.4). Dieser Selektionsdruck stellt sicher, dass nur Zellen wachsen, die das pFLP2-Ab-Exzisionsplasmid beherbergen.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Platten bei 37 °C für 16-18 h.</li>
	<li>Überprüfen Sie die Platte auf Kolonien. Die Negativkontrollplatte sollte keine Kolonien haben; die LB + Cb200 Agar-Probenplatte sollte unterschiedliche Kolonien aufweisen.</li>
	<li>Mit sterilen Zahnstochern bis zu 20 isolierte Kolonien auf eine LB + Cb200 Agarplatte und eine LB + Gm50 Agarplatte kreuzen.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Platten 16-18 h bei 37 °C.</li>
	<li>Überprüfen Sie die Platten auf Flicken. Bei Klonen, die auf der LB + Cb200-Agarplatte , aber nicht auf der LB + Gm50-Agarplatte wachsen, wurde das Gentamicin-Resistenzgen aus dem ursprünglichen Insert entfernt.</li>
	<li>Wählen Sie die Pflaster aus, die Carbenicillin-resistent und Gentamicin sind, die anfällig für Streifen auf einzelnen LB-Agarplatten sind, die mit 5% (w/v) Saccharose ergänzt sind, wodurch die Ausstoßung des pFLP2-ab-Plasmids aus den Bakterien erzwungen wird. Wähle bis zu 10 Kolonien.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Platten 16-18 h bei 37 °C.</li>
	<li>Überprüfen Sie die Platten auf Kolonien.</li>
	<li>Als endgültige Bestätigung des pFLP2-ab-Plasmidverlusts werden 4-6 isolierte Kolonien von den 5%igen Saccharoseplatten auf eine LB + Cb200-Agarplatte und eine LB-Agarplatte gepatcht.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Platten 16-18 h bei 37 °C.</li>
	<li>Wählen Sie einen Klon, der auf der LB-Agarplatte wächst und Carbenicillin-empfindlich ist, für die Herstellung eines Glycerinstocks, um diesen unmarkierten Stamm zu erhalten.<ol><li>Die genetische Überprüfung des unmarkierten Stammes kann mit der Kolonie-PCR (Schritt 6: Überprüfung der chromosomalen Insertion durch Kolonie-PCR) unter Verwendung der Primer durchgeführt werden, die auf das Gentamicin-Resistenzgen abzielen.</li>
		<li>Bereiten Sie ein PCR-Reaktionsgemisch vor, das 1x Polymerasepuffer, 200 μM dNTPs, 0,18 μM Gm_F Vorwärtsprimer, 0,18 μM Gm_R Reverse-Primer (Tabelle 1), 1 U Taq-DNA-Polymerase und 1 μl der vorbereiteten Matrizen-DNA in einem Gesamtvolumen von 25 μl enthält. Bereiten Sie eine No-Template-Kontrolle (NTC) vor, die alle außer der Matrizen-DNA enthält. und eine Positivkontrolle unter Verwendung von DNA aus dem markierten Stamm.</li>
		<li>Geben Sie die Reaktionsbedingungen in einen Thermocycler ein: 95 °C für 2 min; 95 °C für 30 s, 50 °C für 30 s und 72 °C für 40 s für insgesamt 35 Zyklen; 72 °C für 10 min; 12 °C halten. Führen Sie die Beispiele aus.</li>
		<li>Nach der Zugabe von DNA-Ladefarbstoff zu einer Endkonzentration von 1x werden 10 μl jeder PCR-Reaktion auf ein 1%iges Agarosegel geladen und 40 Minuten lang bei 80 V ausgeführt. Die erwartete Amplikongröße für dieses Primerpaar beträgt 525 bp. Die Positivkontrolle sollte ein einzelnes Band haben; die Samples und der NTC sollten keine Bänder haben.</li>
	</ol></li>
</ol>

Einzelkopien-Genexpression zur Charakterisierung von Multidrug-Efflux-Systemen

<ol>
	<li>Prioritization of pathogens to guide research, discovery, research and development of new antibiotics for drug-resistant bacterial infections, including tuberculosis. World Health Organization Available from: <a target="_blank" href="https://www.who.int/publications/i/item/WHO-EMP-IAU-2017.12">https://www.who.int/publications/i/item/WHO-EMP-IAU-2017.12</a> (2017)</li><li>Kornelsen, V., Kumar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+multidrug+resistance+efflux+pumps+in+Acinetobacter+spp.">Update on multidrug resistance efflux pumps in Acinetobacter spp.</a> Antimicrob Agents Chemother. 65 (7), e00514-00521 (2021).</li><li>Sykes, E. M., Deo, S., Kumar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+genetic+tools+for+Acinetobacter+baumannii.">Recent advances in genetic tools for Acinetobacter baumannii.</a> Front Genet. 11, 601380 (2020).</li><li>Kumar, A., Chua, K. L., Schweizer, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+regulated+expression+of+single-copy+efflux+pump+genes+in+a+surrogate+Pseudomonas+aeruginosa+strain:+identification+of+the+BpeEF-OprC+chloramphenicol+and+trimethoprim+efflux+pump+of+Burkholderia+pseudomallei+1026b.">Method for regulated expression of single-copy efflux pump genes in a surrogate Pseudomonas aeruginosa strain: identification of the BpeEF-OprC chloramphenicol and trimethoprim efflux pump of Burkholderia pseudomallei 1026b.</a> Antimicrob Agents Chemother. 50 (10), 3460-3463 (2006).</li><li>Kumar, A., Dalton, C., Cortez-Cordova, J., Schweizer, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mini-Tn7+vectors+as+genetic+tools+for+single+copy+gene+cloning+in+Acinetobacter+baumannii.">Mini-Tn7 vectors as genetic tools for single copy gene cloning in Acinetobacter baumannii.</a> J Microbiol Methods. 82 (3), 296-300 (2010).</li><li>Ducas-Mowchun, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next+generation+of+Tn7-based+single-copy+insertion+elements+for+use+in+multi-+and+pan-drug+resistant+strains+of+Acinetobacter+baumannii.">Next generation of Tn7-based single-copy insertion elements for use in multi- and pan-drug resistant strains of Acinetobacter baumannii.</a> Appl Environ Microbiol. 85 (11), e00066-00119 (2019).</li><li>Ducas-Mowchun, K., De Silva, P. M., Patidar, R., Schweizer, H. P., Kumar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tn7-based+single-copy+insertion+vectors+for+Acinetobacter+baumannii.">Tn7-based single-copy insertion vectors for Acinetobacter baumannii.</a> Methods Mol Biol. 1946, 135-150 (2019).</li><li>Schweizer, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+the+Saccharomyces+cerevisiae+Flp-FRT+system+in+bacterial+genetics.">Applications of the Saccharomyces cerevisiae Flp-FRT system in bacterial genetics.</a> J Mol Microbiol Biotechnol. 5 (2), 67-77 (2003).</li><li>Choi, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Tn7-based+broad-range+bacterial+cloning+and+expression+system.">A Tn7-based broad-range bacterial cloning and expression system.</a> Nat Methods. 2 (6), 443-448 (2005).</li><li>Choi, K. H., Schweizer, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mini-Tn7+insertion+in+bacteria+with+single+attTn7+sites:+example+Pseudomonas+aeruginosa.">Mini-Tn7 insertion in bacteria with single attTn7 sites: example Pseudomonas aeruginosa.</a> Nat Protoc. 1 (1), 153-161 (2006).</li><li>Kornelsen, V., Unger, M., Kumar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atorvastatin+does+not+display+an+antimicrobial+activity+on+its+own+nor+potentiates+the+activity+of+other+antibiotics+against+Acinetobacter+baumannii+ATCC+17978+or+A.+baumannii+AB030.">Atorvastatin does not display an antimicrobial activity on its own nor potentiates the activity of other antibiotics against Acinetobacter baumannii ATCC 17978 or A. baumannii AB030.</a> Access Microbiol. 3, 000288 (2021).</li><li>Reyrat, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Counterselectable+markers:+untapped+tools+for+bacterial+genetics+and+pathogenesis.">Counterselectable markers: untapped tools for bacterial genetics and pathogenesis.</a> Infect Immun. 66 (9), 4011-4017 (1998).</li><li>Gay, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positive+selection+procedure+for+entrapment+of+insertion+sequence+elements+in+gram-negative+bacteria.">Positive selection procedure for entrapment of insertion sequence elements in gram-negative bacteria.</a> J Bacteriol. 164, 918-921 (1985).</li><li>Kyriakidis, I., Vasileiou, E., Pana, Z. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tragiannidis,+Acinetobacter+baumannii+antibiotic+resistance+mechanisms.">Tragiannidis, Acinetobacter baumannii antibiotic resistance mechanisms.</a> Pathogens. 10 (3), 373 (2021).</li><li>Clinical and Laboratory Standards Institute. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performance+standards+for+antimicrobial+susceptibility+testing.">Performance standards for antimicrobial susceptibility testing.</a> CLSI Supplement M100., 31st edn. , (2021).</li><li>Dijkshoorn, L., Nemec, A., Seifert, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+increasing+threat+in+hospitals:+multidrug-resistant+Acinetobacter+baumannii.">An increasing threat in hospitals: multidrug-resistant Acinetobacter baumannii.</a> Nature Reviews Microbiology. 5, 939-951 (2007).</li><li>Yildirim, S., Thompson, M. 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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mini-Tn7+insertion+in+bacteria+with+multiple+glmS-linked+attTn7+sites:+example+Burkolderia+mallei+ATCC+2334.">Mini-Tn7 insertion in bacteria with multiple glmS-linked attTn7 sites: example Burkolderia mallei ATCC 2334.</a> Nat Protoc. 1 (1), 162-169 (2006).</li><li>Jittawuttipoka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mini-Tn7+vectors+as+genetic+tools+for+gene+cloning+at+a+single+copy+number+in+an+industrially+important+and+phytopathogenic+bacteria,+Xanthomonas+spp.">Mini-Tn7 vectors as genetic tools for gene cloning at a single copy number in an industrially important and phytopathogenic bacteria, Xanthomonas spp.</a> FEMS Microbiol Lett. 298 (1), 111-117 (2009).</li><li>P&#233;rez-Varela, M., Tierney, A. R. P., Kim, J. S., V&#225;zquez-Torres, A., Rather, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+RelA+in+Acinetobacter+baumannii.">Characterization of RelA in Acinetobacter baumannii.</a> J Bacteriol. 202 (12), e00045 (2020).</li><li>Williams, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Acinetobacter+baumannii+copper+resistance+reveals+a+role+in+virulence.">Characterization of Acinetobacter baumannii copper resistance reveals a role in virulence.</a> Front Microbiol. 11, 16 (2020).</li></ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Auch wenn dieses Verfahren zur chromosomalen Insertion eines induzierbaren Einzelkopie-Genexpressionssystems in A. baumannii technisch einfach und nicht arbeitsintensiv ist, gibt es einige wichtige Schritte, die hervorgehoben werden müssen. Zunächst muss die Präparation der kompetenten Zellen so weit wie möglich auf Eis erfolgen, da die Zellen beim Austausch des Mediums durch eiskaltes Wasser zerbrechlich werden. Idealerweise werden die Zentrifugationsschritte bei 4 °C durchgeführt, aber eine Zentrifugatio...

Acinetobacter baumannii ist aufgrund seiner umfassenden Resistenz gegen alle Klassen von Antibiotika ein Krankheitserreger der Weltgesundheitsorganisation mit höchster Priorität1. Es ist ein opportunistischer Erreger, der hauptsächlich hospitalisierte, verletzte oder immungeschwächte Menschen betrifft. A. baumannii entzieht sich Antibiotika weitgehend über Effluxpumpen, wobei die relevanteste die Exporteursfamilie der Resistance-Nodulation-Division (RND)ist 2. Wenn man versteht, wie diese Effluxpumpen mechanistisch funktionieren, kann man gezielte therapeutische Optionen entwickeln.
Eine gängige Methode, um zelluläre Prozesse spezifisch zu unterscheiden, ist die genetische Manipulation. Die für genetische Studien von A. baumannii verfügbaren Werkzeuge sind jedoch begrenzt, und um das experimentelle Design weiter zu verwirren, sind klinische Isolate oft resistent gegen die Antibiotika, die routinemäßig für die Selektion bei genetischen Manipulationen verwendet werden3. Eine zweite Hürde bei der Untersuchung von Ausflusspumpen besteht darin, dass sie streng reguliert werden - oft durch unbekannte Faktoren -, was es schwierig macht, eine einzelne Pumpe genau zu isolieren und ihrer Funktion zuzuordnen4. Angesichts dieser Notwendigkeit, den Forschungswerkzeugkasten zu erweitern, haben wir ein induzierbares Mini-Tn7-basiertes, induzierbares Expressionssystem mit Einzelkopie-Insertion entwickelt, das eine Flp-Rekombinase-Zielkassette (FRT) enthält, die die Entfernung des Selektionsmarkers 5,6,7 ermöglicht (Abbildung 1). Dieses elegante Klonierungs- und Expressionssystem wurde erstmals für Pseudomonas 8,9,10 entwickelt und verwendet, um Einzelkopie-Effluxpumpenkomplemente in einen RND-Effluxpumpen-defizienten Stamm von A. baumannii (ATCC 17978::ΔadeIJK,Δ adeFGH,Δ adeAB: im Folgenden als A. baumannii AB258 bezeichnet) zu erzeugen, den wir11. Wenn man in der Lage ist, eine Effluxpumpe nach der anderen zu untersuchen und die Bakterienzellen nicht mit einer hohen Kopienexpression zu überfordern (wie es im Allgemeinen bei plasmidbasierten Expressionssystemen der Fall ist), kann man die kritischen, physiologischen Aspekte jeder Effluxpumpe mit minimaler Interferenz und reduzierten Komplikationen besser kennenlernen.
Dieser Artikel beschreibt, wie das Mini-Tn7-System verwendet wird, um ein deletiertes Gen von Interesse, die RND-Effluxpumpe adeIJK, durch eine Reihe von unkomplizierten Schritten, die im Laufe von 9 Tagen durchgeführt werden, in das Chromosom von A. baumannii AB258 zu ergänzen7. Die erste Gruppe von Schritten führt die deletierten Effluxpumpengene, die in das mini-Tn7-basierte Insertionsplasmid kloniert wurden (Abbildung 2A), an der einzelnen att-Tn7-Insertionsstelle stromabwärts des gut konservierten glmS-Gens wieder ein (Abbildung 3A). Dieser Prozess wird durch ein nicht-replikatives Helferplasmid (Abbildung 2B) erleichtert, das für die Transposase-Gene kodiert, die für die Tn7-gesteuerte Insertion benötigt werden. Die zweite Gruppe von Schritten verwendet ein Exzisionsplasmid (Abbildung 2C) zur Flp-Rekombinase-vermittelten Entfernung des Gentamicin-Gens, flankiert von FRT-Stellen (Abbildung 3B), um einen unmarkierten Stamm zu erzeugen. Obwohl dieses System verwendet wird, um die wesentlichen Rollen und möglichen Inhibitoren von RND-Effluxpumpen in Bezug auf Antibiotikaresistenz aufzuklären, kann es zur Untersuchung jedes Gens von Interesse verwendet werden.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 mL PCR tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20170-012</td>
			<td>For colony boil preparations and PCR reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microfuge tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72-690-301</td>
			<td>General use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13-mL culture tubes, Pyrex</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-957K</td>
			<td>Liquid culture vessels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6x DNA loading buffer</td>
			<td>Froggabio</td>
			<td>LD010</td>
			<td>Agarose gel electrophoresis sample loading dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid, glacial</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>351271-212</td>
			<td>Agarose gel running buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>AGR003</td>
			<td>Solid growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>BioBasic</td>
			<td>D0012</td>
			<td>Electrophoretic separation of PCR reaction products; used at a concentration of 0.8&#8211;2%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose gel electrophoresis unit</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>29-237-54</td>
			<td>Agarose gel electrophoresis; separation of PCR reaction products</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50841231</td>
			<td>Selective media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture tube closures</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-684-138</td>
			<td>Stainless steel closure for 13-mL culture tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxynucleotide triphosphate (dNTP) set</td>
			<td>Biobasic</td>
			<td>DD0058</td>
			<td>PCR reaction component; supplied as 100 mM each dATP, dCTP, dGTP, dTTP; mixed and diluted for 10 mM each dNTP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry bath/block heater</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>88860023</td>
			<td>Isotemp digital dry bath for boil preparations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation cuvettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89047-208</td>
			<td>2 mm electroporation cuvettes with round cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporator</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>940000009</td>
			<td>110 VAC, 60 Hz electroporator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP102-1</td>
			<td>Visualization of PCR reaction products and DNA marker in agarose gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CA-EM4050</td>
			<td>Agarose gel running buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Biobasic</td>
			<td>GB0217</td>
			<td>For the preparation of selective media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>G33</td>
			<td>Preparation of bacterial stocks for long-term storage in an ultra-low freezer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator (shaking)</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>M1352-0000</td>
			<td>Excella E24 Incubator Shaker for liquid culture growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator (static)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>11-690-550D</td>
			<td>Isotemp Incubator Oven Model 550D for solid (LB agar) culture growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inoculation loop</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>86.1562.050</td>
			<td>Streaking colonies onto agar plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inoculation spreader</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>86.1569.005</td>
			<td>Spreading of culture onto agar plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysogeny broth (LB) broth, Lennox</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1427</td>
			<td>Liquid growth media (20 g/L: 5 g/L sodium chloride, 10 g/L tryptone, 5 g/L yeast extract)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>75002431</td>
			<td>Sorvall Legend Micro 17 for centrifugation of samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-centrifuge</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S67601B</td>
			<td>Centrifugation of 0.2 mL PCR tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>SPL Life Sciences</td>
			<td>10090</td>
			<td>For solid growth media (agar plates): 90 x 15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes&#160;</td>
			<td>Mandel</td>
			<td>Various</td>
			<td>Gilson single channel pipettes (P10, P20, P200, P1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power supply</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1645050</td>
			<td>PowerPac Basic power supply for electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers</td>
			<td>IDT</td>
			<td>NA</td>
			<td>PCR reaction component; specific to gene of interest; prepared at 100 &#956;M as directed on the product specification sheet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>BioBasic</td>
			<td>SB0498</td>
			<td>For the preparation of counterselective media for removal of the pFLP2ab plasmid from transformed A. baumannii</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA polymerase</td>
			<td>FroggaBio</td>
			<td>T-500</td>
			<td>PCR reaction component; polymerase supplied with a 10x buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal cycler</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1861096</td>
			<td>Model T100 for PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toothpicks</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S24559</td>
			<td>For patching colonies onto agar plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1503</td>
			<td>Agarose gel running buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>ZLXLSD51040</td>
			<td>MilliQ water purification system: ultra pure water for media and solution preparation, and cell washing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wide range DNA marker</td>
			<td>Biobasic</td>
			<td>M103R-2</td>
			<td>Size determination of PCR products on an agarose gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wooden inoculating sticks</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>29-801-02</td>
			<td>Inoculating cultures with colonies from agar plates</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterizing multidrug efflux systems in acinetobacter baumannii using an efflux&#45;deficient bacterial strain and a single&#45;copy gene expression system

Acinetobacter baumannii ist aufgrund seiner weit verbreiteten Resistenz gegen Antibiotika als anspruchsvoller gramnegativer Erreger anerkannt. Es ist entscheidend, die Mechanismen hinter dieser Resistenz zu verstehen, um neue und wirksame Therapieoptionen zu entwickeln. Leider wird unsere Fähigkeit, diese Mechanismen bei A. baumannii zu untersuchen, durch den Mangel an geeigneten Genmanipulationswerkzeugen behindert. Hier beschreiben wir Methoden zur Verwendung eines chromosomalen mini-Tn7-basierten Systems, um eine Einzelkopie-Genexpression in einem A. baumannii-Stamm zu erreichen, dem funktionelle RND-Typ-Efflux-Mechanismen fehlen. Einzelkopieninsertion und induzierbare Effluxpumpenexpression sind sehr vorteilhaft, da das Vorhandensein von RND-Efflux-Operonen auf Plasmiden mit hoher Kopienzahl von Bakterienzellen oft schlecht vertragen wird. Darüber hinaus hilft der Einbau rekombinanter mini-Tn7-Expressionsvektoren in das Chromosom eines Surrogat-A . baumannii-Wirts mit erhöhter Effluxempfindlichkeit, Interferenzen durch andere Effluxpumpen zu umgehen. Dieses System ist nicht nur für die Untersuchung uncharakterisierter bakterieller Effluxpumpen wertvoll, sondern auch für die Bewertung der Wirksamkeit potenzieller Inhibitoren, die auf diese Pumpen abzielen.

Acinetobacter baumannii is a World Health Organization top priority pathogen due to its encompassing resistance to all classes of antibiotics1. It is an opportunistic pathogen mostly affecting hospitalized, injured, or immunocompromised people. A. baumannii largely evades antibiotics via efflux pumps, the most relevant being the Resistance-Nodulation-Division (RND) family of exporters2. Understanding how these efflux pumps work mechanistically will allow one to develop targeted therapeutic options.
One common way that cellular processes can be specifically distinguished is through genetic manipulation. However, the tools available for A. baumannii genetic studies are limited, and to further confound experimental design, clinical isolates often are resistant to the antibiotics routinely used for selection in genetic manipulations3. A second hurdle encountered when studying efflux pumps specifically is that they are strictly regulated-often by unknown factors-making it difficult to accurately isolate and attribute function to a single pump4. Seeing this need to expand the research toolbox, we developed a mini-Tn7-based, single-copy-insertion, inducible expression system that incorporates a Flp recombinase target (FRT) cassette, which allows for the removal of the selection marker5,6,7 (Figure 1). First created for Pseudomonas8,9,10, this elegant cloning and expression system was used to generate single-copy efflux pump complements into an RND efflux pump-deficient strain of A. baumannii (ATCC 17978::&#916;adeIJK,&#916;adeFGH,&#916;adeAB: hereafter referred to as A. baumannii AB258) that we generated11. Being able to study one efflux pump at a time and not overwhelm the bacterial cells with high-copy expression (as generally seen with plasmid-based expression systems), one can better learn about the critical, physiological aspects of each efflux pump with minimal interference and reduced complications.
This article describes how to use the mini-Tn7 system to complement a deleted gene of interest, RND efflux pump adeIJK, into the chromosome of A. baumannii AB258 through a series of uncomplicated steps performed over the course of 9 days7. The first set of steps re-introduces the deleted efflux pump genes cloned into the mini-Tn7-based insertion plasmid (Figure 2A) at the single attTn7 insertion site downstream of the well-conserved glmS gene (Figure 3A). This process is facilitated by a non-replicative helper plasmid (Figure 2B) that encodes for the transposase genes needed for Tn7-driven insertion. The second set of steps uses an excision plasmid (Figure 2C) for Flp recombinase-mediated removal of the gentamicin gene flanked by FRT sites (Figure 3B) to create an unmarked strain. Though this system is used to elucidate the essential roles and possible inhibitors of RND efflux pumps with respect to antibiotic resistance, it can be used to investigate any gene of interest.

Autor im Rampenlicht: Förderung der Antibiotikaresistenzforschung mit einem Efflux-defizienten Bakterienstamm und einem Single-Copy-Genexpressionssystem

Charakterisierung von Multidrug-Efflux-Systemen in Acinetobacter baumannii unter Verwendung eines Efflux-defizienten Bakterienstamms und eines Single-Copy-Genexpressionssystems

We study multi-drug resistance efflux systems in gram-negative bacteria. We are interested in learning about the natural functions of these pumps and how these pumps can be used as a potential drug target. Expression of multi-drug resistance efflux systems is tightly regulated, making it difficult to study their functions.Thus, an expression system that bypasses the regulatory system can be quite useful in the characterization of these pumps. This protocol allows for the expression of genes at levels usually seen in natural settings. Thus, the activity of the gene products mimics what is observed in nature.

Das Chromosomeninsertionsverfahren dauert insgesamt nur 2 Stunden über 3 Tage, um ein Ergebnis zu sehen - Kolonien wachsen auf einer selektiven Agarplatte (Abbildung 1A-C). Die erwartete Anzahl von Kolonien auf der Transformationsplatte ist stammabhängig: Man kann 20-30 oder sogar Hunderte von Kolonien sehen, da die Insertion von Tn7 an attTn7-Stellen spezifisch und effizient ist9. Das Patchen von Transformationsplattenkolo...

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Wir beschreiben ein einfaches Verfahren zur chromosomalen Einzelkopie-Komplementierung eines Efflux-Pumpengens unter Verwendung eines mini-Tn7-basierten Expressionssystems in einen gentechnisch veränderten Efflux-defizienten Stamm von Acinetobacter baumannii. Dieses präzise genetische Werkzeug ermöglicht eine kontrollierte Genexpression, die für die Charakterisierung von Effluxpumpen in multiresistenten Krankheitserregern von entscheidender Bedeutung ist.

Acinetobacter baumannii is recognized as a challenging Gram-negative pathogen due to its widespread resistance to antibiotics. It is crucial to comprehend ...

Wir untersuchen Multiresistenz-Efflux-Systeme in gramnegativen Bakterien. Wir sind daran interessiert, mehr über die natürlichen Funktionen dieser Pumpen zu erfahren und wie diese Pumpen als potenzielles Ziel für Medikamente eingesetzt werden können. Die Expression von Multiresistenz-Effluxsystemen ist streng reguliert, was es schwierig macht, ihre Funktionen zu untersuchen.Daher kann ein Expressionssystem, das das regulatorische System umgeht, bei der Charakterisierung dieser Pumpen sehr nützlich sein. Dieses Protokoll ermöglicht die Expression von Genen auf einem Niveau, das normalerweise in natürlichen Umgebungen zu beobachten ist. Die Aktivität der Genprodukte ahmt also das nach, was in der Natur beobachtet wird.

characterizing-multidrug-efflux-systems-acinetobacter-baumannii-using

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Characterizing Multidrug Efflux Systems in Acinetobacter baumannii Using an Efflux&#45;Deficient Bacterial Strain and a Single&#45;Copy Gene Expression System

346 Aufrufe.  University of Manitoba. Wir untersuchen Multiresistenz-Efflux-Systeme in gramnegativen Bakterien. Wir sind daran interessiert, mehr über die natürlichen Funktionen dieser Pumpen zu erfahren und wie diese Pumpen als potenzielles Ziel für Medikamente eingesetzt werden können. Die Expression von Multiresistenz-Effluxsystemen ist streng reguliert, was es schwierig macht, ihre Funktionen zu untersuchen.Daher kann ein Expressionssystem, das das regulatorische System umgeht, bei der Charakterisierung dieser Pump...

Serie: Autor im Rampenlicht: Förderung der Antibiotikaresistenzforschung mit einem Efflux-defizienten Bakterienstamm und einem Single-Copy-Genexpressionssystem