Bu çalışma, Kanada Doğa Bilimleri ve Mühendislik Konseyi'nden AK'ye bir Keşif Hibesi ile desteklenmiştir. Şekillerde kullanılan şemalar BioRender.com ile oluşturulmuştur.

1. Deneysel hazırlık
<ol><li>Plazmid pUC18T-mini-Tn7T-LAC-Gm9'u (ekleme plazmidi, Şekil 2A) ilgilenilen gen ile saflaştırın. NOT: Burada ilgilenilen gen adeIJK'dir. Nihai plazmit konsantrasyonu ≥100 ng/μL olmalıdır.</li>
	<li>Yardımcı plazmidi (pTNS2)9 ve eksizyon plazmidini (pFLP2ab)6 (Şekil 2B,C, sırasıyla), ideal olarak ≥100 ng/μL'lik bir nihai plazmit DNA konsantrasyonuna kadar saflaştırın.</li>
	<li>50 mL steril ultra saf su ve 25 mL steril LB (Lennox) suyu hazırlayın (Malzeme Tablosuna bakınız).</li>
	<li>Her biri aşağıdaki katkı maddelerini içeren en az 10 LB agar plakası hazırlayın: sade (katkı maddesi yok), 50 μg/mL'de gentamisin (Gm), 200 μg/mL'de karbenisilin (Cb) (ampisilin direnç geni yoluyla seçim için) ve %5 sükroz (bkz.</li>
	<li>LB agar üzerine yerleştirmek için kullanılacak suşu çizgiden çıkarın ve 37 °C'de 16-18 saat inkübe edin. Burada A. baumannii AB258 kullanılır. NOT: Bu protokol, mümkün olduğunca steril bir ortamda, tezgahta bir Bunsen brülörü veya biyolojik güvenlik kabini kullanılarak gerçekleştirilmelidir. Tüm sarf malzemelerinin (pipet uçları, aşılama halkaları, mikrofüj tüpleri vb.) steril olması gerekir.</li>
</ol>2. Kültür hazırlığı
<ol><li>Tek bir A. baumannii AB258 kolonisini, steril bir aşılama döngüsü veya steril ahşap aşılama çubuğu kullanarak steril bir 13 mL kültür tüpünde 4 mL LB suyuna aşılayın. NOT: Bir numune ve bir kontrol için tek bir 4 mL kültür kullanılır. İhtiyaç duyulan numune sayısına bağlı olarak kültür sayısını artırın.</li>
	<li>Gece boyunca 37 °C'de çalkalayarak (250 rpm) inkübe edin.</li>
	<li>3. adımda kullanmak için gece boyunca 4 °C'de bir şişe steril damıtılmış su (25-50 mL) yerleştirin.</li>
</ol>3. Elektroyetkin hücrelerin hazırlanması
<ol><li>Tüm steril 1.5 mL mikrofüj tüplerini (kültür başına iki adet) ve steril elektroporasyon küvetlerini (kültür başına iki adet) buz üzerine yerleştirin (Malzeme Tablosuna bakınız). Numuneleri prosedür boyunca mümkün olduğunca buz üzerinde tutun.</li>
	<li>4 °C'de saklanan steril su şişesini buzun üzerine koyun.</li>
	<li>Gece boyunca bakteri kültürünün 1.5 mL'sini 1.5 mL'lik mikrofüj tüplerinden birine aktarın.</li>
	<li>Hücreleri peletlemek için 13.000 x g'da 2 dakika santrifüjleyin. NOT: Santrifüjleme ideal olarak 4 °C'de gerçekleştirilir, ancak ortam sıcaklığında santrifüjleme kabul edilebilir ve zararlı değildir.</li>
	<li>1 mL'lik bir pipet kullanarak, hücre peletini bozmadan tüm süpernatanı çıkarın.</li>
	<li>Aynı mikrofüj tüpüne 1.5 mL daha bakteri kültürü ekleyin. 2 dakika boyunca 13.000 x g'da santrifüjleyin, ardından tüm süpernatanı çıkarın.</li>
	<li>Kalan 1 mL kültürle 3.6 adımını son bir kez tekrarlayın.</li>
	<li>Hücre peletine 1 mL buz gibi steril su ekleyin ve pelet artık mikrofüj tüpünün dibinde kalmayana kadar hafif pipetleme ile yeniden süspanse edin.</li>
	<li>Yeniden süspanse edilmiş hücreleri 2 dakika boyunca 13.000 x g'da santrifüjleyin.</li>
	<li>1 mL'lik bir pipet kullanarak süpernatanı dikkatlice çıkarın. Süpernatanı, özellikle hücrelerin daha az kompakt topaklar oluşturma eğiliminde olduğu sonraki yıkama adımlarında dökmeyin.</li>
	<li>Bu yıkama adımını buz gibi steril suyla, 3.8'den 3.10'a kadar olan adımları iki kez daha tekrarlayın.</li>
	<li>Son hücre peletini 200 μL buz gibi steril suda nazikçe yeniden süspanse edin.</li>
	<li>Son hücre süspansiyonunun 100 μL'sini ikinci buz gibi soğuk 1.5 mL mikrofüj tüpüne aktarın. Bu ikinci alikot, elektroporasyon için negatif kontrol olacaktır. Hücre örneklerini buz üzerinde tutun.</li>
</ol>4. Elektroporasyon
<ol><li>Her numune için 1 mL LB et suyu ve bir LB + Gm50 agar plakası (adım 1.4'te hazırlanmıştır) önceden ısıtın ve 37 °C'ye ayarlanmış statik bir inkübatörde kontrol edin.</li>
	<li>5 μL veya daha az birleşik bir hacimde, pTNS2 yardımcı plazmidinin her birine 100-200 ng ekleyin ve pUC18T-mini-Tn7T-LAC-Gm-adeIJK ekleme plazmiti, elektroyetkin hücrelerin bir alikotuna ekleyin.</li>
	<li>Plazmitlerin elektroyetkin hücrelerle kabarcıklar oluşturmadan tam olarak karışmasını sağlamak için parmak ucuyla hafifçe vurarak karıştırın.</li>
	<li>Negatif kontrol hücresi alikotuna eşdeğer hacimde steril damıtılmış su ekleyin ve yukarıdaki gibi hafifçe karıştırın.</li>
	<li>Numuneleri buz üzerinde 20 dakika inkübe edin.</li>
	<li>Tüm hücre örneğini buz gibi bir elektroporasyon küvetine aktarın, ardından küveti tekrar buzun üzerine yerleştirin. Negatif kontrol hücresi örneği için tekrarlayın.</li>
	<li>Hücre örneğini elektroporate edin.<ol><li>Elektroporatörü açın ve 2.0 kV'a (25 μF, 200 Ω) ayarlayın (bkz.</li>
		<li>Yapışan buz veya nemi gidermek için küvetin yüzeyini yumuşak bir bezle silin.</li>
		<li>Küveti elektroporatöre yerleştirin ve elektrik çarpmasını sağlayın.</li>
		<li>Küvetteki hücrelere hemen 0,9 mL önceden ısıtılmış LB suyu ekleyin ve hücreleri ortamla karıştırmak için hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyin.</li>
		<li>Tüm hücre süspansiyonunu yeni bir 1.5 mL mikrofüj tüpüne (oda sıcaklığı) aktarın.</li>
		<li>Elektroporatör üzerindeki zaman sabiti değerini kontrol edin; En iyi sonuçlar için bu değer 4 ile 6 arasında olmalıdır.</li>
	</ol></li>
	<li>Negatif kontrol hücresi numunesi için elektroporasyon prosedürünü tekrarlayın (adım 4.7.1 ila adım 4.7.6).</li>
	<li>Hücre geri kazanımına izin vermek için elektroporasyonlu numuneleri 37 °C'de 250 rpm'de 1 saat inkübe edin.</li>
	<li>Bir aşılama yayıcı kullanarak, her bir elektroporasyonlu hücre örneğinin 100 μL'sini önceden ısıtılmış bir LB + Gm50 agar plakasına yayın.<ol><li>Hücreleri peletlemek için kalan numuneleri 13.000 x g'da 2 dakika santrifüjleyin.</li>
		<li>Bir pipet kullanarak tüm süpernatantı çıkardıktan sonra, hücreleri 100 μL LB et suyunda yeniden süspanse edin.</li>
		<li>Her bir numunenin tamamını önceden ısıtılmış ayrı ayrı LB + Gm50 agar plakalarına yayın. NOT: Elektroporasyon verimliliği gerilime bağlı olabilir. Bir suşun ilk kez elektropolasyonu yapılırken, elde edilen plakaların izole kolonilere sahip olduğundan emin olmak için elektroporasyon numunesinin farklı hacimlerini ve hatta seyreltmelerini plakalamak bilgilendirici olabilir.</li>
	</ol></li>
	<li>Plakaları 37 °C'de 16-18 saat inkübe edin.</li>
</ol>5. PCR tabanlı tarama için dönüştürülmüş kolonilerin seçilmesi
<ol><li>Elektroporasyon plakalarını kontrol edin. Negatif kontrolün kolonisi olmamalıdır; Numunenin farklı kolonileri olmalıdır. NOT: Kolonili plakalar, bu adımda ve kolonili veya yamalı agar plakalarının üretildiği sonraki tüm adımlarda, devam etmeden önce 4 °C'de 3 güne kadar saklanabilir.</li>
	<li>Steril kürdan kullanarak, LB + Gm50 agar plakalarından 10 adede kadar tek koloni alın ve bunları taze bir LB + Gm50 agar plakasına yamalayın.</li>
	<li>Plakaları 37 °C'de 16-18 saat inkübe edin.</li>
</ol>6. Koloni PCR ile kromozomal insersiyonun doğrulanması
<ol><li>Yamalı kolonileri içeren LB + Gm50 agar plakalarını inkübatörden çıkarın.</li>
	<li>Steril bir kürdan veya steril pipet ucu kullanarak, bir yamadan küçük bir kısmı (yaklaşık büyük bir koloni büyüklüğünde) 20 mL'lik bir PCR tüpünde 0.2 μL steril damıtılmış suya çıkarın; İyice karıştırın. Hücreler kürdandan salınırken su numunesi gözle görülür şekilde bulanıklaşmalıdır. Taranması gereken herhangi bir sayıda numune hazırlayın, ancak 6 yeterli olmalıdır.</li>
	<li>Bakteriyel süspansiyonu içeren PCR tüpünü 100 °C'de 5-10 dakika inkübe edin.</li>
	<li>Bir mini santrifüj kullanarak (Malzeme Tablosuna bakın), hücresel kalıntıları peletlemek için numuneyi 2 dakika boyunca sabit maksimum hızda döndürün.</li>
	<li>Süpernatanı yeni bir 0.2 mL PCR tüpüne aktarın ve buzun üzerine yerleştirin. Bu numune, PCR reaksiyonu için şablon DNA'yı içerir. NOT: Bu şablon DNA, PCR'ye devam etmeden önce -20 °C'de saklanabilir.</li>
	<li>1x polimeraz tamponu, 200 μM dNTP'ler, 0.18 μM ABglmS2_F_New ileri primer, 0.18 μM Tn7R ters primer (Tablo 1), 1 U Taq DNA polimeraz ve 1 μL içeren bir PCR reaksiyon karışımı hazırlayın hazırlanan şablon DNA toplam 25 μL hacimde. Şablon DNA hariç tümü dahil olmak üzere şablonsuz bir kontrol (NTC) hazırlayın (bkz.</li>
	<li>Reaksiyon koşullarını bir termal döngüleyiciye girin: 2 dakika boyunca 95 °C; 30 sn için 95 °C, 30 sn için 49 °C ve 30 sn için 72 °C olmak üzere toplam 35 döngü; 10 dakika boyunca 72 °C; 12 °C tutun. Örnekleri çalıştırın.</li>
	<li>DNA yükleme boyasının 1x'lik bir nihai konsantrasyona eklenmesini takiben,% 2'lik bir agaroz jel üzerine her bir PCR reaksiyonunun 10 μL'sini yükleyin ve 40 dakika boyunca 80 V'ta çalıştırın. Bu primer çifti için beklenen amplikon boyutu 382 bp'dir. NTC'nin bantları olmamalıdır.</li>
	<li>Beklenen PCR ürününü üreten numuneleri tanımlayın. PCR pozitif yamaların herhangi birinden LB + Gm50 agar plakaları üzerinde bir çizgi plakası hazırlayın; 37 °C'de 16-18 saat inkübe edin. Amaç, bu işaretli suşu korumak için bir gliserol stoğunun hazırlanması için ve işaretsiz bir suş oluşturmak için bir başlangıç noktası olarak tek kolonili bir plaka oluşturmaktır (aşağıda açıklanmıştır).</li>
</ol>7.pFLP2 ab kullanılarak GmR işaretleyicisinin çıkarılması
<ol><li>Adım 2'de belirtilen prosedürü izleyin: Kültür hazırlama. Gece kültürünü hazırlamak için kullanılan numune, adım 6.9'da ayrı koloniler oluşturmak için hazırlanan LB + Gm50 agar plakalarından tek bir kolonidir.</li>
	<li>Adım 3'te belirtilen prosedürü izleyin: Elektrokompetan hücrelerin hazırlanması. Elektroporasyon için gece kültüründen hücreleri hazırlayın.</li>
	<li>Adım 4'te belirtilen prosedürü izleyin: Elektroporasyon. Burada, hücrelere sokulacak plazmit, ilgilenilen kromozomal olarak yerleştirilmiş geni çevreleyen gentamisin direnç genini ortadan kaldıracak olan pFLP2ab'dir (100-200 ng).</li>
	<li>Hücreler 1 saat boyunca iyileştikten sonra (adım 4.9), elektroporasyonlu hücre numunesinin 100 μL'sini önceden ısıtılmış bir LB + Cb200 agar plakasına (adım 1.4'te hazırlanır) yayın. Bu seçici basınç, yalnızca pFLP2ab eksizyon plazmidini barındıran hücrelerin büyümesini sağlar.</li>
	<li>Plakaları 37 °C'de 16-18 saat inkübe edin.</li>
	<li>Plakada koloni olup olmadığını kontrol edin. Negatif kontrol plakasında koloni olmamalıdır; LB + Cb200 agar numune plakası farklı kolonilere sahip olmalıdır.</li>
	<li>Steril kürdan kullanarak, 20'ye kadar izole koloniyi bir LB + Cb200 agar plakasına ve bir LB + Gm50 agar plakasına çapraz yamalayın.</li>
	<li>Plakaları 37 °C'de 16-18 saat inkübe edin.</li>
	<li>Plakalarda yama olup olmadığını kontrol edin. LB + Cb200 agar plakasında büyüyen, ancak LB + Gm50 agar plakasında büyümeyen klonlar, gentamisin direnç genini orijinal ek parçadan çıkarmıştır.</li>
	<li>pFLP2ab plazmidinin bakterilerden atılmasını zorlayan% 5 (a / h) sükroz ile desteklenmiş ayrı LB agar plakalarına çizilmeye duyarlı karbenisiline dirençli ve gentamisine duyarlı yamaları seçin. En fazla 10 koloni seçin.</li>
	<li>Plakaları 37 °C'de 16-18 saat inkübe edin.</li>
	<li>Koloniler için plakaları kontrol edin.</li>
	<li>pFLP2ab plazmit kaybının son bir teyidi olarak,% 5 sükroz plakalarından izole edilmiş 4-6 koloniyi bir LB + Cb200 agar plakasına ve bir LB agar plakasına çapraz yamalayın.</li>
	<li>Plakaları 37 °C'de 16-18 saat inkübe edin.</li>
	<li>LB agar plakasında büyüyen ve bu işaretsiz suşu korumak için bir gliserol stoğunun hazırlanması için karbenisiline duyarlı bir klon seçin.<ol><li>İşaretlenmemiş suşun genetik doğrulaması, gentamisin direnç genini hedef alan primerler kullanılarak koloni PCR (adım 6: Koloni PCR ile kromozomal insersiyonun doğrulanması) ile gerçekleştirilebilir.</li>
		<li>1x polimeraz tamponu, 200 μM dNTP, 0.18 μM Gm_F ileri primer, 0.18 μM Gm_R ters primer (Tablo 1), 1 U Taq DNA polimeraz ve 1 μL toplam 25 μL hacimde hazırlanan şablon DNA içeren bir PCR reaksiyon karışımı hazırlayın. Şablon DNA hariç tümünü içeren şablonsuz bir kontrol (NTC) hazırlayın, ve işaretli suştan DNA kullanılarak pozitif bir kontrol.</li>
		<li>Reaksiyon koşullarını bir termal döngüleyiciye girin: 2 dakika boyunca 95 °C; 30 sn için 95 °C, 30 sn için 50 °C ve 40 sn için 72 °C olmak üzere toplam 35 döngü; 10 dakika boyunca 72 °C; 12 °C tutun. Örnekleri çalıştırın.</li>
		<li>DNA yükleme boyasının 1x'lik bir nihai konsantrasyona eklenmesini takiben,% 1'lik bir agaroz jel üzerine her bir PCR reaksiyonunun 10 μL'sini yükleyin ve 40 dakika boyunca 80 V'ta çalıştırın. Bu primer çifti için beklenen amplikon boyutu 525 bp'dir. Pozitif kontrol tek bir banda sahip olmalıdır; numuneler ve NTC'de bant olmamalıdır.</li>
	</ol></li>
</ol>

Çoklu İlaç Akış Sistemlerini Karakterize Etmek için Tek Kopyalı Gen İfadesi

<ol>
	<li>Prioritization of pathogens to guide research, discovery, research and development of new antibiotics for drug-resistant bacterial infections, including tuberculosis. World Health Organization Available from: <a target="_blank" href="https://www.who.int/publications/i/item/WHO-EMP-IAU-2017.12">https://www.who.int/publications/i/item/WHO-EMP-IAU-2017.12</a> (2017)</li><li>Kornelsen, V., Kumar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+multidrug+resistance+efflux+pumps+in+Acinetobacter+spp.">Update on multidrug resistance efflux pumps in Acinetobacter spp.</a> Antimicrob Agents Chemother. 65 (7), e00514-00521 (2021).</li><li>Sykes, E. M., Deo, S., Kumar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+genetic+tools+for+Acinetobacter+baumannii.">Recent advances in genetic tools for Acinetobacter baumannii.</a> Front Genet. 11, 601380 (2020).</li><li>Kumar, A., Chua, K. L., Schweizer, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+regulated+expression+of+single-copy+efflux+pump+genes+in+a+surrogate+Pseudomonas+aeruginosa+strain:+identification+of+the+BpeEF-OprC+chloramphenicol+and+trimethoprim+efflux+pump+of+Burkholderia+pseudomallei+1026b.">Method for regulated expression of single-copy efflux pump genes in a surrogate Pseudomonas aeruginosa strain: identification of the BpeEF-OprC chloramphenicol and trimethoprim efflux pump of Burkholderia pseudomallei 1026b.</a> Antimicrob Agents Chemother. 50 (10), 3460-3463 (2006).</li><li>Kumar, A., Dalton, C., Cortez-Cordova, J., Schweizer, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mini-Tn7+vectors+as+genetic+tools+for+single+copy+gene+cloning+in+Acinetobacter+baumannii.">Mini-Tn7 vectors as genetic tools for single copy gene cloning in Acinetobacter baumannii.</a> J Microbiol Methods. 82 (3), 296-300 (2010).</li><li>Ducas-Mowchun, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next+generation+of+Tn7-based+single-copy+insertion+elements+for+use+in+multi-+and+pan-drug+resistant+strains+of+Acinetobacter+baumannii.">Next generation of Tn7-based single-copy insertion elements for use in multi- and pan-drug resistant strains of Acinetobacter baumannii.</a> Appl Environ Microbiol. 85 (11), e00066-00119 (2019).</li><li>Ducas-Mowchun, K., De Silva, P. M., Patidar, R., Schweizer, H. P., Kumar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tn7-based+single-copy+insertion+vectors+for+Acinetobacter+baumannii.">Tn7-based single-copy insertion vectors for Acinetobacter baumannii.</a> Methods Mol Biol. 1946, 135-150 (2019).</li><li>Schweizer, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+the+Saccharomyces+cerevisiae+Flp-FRT+system+in+bacterial+genetics.">Applications of the Saccharomyces cerevisiae Flp-FRT system in bacterial genetics.</a> J Mol Microbiol Biotechnol. 5 (2), 67-77 (2003).</li><li>Choi, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Tn7-based+broad-range+bacterial+cloning+and+expression+system.">A Tn7-based broad-range bacterial cloning and expression system.</a> Nat Methods. 2 (6), 443-448 (2005).</li><li>Choi, K. H., Schweizer, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mini-Tn7+insertion+in+bacteria+with+single+attTn7+sites:+example+Pseudomonas+aeruginosa.">Mini-Tn7 insertion in bacteria with single attTn7 sites: example Pseudomonas aeruginosa.</a> Nat Protoc. 1 (1), 153-161 (2006).</li><li>Kornelsen, V., Unger, M., Kumar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atorvastatin+does+not+display+an+antimicrobial+activity+on+its+own+nor+potentiates+the+activity+of+other+antibiotics+against+Acinetobacter+baumannii+ATCC+17978+or+A.+baumannii+AB030.">Atorvastatin does not display an antimicrobial activity on its own nor potentiates the activity of other antibiotics against Acinetobacter baumannii ATCC 17978 or A. baumannii AB030.</a> Access Microbiol. 3, 000288 (2021).</li><li>Reyrat, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Counterselectable+markers:+untapped+tools+for+bacterial+genetics+and+pathogenesis.">Counterselectable markers: untapped tools for bacterial genetics and pathogenesis.</a> Infect Immun. 66 (9), 4011-4017 (1998).</li><li>Gay, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positive+selection+procedure+for+entrapment+of+insertion+sequence+elements+in+gram-negative+bacteria.">Positive selection procedure for entrapment of insertion sequence elements in gram-negative bacteria.</a> J Bacteriol. 164, 918-921 (1985).</li><li>Kyriakidis, I., Vasileiou, E., Pana, Z. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tragiannidis,+Acinetobacter+baumannii+antibiotic+resistance+mechanisms.">Tragiannidis, Acinetobacter baumannii antibiotic resistance mechanisms.</a> Pathogens. 10 (3), 373 (2021).</li><li>Clinical and Laboratory Standards Institute. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performance+standards+for+antimicrobial+susceptibility+testing.">Performance standards for antimicrobial susceptibility testing.</a> CLSI Supplement M100., 31st edn. , (2021).</li><li>Dijkshoorn, L., Nemec, A., Seifert, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+increasing+threat+in+hospitals:+multidrug-resistant+Acinetobacter+baumannii.">An increasing threat in hospitals: multidrug-resistant Acinetobacter baumannii.</a> Nature Reviews Microbiology. 5, 939-951 (2007).</li><li>Yildirim, S., Thompson, M. G., Jacobs, A. C., Zurawski, D. V., Kirkup, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+parameters+for+high+efficiency+transformation+of+Acinetobacter+baumannii.">Evaluation of parameters for high efficiency transformation of Acinetobacter baumannii.</a> Sci Rep. 25 (6), 22110 (2016).</li><li>Thompson, M. G., Yildirim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+Acinetobacter+baumannii:+electroporation.">Transformation of Acinetobacter baumannii: electroporation.</a> Methods Mol Biol. 1946, 69-74 (2019).</li><li>Choi, K. H., DeShazer, D., Schweizer, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mini-Tn7+insertion+in+bacteria+with+multiple+glmS-linked+attTn7+sites:+example+Burkolderia+mallei+ATCC+2334.">Mini-Tn7 insertion in bacteria with multiple glmS-linked attTn7 sites: example Burkolderia mallei ATCC 2334.</a> Nat Protoc. 1 (1), 162-169 (2006).</li><li>Jittawuttipoka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mini-Tn7+vectors+as+genetic+tools+for+gene+cloning+at+a+single+copy+number+in+an+industrially+important+and+phytopathogenic+bacteria,+Xanthomonas+spp.">Mini-Tn7 vectors as genetic tools for gene cloning at a single copy number in an industrially important and phytopathogenic bacteria, Xanthomonas spp.</a> FEMS Microbiol Lett. 298 (1), 111-117 (2009).</li><li>P&#233;rez-Varela, M., Tierney, A. R. P., Kim, J. S., V&#225;zquez-Torres, A., Rather, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+RelA+in+Acinetobacter+baumannii.">Characterization of RelA in Acinetobacter baumannii.</a> J Bacteriol. 202 (12), e00045 (2020).</li><li>Williams, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Acinetobacter+baumannii+copper+resistance+reveals+a+role+in+virulence.">Characterization of Acinetobacter baumannii copper resistance reveals a role in virulence.</a> Front Microbiol. 11, 16 (2020).</li></ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

A. baumannii'de indüklenebilir tek kopyalı bir gen ekspresyon sisteminin kromozomal eklenmesi için bu prosedür teknik olarak basit ve emek yoğun olmasa da, vurgulanması gereken birkaç önemli adım vardır. İlk olarak, ortamın buz gibi soğuk su ile değiştirilmesi sırasında hücreler kırılgan hale geldiğinden, yetkin hücrelerin hazırlanması mümkün olduğunca buz üzerinde yapılmalıdır. İdeal olarak, santrifüj adımları 4 °C'de gerçekleştirilir, ancak oda sıcaklığında santrifüjl...

Acinetobacter baumannii, tüm antibiyotik sınıflarına karşı kapsamlı direnci nedeniyle Dünya Sağlık Örgütü'nün en öncelikli patojenidir1. Çoğunlukla hastanede yatan, yaralanan veya bağışıklığı baskılanmış kişileri etkileyen fırsatçı bir patojendir. A. baumannii, en alakalı olanı Direnç-Nodülasyon-Bölümü (RND) ihracatçı ailesidir2. Bu akış pompalarının mekanik olarak nasıl çalıştığını anlamak, kişinin hedeflenen terapötik seçeneklerin geliştirilmesine olanak sağlayacaktır.
Hücresel süreçlerin spesifik olarak ayırt edilebilmesinin yaygın bir yolu, genetik manipülasyondur. Bununla birlikte, A. baumannii genetik çalışmaları için mevcut araçlar sınırlıdır ve deneysel tasarımı daha da karmaşık hale getirmek için, klinik izolatlar genellikle genetik manipülasyonlarda seçim için rutin olarak kullanılan antibiyotiklere dirençlidir3. Özellikle akış pompalarını incelerken karşılaşılan ikinci bir engel, genellikle bilinmeyen faktörler tarafından sıkı bir şekilde düzenlenmeleridir ve bu da işlevi tek bir pompaya doğru bir şekilde izole etmeyi ve atfetmeyizorlaştırır 4. Araştırma araç kutusunu genişletme ihtiyacını görerek, seçim işaretçisi 5,6,7'nin kaldırılmasına izin veren bir Flp rekombinaz hedef (FRT) kaseti içeren mini-Tn7 tabanlı, tek kopya ekleme, indüklenebilir bir ifade sistemi geliştirdik (Şekil 1). İlk olarak Pseudomonas 8,9,10 için oluşturulan bu zarif klonlama ve ekspresyon sistemi, A. baumannii'nin (ATCC 17978::ΔadeIJK,Δ adeFGH,Δ adeAB: bundan böyle A. baumannii AB258 olarak anılacaktır) RND akış pompası eksikliği olan bir suşuna tek kopyalı akış pompası tamamlayıcıları oluşturmak için kullanıldı11. Bir seferde bir akış pompasını inceleyebilmek ve bakteri hücrelerini yüksek kopya ekspresyon ile boğmamak (genellikle plazmid bazlı ekspresyon sistemlerinde görüldüğü gibi), her bir akış pompasının kritik, fizyolojik yönleri hakkında minimum parazit ve azaltılmış komplikasyonlarla daha iyi öğrenilebilir.
Bu makale, mini-Tn7 sisteminin, 9 gün boyunca gerçekleştirilen bir dizi karmaşık olmayan adımla A. baumannii AB258'in kromozomuna silinmiş bir gen, RND akış pompası adeIJK'yi tamamlamak için nasıl kullanılacağını açıklamaktadır7. İlk adım seti, iyi korunmuş glmS geninin akış aşağısındaki tek attTn7 ekleme bölgesinde mini-Tn7 tabanlı ekleme plazmidine (Şekil 2A) klonlanan silinmiş akış pompası genlerini yeniden tanıtır (Şekil 3A). Bu işlem, Tn7 güdümlü yerleştirme için gerekli olan transpozaz genlerini kodlayan replikatif olmayan bir yardımcı plazmit (Şekil 2B) ile kolaylaştırılır. İkinci adım seti, işaretlenmemiş bir suş oluşturmak için FRT bölgeleri (Şekil 3B) ile çevrili gentamisin geninin Flp rekombinaz aracılı çıkarılması için bir eksizyon plazmidi (Şekil 2C) kullanır. Bu sistem, antibiyotik direnci ile ilgili olarak RND akış pompalarının temel rollerini ve olası inhibitörlerini aydınlatmak için kullanılsa da, ilgilenilen herhangi bir geni araştırmak için kullanılabilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 mL PCR tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20170-012</td>
			<td>For colony boil preparations and PCR reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microfuge tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72-690-301</td>
			<td>General use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13-mL culture tubes, Pyrex</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-957K</td>
			<td>Liquid culture vessels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6x DNA loading buffer</td>
			<td>Froggabio</td>
			<td>LD010</td>
			<td>Agarose gel electrophoresis sample loading dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid, glacial</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>351271-212</td>
			<td>Agarose gel running buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>AGR003</td>
			<td>Solid growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>BioBasic</td>
			<td>D0012</td>
			<td>Electrophoretic separation of PCR reaction products; used at a concentration of 0.8&#8211;2%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose gel electrophoresis unit</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>29-237-54</td>
			<td>Agarose gel electrophoresis; separation of PCR reaction products</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50841231</td>
			<td>Selective media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture tube closures</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-684-138</td>
			<td>Stainless steel closure for 13-mL culture tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxynucleotide triphosphate (dNTP) set</td>
			<td>Biobasic</td>
			<td>DD0058</td>
			<td>PCR reaction component; supplied as 100 mM each dATP, dCTP, dGTP, dTTP; mixed and diluted for 10 mM each dNTP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry bath/block heater</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>88860023</td>
			<td>Isotemp digital dry bath for boil preparations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation cuvettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89047-208</td>
			<td>2 mm electroporation cuvettes with round cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporator</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>940000009</td>
			<td>110 VAC, 60 Hz electroporator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP102-1</td>
			<td>Visualization of PCR reaction products and DNA marker in agarose gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CA-EM4050</td>
			<td>Agarose gel running buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Biobasic</td>
			<td>GB0217</td>
			<td>For the preparation of selective media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>G33</td>
			<td>Preparation of bacterial stocks for long-term storage in an ultra-low freezer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator (shaking)</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>M1352-0000</td>
			<td>Excella E24 Incubator Shaker for liquid culture growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator (static)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>11-690-550D</td>
			<td>Isotemp Incubator Oven Model 550D for solid (LB agar) culture growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inoculation loop</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>86.1562.050</td>
			<td>Streaking colonies onto agar plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inoculation spreader</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>86.1569.005</td>
			<td>Spreading of culture onto agar plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysogeny broth (LB) broth, Lennox</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1427</td>
			<td>Liquid growth media (20 g/L: 5 g/L sodium chloride, 10 g/L tryptone, 5 g/L yeast extract)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>75002431</td>
			<td>Sorvall Legend Micro 17 for centrifugation of samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-centrifuge</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S67601B</td>
			<td>Centrifugation of 0.2 mL PCR tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>SPL Life Sciences</td>
			<td>10090</td>
			<td>For solid growth media (agar plates): 90 x 15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes&#160;</td>
			<td>Mandel</td>
			<td>Various</td>
			<td>Gilson single channel pipettes (P10, P20, P200, P1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power supply</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1645050</td>
			<td>PowerPac Basic power supply for electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers</td>
			<td>IDT</td>
			<td>NA</td>
			<td>PCR reaction component; specific to gene of interest; prepared at 100 &#956;M as directed on the product specification sheet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>BioBasic</td>
			<td>SB0498</td>
			<td>For the preparation of counterselective media for removal of the pFLP2ab plasmid from transformed A. baumannii</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA polymerase</td>
			<td>FroggaBio</td>
			<td>T-500</td>
			<td>PCR reaction component; polymerase supplied with a 10x buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal cycler</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1861096</td>
			<td>Model T100 for PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toothpicks</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S24559</td>
			<td>For patching colonies onto agar plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1503</td>
			<td>Agarose gel running buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>ZLXLSD51040</td>
			<td>MilliQ water purification system: ultra pure water for media and solution preparation, and cell washing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wide range DNA marker</td>
			<td>Biobasic</td>
			<td>M103R-2</td>
			<td>Size determination of PCR products on an agarose gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wooden inoculating sticks</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>29-801-02</td>
			<td>Inoculating cultures with colonies from agar plates</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterizing multidrug efflux systems in acinetobacter baumannii using an efflux&#45;deficient bacterial strain and a single&#45;copy gene expression system

Acinetobacter baumannii , antibiyotiklere karşı yaygın direnci nedeniyle zorlu bir Gram-negatif patojen olarak kabul edilmektedir. Yeni ve etkili terapötik seçenekler tasarlamak için bu direncin arkasındaki mekanizmaları anlamak çok önemlidir. Ne yazık ki, A. baumannii'deki bu mekanizmaları araştırma yeteneğimiz, uygun genetik manipülasyon araçlarının yetersizliği nedeniyle engellenmektedir. Burada, fonksiyonel RND tipi akış mekanizmalarından yoksun bir A. baumannii suşunda tek kopya gen ekspresyonu elde etmek için kromozomal mini-Tn7 tabanlı bir sistemi kullanma yöntemlerini açıklıyoruz. Yüksek kopya sayılı plazmitlerde RND akış operonlarının varlığı genellikle bakteri hücreleri tarafından zayıf bir şekilde tolere edildiğinden, tek kopya ekleme ve indüklenebilir akış pompası ekspresyonu oldukça avantajlıdır. Ayrıca, rekombinant mini-Tn7 ekspresyon vektörlerinin, artan akış duyarlılığına sahip bir vekil A. baumannii konağının kromozomuna dahil edilmesi, diğer akış pompalarından kaynaklanan parazitlerin önlenmesine yardımcı olur. Bu sistem sadece karakterize edilmemiş bakteriyel akış pompalarını araştırmak için değil, aynı zamanda bu pompaları hedef alan potansiyel inhibitörlerin etkinliğini değerlendirmek için de değerlidir.

Acinetobacter baumannii is a World Health Organization top priority pathogen due to its encompassing resistance to all classes of antibiotics1. It is an opportunistic pathogen mostly affecting hospitalized, injured, or immunocompromised people. A. baumannii largely evades antibiotics via efflux pumps, the most relevant being the Resistance-Nodulation-Division (RND) family of exporters2. Understanding how these efflux pumps work mechanistically will allow one to develop targeted therapeutic options.
One common way that cellular processes can be specifically distinguished is through genetic manipulation. However, the tools available for A. baumannii genetic studies are limited, and to further confound experimental design, clinical isolates often are resistant to the antibiotics routinely used for selection in genetic manipulations3. A second hurdle encountered when studying efflux pumps specifically is that they are strictly regulated-often by unknown factors-making it difficult to accurately isolate and attribute function to a single pump4. Seeing this need to expand the research toolbox, we developed a mini-Tn7-based, single-copy-insertion, inducible expression system that incorporates a Flp recombinase target (FRT) cassette, which allows for the removal of the selection marker5,6,7 (Figure 1). First created for Pseudomonas8,9,10, this elegant cloning and expression system was used to generate single-copy efflux pump complements into an RND efflux pump-deficient strain of A. baumannii (ATCC 17978::&#916;adeIJK,&#916;adeFGH,&#916;adeAB: hereafter referred to as A. baumannii AB258) that we generated11. Being able to study one efflux pump at a time and not overwhelm the bacterial cells with high-copy expression (as generally seen with plasmid-based expression systems), one can better learn about the critical, physiological aspects of each efflux pump with minimal interference and reduced complications.
This article describes how to use the mini-Tn7 system to complement a deleted gene of interest, RND efflux pump adeIJK, into the chromosome of A. baumannii AB258 through a series of uncomplicated steps performed over the course of 9 days7. The first set of steps re-introduces the deleted efflux pump genes cloned into the mini-Tn7-based insertion plasmid (Figure 2A) at the single attTn7 insertion site downstream of the well-conserved glmS gene (Figure 3A). This process is facilitated by a non-replicative helper plasmid (Figure 2B) that encodes for the transposase genes needed for Tn7-driven insertion. The second set of steps uses an excision plasmid (Figure 2C) for Flp recombinase-mediated removal of the gentamicin gene flanked by FRT sites (Figure 3B) to create an unmarked strain. Though this system is used to elucidate the essential roles and possible inhibitors of RND efflux pumps with respect to antibiotic resistance, it can be used to investigate any gene of interest.

Yazar Spotlight: Akış Eksikliği Olan Bir Bakteri Suşu ve Tek Kopyalı Gen Ekspresyon Sistemi Kullanarak Antibiyotik Direnci Araştırmasını İlerletmek

Acinetobacter baumannii'de Akış Eksikliği Olan Bir Bakteri Suşu ve Tek Kopyalı Gen Ekspresyon Sistemi Kullanılarak Çoklu İlaç Akış Sistemlerinin Karakterize Edilmesi

We study multi-drug resistance efflux systems in gram-negative bacteria. We are interested in learning about the natural functions of these pumps and how these pumps can be used as a potential drug target. Expression of multi-drug resistance efflux systems is tightly regulated, making it difficult to study their functions.Thus, an expression system that bypasses the regulatory system can be quite useful in the characterization of these pumps. This protocol allows for the expression of genes at levels usually seen in natural settings. Thus, the activity of the gene products mimics what is observed in nature.

Kromozomal yerleştirme prosedürü, seçici bir agar plakasında büyüyen bir sonuç kolonisi görmek için 3 gün boyunca toplam sadece 2 saat sürer (Şekil 1A-C). Dönüşüm plakasında beklenen koloni sayısı suşa bağlıdır: Tn7'nin attTn7 bölgelerine yerleştirilmesi spesifik ve verimli olduğu için 20-30 hatta yüzlerce koloni görülebilir9. Dönüşüm plakası kolonilerinin seçici ortama yamalanması (<stro...

Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Advancing Antibiotic Resistance Research Using an Efflux-Deficient Bacterial Strain and a Single-Copy Gene Expression System at JoVE.com

Mini-Tn7 tabanlı bir ekspresyon sistemi kullanarak bir akış pompası geninin tek kopyalı kromozomal tamamlayıcısı için tasarlanmış bir akış eksikliği olan Acinetobacter baumannii suşuna kolay bir prosedür tarif ediyoruz. Bu hassas genetik araç, çoklu ilaca dirençli patojenlerde akış pompalarının karakterizasyonu için anahtar olan kontrollü gen ekspresyonuna izin verir.

Acinetobacter baumannii is recognized as a challenging Gram-negative pathogen due to its widespread resistance to antibiotics. It is crucial to comprehend ...

Gram-negatif bakterilerde çoklu ilaç dirençli eflü sistemlerini inceliyoruz. Bu pompaların doğal işlevlerini ve bu pompaların potansiyel bir ilaç hedefi olarak nasıl kullanılabileceğini öğrenmek istiyoruz. Çoklu ilaç direnci akış sistemlerinin ekspresyonu sıkı bir şekilde düzenlenir ve bu da işlevlerini incelemeyi zorlaştırır.Bu nedenle, düzenleyici sistemi atlayan bir ifade sistemi, bu pompaların karakterizasyonunda oldukça faydalı olabilir. Bu protokol, genlerin genellikle doğal ortamlarda görülen seviyelerde ekspresyonuna izin verir. Böylece, gen ürünlerinin aktivitesi doğada gözlemlenenleri taklit eder.

characterizing-multidrug-efflux-systems-acinetobacter-baumannii-using

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Characterizing Multidrug Efflux Systems in Acinetobacter baumannii Using an Efflux&#45;Deficient Bacterial Strain and a Single&#45;Copy Gene Expression System

349 Görüntüleme.  University of Manitoba. Gram-negatif bakterilerde çoklu ilaç dirençli eflü sistemlerini inceliyoruz. Bu pompaların doğal işlevlerini ve bu pompaların potansiyel bir ilaç hedefi olarak nasıl kullanılabileceğini öğrenmek istiyoruz. Çoklu ilaç direnci akış sistemlerinin ekspresyonu sıkı bir şekilde düzenlenir ve bu da işlevlerini incelemeyi zorlaştırır.Bu nedenle, düzenleyici sistemi atlayan bir ifade sistemi, bu pompaların karakterizasyonunda oldukça faydalı olabilir. Bu protokol, ...

Video: Yazar Spotlight: Akış Eksikliği Olan Bir Bakteri Suşu ve Tek Kopyalı Gen Ekspresyon Sistemi Kullanarak Antibiyotik Direnci Araştırmasını İlerletmek