Bu çalışma, Kanada Doğa Bilimleri ve Mühendislik Konseyi'nden AK'ye bir Keşif Hibesi ile desteklenmiştir. Şekillerde kullanılan şemalar BioRender.com ile oluşturulmuştur.

1. Deneysel hazırlık
<ol><li>Plazmid pUC18T-mini-Tn7T-LAC-Gm9'u (ekleme plazmidi, Şekil 2A) ilgilenilen gen ile saflaştırın. NOT: Burada ilgilenilen gen adeIJK'dir. Nihai plazmit konsantrasyonu ≥100 ng/μL olmalıdır.</li>
	<li>Yardımcı plazmidi (pTNS2)9 ve eksizyon plazmidini (pFLP2ab)6 (Şekil 2B,C, sırasıyla), ideal olarak ≥100 ng/μL'lik bir nihai plazmit DNA konsantrasyonuna kadar saflaştırın.</li>
	<li>50 mL steril ultra saf su ve 25 mL steril LB (Lennox) suyu hazırlayın (Malzeme Tablosuna bakınız).</li>
	<li>Her biri aşağıdaki katkı maddelerini içeren en az 10 LB agar plakası hazırlayın: sade (katkı maddesi yok), 50 μg/mL'de gentamisin (Gm), 200 μg/mL'de karbenisilin (Cb) (ampisilin direnç geni yoluyla seçim için) ve %5 sükroz (bkz.</li>
	<li>LB agar üzerine yerleştirmek için kullanılacak suşu çizgiden çıkarın ve 37 °C'de 16-18 saat inkübe edin. Burada A. baumannii AB258 kullanılır. NOT: Bu protokol, mümkün olduğunca steril bir ortamda, tezgahta bir Bunsen brülörü veya biyolojik güvenlik kabini kullanılarak gerçekleştirilmelidir. Tüm sarf malzemelerinin (pipet uçları, aşılama halkaları, mikrofüj tüpleri vb.) steril olması gerekir.</li>
</ol>2. Kültür hazırlığı
<ol><li>Tek bir A. baumannii AB258 kolonisini, steril bir aşılama döngüsü veya steril ahşap aşılama çubuğu kullanarak steril bir 13 mL kültür tüpünde 4 mL LB suyuna aşılayın. NOT: Bir numune ve bir kontrol için tek bir 4 mL kültür kullanılır. İhtiyaç duyulan numune sayısına bağlı olarak kültür sayısını artırın.</li>
	<li>Gece boyunca 37 °C'de çalkalayarak (250 rpm) inkübe edin.</li>
	<li>3. adımda kullanmak için gece boyunca 4 °C'de bir şişe steril damıtılmış su (25-50 mL) yerleştirin.</li>
</ol>3. Elektroyetkin hücrelerin hazırlanması
<ol><li>Tüm steril 1.5 mL mikrofüj tüplerini (kültür başına iki adet) ve steril elektroporasyon küvetlerini (kültür başına iki adet) buz üzerine yerleştirin (Malzeme Tablosuna bakınız). Numuneleri prosedür boyunca mümkün olduğunca buz üzerinde tutun.</li>
	<li>4 °C'de saklanan steril su şişesini buzun üzerine koyun.</li>
	<li>Gece boyunca bakteri kültürünün 1.5 mL'sini 1.5 mL'lik mikrofüj tüplerinden birine aktarın.</li>
	<li>Hücreleri peletlemek için 13.000 x g'da 2 dakika santrifüjleyin. NOT: Santrifüjleme ideal olarak 4 °C'de gerçekleştirilir, ancak ortam sıcaklığında santrifüjleme kabul edilebilir ve zararlı değildir.</li>
	<li>1 mL'lik bir pipet kullanarak, hücre peletini bozmadan tüm süpernatanı çıkarın.</li>
	<li>Aynı mikrofüj tüpüne 1.5 mL daha bakteri kültürü ekleyin. 2 dakika boyunca 13.000 x g'da santrifüjleyin, ardından tüm süpernatanı çıkarın.</li>
	<li>Kalan 1 mL kültürle 3.6 adımını son bir kez tekrarlayın.</li>
	<li>Hücre peletine 1 mL buz gibi steril su ekleyin ve pelet artık mikrofüj tüpünün dibinde kalmayana kadar hafif pipetleme ile yeniden süspanse edin.</li>
	<li>Yeniden süspanse edilmiş hücreleri 2 dakika boyunca 13.000 x g'da santrifüjleyin.</li>
	<li>1 mL'lik bir pipet kullanarak süpernatanı dikkatlice çıkarın. Süpernatanı, özellikle hücrelerin daha az kompakt topaklar oluşturma eğiliminde olduğu sonraki yıkama adımlarında dökmeyin.</li>
	<li>Bu yıkama adımını buz gibi steril suyla, 3.8'den 3.10'a kadar olan adımları iki kez daha tekrarlayın.</li>
	<li>Son hücre peletini 200 μL buz gibi steril suda nazikçe yeniden süspanse edin.</li>
	<li>Son hücre süspansiyonunun 100 μL'sini ikinci buz gibi soğuk 1.5 mL mikrofüj tüpüne aktarın. Bu ikinci alikot, elektroporasyon için negatif kontrol olacaktır. Hücre örneklerini buz üzerinde tutun.</li>
</ol>4. Elektroporasyon
<ol><li>Her numune için 1 mL LB et suyu ve bir LB + Gm50 agar plakası (adım 1.4'te hazırlanmıştır) önceden ısıtın ve 37 °C'ye ayarlanmış statik bir inkübatörde kontrol edin.</li>
	<li>5 μL veya daha az birleşik bir hacimde, pTNS2 yardımcı plazmidinin her birine 100-200 ng ekleyin ve pUC18T-mini-Tn7T-LAC-Gm-adeIJK ekleme plazmiti, elektroyetkin hücrelerin bir alikotuna ekleyin.</li>
	<li>Plazmitlerin elektroyetkin hücrelerle kabarcıklar oluşturmadan tam olarak karışmasını sağlamak için parmak ucuyla hafifçe vurarak karıştırın.</li>
	<li>Negatif kontrol hücresi alikotuna eşdeğer hacimde steril damıtılmış su ekleyin ve yukarıdaki gibi hafifçe karıştırın.</li>
	<li>Numuneleri buz üzerinde 20 dakika inkübe edin.</li>
	<li>Tüm hücre örneğini buz gibi bir elektroporasyon küvetine aktarın, ardından küveti tekrar buzun üzerine yerleştirin. Negatif kontrol hücresi örneği için tekrarlayın.</li>
	<li>Hücre örneğini elektroporate edin.<ol><li>Elektroporatörü açın ve 2.0 kV'a (25 μF, 200 Ω) ayarlayın (bkz.</li>
		<li>Yapışan buz veya nemi gidermek için küvetin yüzeyini yumuşak bir bezle silin.</li>
		<li>Küveti elektroporatöre yerleştirin ve elektrik çarpmasını sağlayın.</li>
		<li>Küvetteki hücrelere hemen 0,9 mL önceden ısıtılmış LB suyu ekleyin ve hücreleri ortamla karıştırmak için hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyin.</li>
		<li>Tüm hücre süspansiyonunu yeni bir 1.5 mL mikrofüj tüpüne (oda sıcaklığı) aktarın.</li>
		<li>Elektroporatör üzerindeki zaman sabiti değerini kontrol edin; En iyi sonuçlar için bu değer 4 ile 6 arasında olmalıdır.</li>
	</ol></li>
	<li>Negatif kontrol hücresi numunesi için elektroporasyon prosedürünü tekrarlayın (adım 4.7.1 ila adım 4.7.6).</li>
	<li>Hücre geri kazanımına izin vermek için elektroporasyonlu numuneleri 37 °C'de 250 rpm'de 1 saat inkübe edin.</li>
	<li>Bir aşılama yayıcı kullanarak, her bir elektroporasyonlu hücre örneğinin 100 μL'sini önceden ısıtılmış bir LB + Gm50 agar plakasına yayın.<ol><li>Hücreleri peletlemek için kalan numuneleri 13.000 x g'da 2 dakika santrifüjleyin.</li>
		<li>Bir pipet kullanarak tüm süpernatantı çıkardıktan sonra, hücreleri 100 μL LB et suyunda yeniden süspanse edin.</li>
		<li>Her bir numunenin tamamını önceden ısıtılmış ayrı ayrı LB + Gm50 agar plakalarına yayın. NOT: Elektroporasyon verimliliği gerilime bağlı olabilir. Bir suşun ilk kez elektropolasyonu yapılırken, elde edilen plakaların izole kolonilere sahip olduğundan emin olmak için elektroporasyon numunesinin farklı hacimlerini ve hatta seyreltmelerini plakalamak bilgilendirici olabilir.</li>
	</ol></li>
	<li>Plakaları 37 °C'de 16-18 saat inkübe edin.</li>
</ol>5. PCR tabanlı tarama için dönüştürülmüş kolonilerin seçilmesi
<ol><li>Elektroporasyon plakalarını kontrol edin. Negatif kontrolün kolonisi olmamalıdır; Numunenin farklı kolonileri olmalıdır. NOT: Kolonili plakalar, bu adımda ve kolonili veya yamalı agar plakalarının üretildiği sonraki tüm adımlarda, devam etmeden önce 4 °C'de 3 güne kadar saklanabilir.</li>
	<li>Steril kürdan kullanarak, LB + Gm50 agar plakalarından 10 adede kadar tek koloni alın ve bunları taze bir LB + Gm50 agar plakasına yamalayın.</li>
	<li>Plakaları 37 °C'de 16-18 saat inkübe edin.</li>
</ol>6. Koloni PCR ile kromozomal insersiyonun doğrulanması
<ol><li>Yamalı kolonileri içeren LB + Gm50 agar plakalarını inkübatörden çıkarın.</li>
	<li>Steril bir kürdan veya steril pipet ucu kullanarak, bir yamadan küçük bir kısmı (yaklaşık büyük bir koloni büyüklüğünde) 20 mL'lik bir PCR tüpünde 0.2 μL steril damıtılmış suya çıkarın; İyice karıştırın. Hücreler kürdandan salınırken su numunesi gözle görülür şekilde bulanıklaşmalıdır. Taranması gereken herhangi bir sayıda numune hazırlayın, ancak 6 yeterli olmalıdır.</li>
	<li>Bakteriyel süspansiyonu içeren PCR tüpünü 100 °C'de 5-10 dakika inkübe edin.</li>
	<li>Bir mini santrifüj kullanarak (Malzeme Tablosuna bakın), hücresel kalıntıları peletlemek için numuneyi 2 dakika boyunca sabit maksimum hızda döndürün.</li>
	<li>Süpernatanı yeni bir 0.2 mL PCR tüpüne aktarın ve buzun üzerine yerleştirin. Bu numune, PCR reaksiyonu için şablon DNA'yı içerir. NOT: Bu şablon DNA, PCR'ye devam etmeden önce -20 °C'de saklanabilir.</li>
	<li>1x polimeraz tamponu, 200 μM dNTP'ler, 0.18 μM ABglmS2_F_New ileri primer, 0.18 μM Tn7R ters primer (Tablo 1), 1 U Taq DNA polimeraz ve 1 μL içeren bir PCR reaksiyon karışımı hazırlayın hazırlanan şablon DNA toplam 25 μL hacimde. Şablon DNA hariç tümü dahil olmak üzere şablonsuz bir kontrol (NTC) hazırlayın (bkz.</li>
	<li>Reaksiyon koşullarını bir termal döngüleyiciye girin: 2 dakika boyunca 95 °C; 30 sn için 95 °C, 30 sn için 49 °C ve 30 sn için 72 °C olmak üzere toplam 35 döngü; 10 dakika boyunca 72 °C; 12 °C tutun. Örnekleri çalıştırın.</li>
	<li>DNA yükleme boyasının 1x'lik bir nihai konsantrasyona eklenmesini takiben,% 2'lik bir agaroz jel üzerine her bir PCR reaksiyonunun 10 μL'sini yükleyin ve 40 dakika boyunca 80 V'ta çalıştırın. Bu primer çifti için beklenen amplikon boyutu 382 bp'dir. NTC'nin bantları olmamalıdır.</li>
	<li>Beklenen PCR ürününü üreten numuneleri tanımlayın. PCR pozitif yamaların herhangi birinden LB + Gm50 agar plakaları üzerinde bir çizgi plakası hazırlayın; 37 °C'de 16-18 saat inkübe edin. Amaç, bu işaretli suşu korumak için bir gliserol stoğunun hazırlanması için ve işaretsiz bir suş oluşturmak için bir başlangıç noktası olarak tek kolonili bir plaka oluşturmaktır (aşağıda açıklanmıştır).</li>
</ol>7.pFLP2 ab kullanılarak GmR işaretleyicisinin çıkarılması
<ol><li>Adım 2'de belirtilen prosedürü izleyin: Kültür hazırlama. Gece kültürünü hazırlamak için kullanılan numune, adım 6.9'da ayrı koloniler oluşturmak için hazırlanan LB + Gm50 agar plakalarından tek bir kolonidir.</li>
	<li>Adım 3'te belirtilen prosedürü izleyin: Elektrokompetan hücrelerin hazırlanması. Elektroporasyon için gece kültüründen hücreleri hazırlayın.</li>
	<li>Adım 4'te belirtilen prosedürü izleyin: Elektroporasyon. Burada, hücrelere sokulacak plazmit, ilgilenilen kromozomal olarak yerleştirilmiş geni çevreleyen gentamisin direnç genini ortadan kaldıracak olan pFLP2ab'dir (100-200 ng).</li>
	<li>Hücreler 1 saat boyunca iyileştikten sonra (adım 4.9), elektroporasyonlu hücre numunesinin 100 μL'sini önceden ısıtılmış bir LB + Cb200 agar plakasına (adım 1.4'te hazırlanır) yayın. Bu seçici basınç, yalnızca pFLP2ab eksizyon plazmidini barındıran hücrelerin büyümesini sağlar.</li>
	<li>Plakaları 37 °C'de 16-18 saat inkübe edin.</li>
	<li>Plakada koloni olup olmadığını kontrol edin. Negatif kontrol plakasında koloni olmamalıdır; LB + Cb200 agar numune plakası farklı kolonilere sahip olmalıdır.</li>
	<li>Steril kürdan kullanarak, 20'ye kadar izole koloniyi bir LB + Cb200 agar plakasına ve bir LB + Gm50 agar plakasına çapraz yamalayın.</li>
	<li>Plakaları 37 °C'de 16-18 saat inkübe edin.</li>
	<li>Plakalarda yama olup olmadığını kontrol edin. LB + Cb200 agar plakasında büyüyen, ancak LB + Gm50 agar plakasında büyümeyen klonlar, gentamisin direnç genini orijinal ek parçadan çıkarmıştır.</li>
	<li>pFLP2ab plazmidinin bakterilerden atılmasını zorlayan% 5 (a / h) sükroz ile desteklenmiş ayrı LB agar plakalarına çizilmeye duyarlı karbenisiline dirençli ve gentamisine duyarlı yamaları seçin. En fazla 10 koloni seçin.</li>
	<li>Plakaları 37 °C'de 16-18 saat inkübe edin.</li>
	<li>Koloniler için plakaları kontrol edin.</li>
	<li>pFLP2ab plazmit kaybının son bir teyidi olarak,% 5 sükroz plakalarından izole edilmiş 4-6 koloniyi bir LB + Cb200 agar plakasına ve bir LB agar plakasına çapraz yamalayın.</li>
	<li>Plakaları 37 °C'de 16-18 saat inkübe edin.</li>
	<li>LB agar plakasında büyüyen ve bu işaretsiz suşu korumak için bir gliserol stoğunun hazırlanması için karbenisiline duyarlı bir klon seçin.<ol><li>İşaretlenmemiş suşun genetik doğrulaması, gentamisin direnç genini hedef alan primerler kullanılarak koloni PCR (adım 6: Koloni PCR ile kromozomal insersiyonun doğrulanması) ile gerçekleştirilebilir.</li>
		<li>1x polimeraz tamponu, 200 μM dNTP, 0.18 μM Gm_F ileri primer, 0.18 μM Gm_R ters primer (Tablo 1), 1 U Taq DNA polimeraz ve 1 μL toplam 25 μL hacimde hazırlanan şablon DNA içeren bir PCR reaksiyon karışımı hazırlayın. Şablon DNA hariç tümünü içeren şablonsuz bir kontrol (NTC) hazırlayın, ve işaretli suştan DNA kullanılarak pozitif bir kontrol.</li>
		<li>Reaksiyon koşullarını bir termal döngüleyiciye girin: 2 dakika boyunca 95 °C; 30 sn için 95 °C, 30 sn için 50 °C ve 40 sn için 72 °C olmak üzere toplam 35 döngü; 10 dakika boyunca 72 °C; 12 °C tutun. Örnekleri çalıştırın.</li>
		<li>DNA yükleme boyasının 1x'lik bir nihai konsantrasyona eklenmesini takiben,% 1'lik bir agaroz jel üzerine her bir PCR reaksiyonunun 10 μL'sini yükleyin ve 40 dakika boyunca 80 V'ta çalıştırın. Bu primer çifti için beklenen amplikon boyutu 525 bp'dir. Pozitif kontrol tek bir banda sahip olmalıdır; numuneler ve NTC'de bant olmamalıdır.</li>
	</ol></li>
</ol>

Çoklu İlaç Akış Sistemlerini Karakterize Etmek için Tek Kopyalı Gen İfadesi

<ol>
	<li>Prioritization of pathogens to guide research, discovery, research and development of new antibiotics for drug-resistant bacterial infections, including tuberculosis. World Health Organization Available from: <a target="_blank" href="https://www.who.int/publications/i/item/WHO-EMP-IAU-2017.12">https://www.who.int/publications/i/item/WHO-EMP-IAU-2017.12</a> (2017)</li><li>Kornelsen, V., Kumar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+multidrug+resistance+efflux+pumps+in+Acinetobacter+spp.">Update on multidrug resistance efflux pumps in Acinetobacter spp.</a> Antimicrob Agents Chemother. 65 (7), e00514-00521 (2021).</li><li>Sykes, E. M., Deo, S., Kumar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+genetic+tools+for+Acinetobacter+baumannii.">Recent advances in genetic tools for Acinetobacter baumannii.</a> Front Genet. 11, 601380 (2020).</li><li>Kumar, A., Chua, K. L., Schweizer, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+regulated+expression+of+single-copy+efflux+pump+genes+in+a+surrogate+Pseudomonas+aeruginosa+strain:+identification+of+the+BpeEF-OprC+chloramphenicol+and+trimethoprim+efflux+pump+of+Burkholderia+pseudomallei+1026b.">Method for regulated expression of single-copy efflux pump genes in a surrogate Pseudomonas aeruginosa strain: identification of the BpeEF-OprC chloramphenicol and trimethoprim efflux pump of Burkholderia pseudomallei 1026b.</a> Antimicrob Agents Chemother. 50 (10), 3460-3463 (2006).</li><li>Kumar, A., Dalton, C., Cortez-Cordova, J., Schweizer, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mini-Tn7+vectors+as+genetic+tools+for+single+copy+gene+cloning+in+Acinetobacter+baumannii.">Mini-Tn7 vectors as genetic tools for single copy gene cloning in Acinetobacter baumannii.</a> J Microbiol Methods. 82 (3), 296-300 (2010).</li><li>Ducas-Mowchun, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next+generation+of+Tn7-based+single-copy+insertion+elements+for+use+in+multi-+and+pan-drug+resistant+strains+of+Acinetobacter+baumannii.">Next generation of Tn7-based single-copy insertion elements for use in multi- and pan-drug resistant strains of Acinetobacter baumannii.</a> Appl Environ Microbiol. 85 (11), e00066-00119 (2019).</li><li>Ducas-Mowchun, K., De Silva, P. M., Patidar, R., Schweizer, H. P., Kumar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tn7-based+single-copy+insertion+vectors+for+Acinetobacter+baumannii.">Tn7-based single-copy insertion vectors for Acinetobacter baumannii.</a> Methods Mol Biol. 1946, 135-150 (2019).</li><li>Schweizer, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+the+Saccharomyces+cerevisiae+Flp-FRT+system+in+bacterial+genetics.">Applications of the Saccharomyces cerevisiae Flp-FRT system in bacterial genetics.</a> J Mol Microbiol Biotechnol. 5 (2), 67-77 (2003).</li><li>Choi, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Tn7-based+broad-range+bacterial+cloning+and+expression+system.">A Tn7-based broad-range bacterial cloning and expression system.</a> Nat Methods. 2 (6), 443-448 (2005).</li><li>Choi, K. H., Schweizer, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mini-Tn7+insertion+in+bacteria+with+single+attTn7+sites:+example+Pseudomonas+aeruginosa.">Mini-Tn7 insertion in bacteria with single attTn7 sites: example Pseudomonas aeruginosa.</a> Nat Protoc. 1 (1), 153-161 (2006).</li><li>Kornelsen, V., Unger, M., Kumar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atorvastatin+does+not+display+an+antimicrobial+activity+on+its+own+nor+potentiates+the+activity+of+other+antibiotics+against+Acinetobacter+baumannii+ATCC+17978+or+A.+baumannii+AB030.">Atorvastatin does not display an antimicrobial activity on its own nor potentiates the activity of other antibiotics against Acinetobacter baumannii ATCC 17978 or A. baumannii AB030.</a> Access Microbiol. 3, 000288 (2021).</li><li>Reyrat, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Counterselectable+markers:+untapped+tools+for+bacterial+genetics+and+pathogenesis.">Counterselectable markers: untapped tools for bacterial genetics and pathogenesis.</a> Infect Immun. 66 (9), 4011-4017 (1998).</li><li>Gay, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positive+selection+procedure+for+entrapment+of+insertion+sequence+elements+in+gram-negative+bacteria.">Positive selection procedure for entrapment of insertion sequence elements in gram-negative bacteria.</a> J Bacteriol. 164, 918-921 (1985).</li><li>Kyriakidis, I., Vasileiou, E., Pana, Z. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tragiannidis,+Acinetobacter+baumannii+antibiotic+resistance+mechanisms.">Tragiannidis, Acinetobacter baumannii antibiotic resistance mechanisms.</a> Pathogens. 10 (3), 373 (2021).</li><li>Clinical and Laboratory Standards Institute. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performance+standards+for+antimicrobial+susceptibility+testing.">Performance standards for antimicrobial susceptibility testing.</a> CLSI Supplement M100., 31st edn. , (2021).</li><li>Dijkshoorn, L., Nemec, A., Seifert, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+increasing+threat+in+hospitals:+multidrug-resistant+Acinetobacter+baumannii.">An increasing threat in hospitals: multidrug-resistant Acinetobacter baumannii.</a> Nature Reviews Microbiology. 5, 939-951 (2007).</li><li>Yildirim, S., Thompson, M. G., Jacobs, A. C., Zurawski, D. V., Kirkup, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+parameters+for+high+efficiency+transformation+of+Acinetobacter+baumannii.">Evaluation of parameters for high efficiency transformation of Acinetobacter baumannii.</a> Sci Rep. 25 (6), 22110 (2016).</li><li>Thompson, M. G., Yildirim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+Acinetobacter+baumannii:+electroporation.">Transformation of Acinetobacter baumannii: electroporation.</a> Methods Mol Biol. 1946, 69-74 (2019).</li><li>Choi, K. H., DeShazer, D., Schweizer, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mini-Tn7+insertion+in+bacteria+with+multiple+glmS-linked+attTn7+sites:+example+Burkolderia+mallei+ATCC+2334.">Mini-Tn7 insertion in bacteria with multiple glmS-linked attTn7 sites: example Burkolderia mallei ATCC 2334.</a> Nat Protoc. 1 (1), 162-169 (2006).</li><li>Jittawuttipoka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mini-Tn7+vectors+as+genetic+tools+for+gene+cloning+at+a+single+copy+number+in+an+industrially+important+and+phytopathogenic+bacteria,+Xanthomonas+spp.">Mini-Tn7 vectors as genetic tools for gene cloning at a single copy number in an industrially important and phytopathogenic bacteria, Xanthomonas spp.</a> FEMS Microbiol Lett. 298 (1), 111-117 (2009).</li><li>P&#233;rez-Varela, M., Tierney, A. R. P., Kim, J. S., V&#225;zquez-Torres, A., Rather, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+RelA+in+Acinetobacter+baumannii.">Characterization of RelA in Acinetobacter baumannii.</a> J Bacteriol. 202 (12), e00045 (2020).</li><li>Williams, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Acinetobacter+baumannii+copper+resistance+reveals+a+role+in+virulence.">Characterization of Acinetobacter baumannii copper resistance reveals a role in virulence.</a> Front Microbiol. 11, 16 (2020).</li></ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

A. baumannii'de indüklenebilir tek kopyalı bir gen ekspresyon sisteminin kromozomal eklenmesi için bu prosedür teknik olarak basit ve emek yoğun olmasa da, vurgulanması gereken birkaç önemli adım vardır. İlk olarak, ortamın buz gibi soğuk su ile değiştirilmesi sırasında hücreler kırılgan hale geldiğinden, yetkin hücrelerin hazırlanması mümkün olduğunca buz üzerinde yapılmalıdır. İdeal olarak, santrifüj adımları 4 °C'de gerçekleştirilir, ancak oda sıcaklığında santrifüjl...

Acinetobacter baumannii, tüm antibiyotik sınıflarına karşı kapsamlı direnci nedeniyle Dünya Sağlık Örgütü'nün en öncelikli patojenidir1. Çoğunlukla hastanede yatan, yaralanan veya bağışıklığı baskılanmış kişileri etkileyen fırsatçı bir patojendir. A. baumannii, en alakalı olanı Direnç-Nodülasyon-Bölümü (RND) ihracatçı ailesidir2. Bu akış pompalarının mekanik olarak nasıl çalıştığını anlamak, kişinin hedeflenen terapötik seçeneklerin geliştirilmesine olanak sağlayacaktır.
Hücresel süreçlerin spesifik olarak ayırt edilebilmesinin yaygın bir yolu, genetik manipülasyondur. Bununla birlikte, A. baumannii genetik çalışmaları için mevcut araçlar sınırlıdır ve deneysel tasarımı daha da karmaşık hale getirmek için, klinik izolatlar genellikle genetik manipülasyonlarda seçim için rutin olarak kullanılan antibiyotiklere dirençlidir3. Özellikle akış pompalarını incelerken karşılaşılan ikinci bir engel, genellikle bilinmeyen faktörler tarafından sıkı bir şekilde düzenlenmeleridir ve bu da işlevi tek bir pompaya doğru bir şekilde izole etmeyi ve atfetmeyizorlaştırır 4. Araştırma araç kutusunu genişletme ihtiyacını görerek, seçim işaretçisi 5,6,7'nin kaldırılmasına izin veren bir Flp rekombinaz hedef (FRT) kaseti içeren mini-Tn7 tabanlı, tek kopya ekleme, indüklenebilir bir ifade sistemi geliştirdik (Şekil 1). İlk olarak Pseudomonas 8,9,10 için oluşturulan bu zarif klonlama ve ekspresyon sistemi, A. baumannii'nin (ATCC 17978::ΔadeIJK,Δ adeFGH,Δ adeAB: bundan böyle A. baumannii AB258 olarak anılacaktır) RND akış pompası eksikliği olan bir suşuna tek kopyalı akış pompası tamamlayıcıları oluşturmak için kullanıldı11. Bir seferde bir akış pompasını inceleyebilmek ve bakteri hücrelerini yüksek kopya ekspresyon ile boğmamak (genellikle plazmid bazlı ekspresyon sistemlerinde görüldüğü gibi), her bir akış pompasının kritik, fizyolojik yönleri hakkında minimum parazit ve azaltılmış komplikasyonlarla daha iyi öğrenilebilir.
Bu makale, mini-Tn7 sisteminin, 9 gün boyunca gerçekleştirilen bir dizi karmaşık olmayan adımla A. baumannii AB258'in kromozomuna silinmiş bir gen, RND akış pompası adeIJK'yi tamamlamak için nasıl kullanılacağını açıklamaktadır7. İlk adım seti, iyi korunmuş glmS geninin akış aşağısındaki tek attTn7 ekleme bölgesinde mini-Tn7 tabanlı ekleme plazmidine (Şekil 2A) klonlanan silinmiş akış pompası genlerini yeniden tanıtır (Şekil 3A). Bu işlem, Tn7 güdümlü yerleştirme için gerekli olan transpozaz genlerini kodlayan replikatif olmayan bir yardımcı plazmit (Şekil 2B) ile kolaylaştırılır. İkinci adım seti, işaretlenmemiş bir suş oluşturmak için FRT bölgeleri (Şekil 3B) ile çevrili gentamisin geninin Flp rekombinaz aracılı çıkarılması için bir eksizyon plazmidi (Şekil 2C) kullanır. Bu sistem, antibiyotik direnci ile ilgili olarak RND akış pompalarının temel rollerini ve olası inhibitörlerini aydınlatmak için kullanılsa da, ilgilenilen herhangi bir geni araştırmak için kullanılabilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 mL PCR tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20170-012</td>
			<td>For colony boil preparations and PCR reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microfuge tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72-690-301</td>
			<td>General use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13-mL culture tubes, Pyrex</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-957K</td>
			<td>Liquid culture vessels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6x DNA loading buffer</td>
			<td>Froggabio</td>
			<td>LD010</td>
			<td>Agarose gel electrophoresis sample loading dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid, glacial</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>351271-212</td>
			<td>Agarose gel running buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>AGR003</td>
			<td>Solid growth media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>BioBasic</td>
			<td>D0012</td>
			<td>Electrophoretic separation of PCR reaction products; used at a concentration of 0.8&#8211;2%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose gel electrophoresis unit</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>29-237-54</td>
			<td>Agarose gel electrophoresis; separation of PCR reaction products</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50841231</td>
			<td>Selective media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture tube closures</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-684-138</td>
			<td>Stainless steel closure for 13-mL culture tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxynucleotide triphosphate (dNTP) set</td>
			<td>Biobasic</td>
			<td>DD0058</td>
			<td>PCR reaction component; supplied as 100 mM each dATP, dCTP, dGTP, dTTP; mixed and diluted for 10 mM each dNTP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry bath/block heater</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>88860023</td>
			<td>Isotemp digital dry bath for boil preparations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation cuvettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89047-208</td>
			<td>2 mm electroporation cuvettes with round cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporator</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>940000009</td>
			<td>110 VAC, 60 Hz electroporator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP102-1</td>
			<td>Visualization of PCR reaction products and DNA marker in agarose gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CA-EM4050</td>
			<td>Agarose gel running buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Biobasic</td>
			<td>GB0217</td>
			<td>For the preparation of selective media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>G33</td>
			<td>Preparation of bacterial stocks for long-term storage in an ultra-low freezer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator (shaking)</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>M1352-0000</td>
			<td>Excella E24 Incubator Shaker for liquid culture growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator (static)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>11-690-550D</td>
			<td>Isotemp Incubator Oven Model 550D for solid (LB agar) culture growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inoculation loop</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>86.1562.050</td>
			<td>Streaking colonies onto agar plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inoculation spreader</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>86.1569.005</td>
			<td>Spreading of culture onto agar plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysogeny broth (LB) broth, Lennox</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1427</td>
			<td>Liquid growth media (20 g/L: 5 g/L sodium chloride, 10 g/L tryptone, 5 g/L yeast extract)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>75002431</td>
			<td>Sorvall Legend Micro 17 for centrifugation of samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-centrifuge</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S67601B</td>
			<td>Centrifugation of 0.2 mL PCR tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>SPL Life Sciences</td>
			<td>10090</td>
			<td>For solid growth media (agar plates): 90 x 15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes&#160;</td>
			<td>Mandel</td>
			<td>Various</td>
			<td>Gilson single channel pipettes (P10, P20, P200, P1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power supply</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1645050</td>
			<td>PowerPac Basic power supply for electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers</td>
			<td>IDT</td>
			<td>NA</td>
			<td>PCR reaction component; specific to gene of interest; prepared at 100 &#956;M as directed on the product specification sheet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>BioBasic</td>
			<td>SB0498</td>
			<td>For the preparation of counterselective media for removal of the pFLP2ab plasmid from transformed A. baumannii</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA polymerase</td>
			<td>FroggaBio</td>
			<td>T-500</td>
			<td>PCR reaction component; polymerase supplied with a 10x buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal cycler</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1861096</td>
			<td>Model T100 for PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toothpicks</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S24559</td>
			<td>For patching colonies onto agar plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1503</td>
			<td>Agarose gel running buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>ZLXLSD51040</td>
			<td>MilliQ water purification system: ultra pure water for media and solution preparation, and cell washing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wide range DNA marker</td>
			<td>Biobasic</td>
			<td>M103R-2</td>
			<td>Size determination of PCR products on an agarose gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wooden inoculating sticks</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>29-801-02</td>
			<td>Inoculating cultures with colonies from agar plates</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterizing multidrug efflux systems in acinetobacter baumannii using an efflux&#45;deficient bacterial strain and a single&#45;copy gene expression system

Acinetobacter baumannii , antibiyotiklere karşı yaygın direnci nedeniyle zorlu bir Gram-negatif patojen olarak kabul edilmektedir. Yeni ve etkili terapötik seçenekler tasarlamak için bu direncin arkasındaki mekanizmaları anlamak çok önemlidir. Ne yazık ki, A. baumannii'deki bu mekanizmaları araştırma yeteneğimiz, uygun genetik manipülasyon araçlarının yetersizliği nedeniyle engellenmektedir. Burada, fonksiyonel RND tipi akış mekanizmalarından yoksun bir A. baumannii suşunda tek kopya gen ekspresyonu elde etmek için kromozomal mini-Tn7 tabanlı bir sistemi kullanma yöntemlerini açıklıyoruz. Yüksek kopya sayılı plazmitlerde RND akış operonlarının varlığı genellikle bakteri hücreleri tarafından zayıf bir şekilde tolere edildiğinden, tek kopya ekleme ve indüklenebilir akış pompası ekspresyonu oldukça avantajlıdır. Ayrıca, rekombinant mini-Tn7 ekspresyon vektörlerinin, artan akış duyarlılığına sahip bir vekil A. baumannii konağının kromozomuna dahil edilmesi, diğer akış pompalarından kaynaklanan parazitlerin önlenmesine yardımcı olur. Bu sistem sadece karakterize edilmemiş bakteriyel akış pompalarını araştırmak için değil, aynı zamanda bu pompaları hedef alan potansiyel inhibitörlerin etkinliğini değerlendirmek için de değerlidir.

Kromozomal yerleştirme prosedürü, seçici bir agar plakasında büyüyen bir sonuç kolonisi görmek için 3 gün boyunca toplam sadece 2 saat sürer (Şekil 1A-C). Dönüşüm plakasında beklenen koloni sayısı suşa bağlıdır: Tn7'nin attTn7 bölgelerine yerleştirilmesi spesifik ve verimli olduğu için 20-30 hatta yüzlerce koloni görülebilir9. Dönüşüm plakası kolonilerinin seçici ortama yamalanması (<stro...

Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Advancing Antibiotic Resistance Research Using an Efflux-Deficient Bacterial Strain and a Single-Copy Gene Expression System at JoVE.com

Yazar Spotlight: Akış Eksikliği Olan Bir Bakteri Suşu ve Tek Kopyalı Gen Ekspresyon Sistemi Kullanarak Antibiyotik Direnci Araştırmasını İlerletmek

Mini-Tn7 tabanlı bir ekspresyon sistemi kullanarak bir akış pompası geninin tek kopyalı kromozomal tamamlayıcısı için tasarlanmış bir akış eksikliği olan Acinetobacter baumannii suşuna kolay bir prosedür tarif ediyoruz. Bu hassas genetik araç, çoklu ilaca dirençli patojenlerde akış pompalarının karakterizasyonu için anahtar olan kontrollü gen ekspresyonuna izin verir.

Acinetobacter baumannii'de Akış Eksikliği Olan Bir Bakteri Suşu ve Tek Kopyalı Gen Ekspresyon Sistemi Kullanılarak Çoklu İlaç Akış Sistemlerinin Karakterize Edilmesi

Acinetobacter baumannii is recognized as a challenging Gram-negative pathogen due to its widespread resistance to antibiotics. It is crucial to comprehend ...

Gram-negatif bakterilerde çoklu ilaç dirençli eflü sistemlerini inceliyoruz. Bu pompaların doğal işlevlerini ve bu pompaların potansiyel bir ilaç hedefi olarak nasıl kullanılabileceğini öğrenmek istiyoruz. Çoklu ilaç direnci akış sistemlerinin ekspresyonu sıkı bir şekilde düzenlenir ve bu da işlevlerini incelemeyi zorlaştırır.Bu nedenle, düzenleyici sistemi atlayan bir ifade sistemi, bu pompaların karakterizasyonunda oldukça faydalı olabilir. Bu protokol, genlerin genellikle doğal ortamlarda görülen seviyelerde ekspresyonuna izin verir. Böylece, gen ürünlerinin aktivitesi doğada gözlemlenenleri taklit eder.

characterizing-multidrug-efflux-systems-acinetobacter-baumannii-using

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Characterizing Multidrug Efflux Systems in Acinetobacter baumannii Using an Efflux&#45;Deficient Bacterial Strain and a Single&#45;Copy Gene Expression System

449 Görüntüleme.  University of Manitoba. Gram-negatif bakterilerde çoklu ilaç dirençli eflü sistemlerini inceliyoruz. Bu pompaların doğal işlevlerini ve bu pompaların potansiyel bir ilaç hedefi olarak nasıl kullanılabileceğini öğrenmek istiyoruz. Çoklu ilaç direnci akış sistemlerinin ekspresyonu sıkı bir şekilde düzenlenir ve bu da işlevlerini incelemeyi zorlaştırır.Bu nedenle, düzenleyici sistemi atlayan bir ifade sistemi, bu pompaların karakterizasyonunda oldukça faydalı olabilir. Bu protokol, ...

Video: Yazar Spotlight: Akış Eksikliği Olan Bir Bakteri Suşu ve Tek Kopyalı Gen Ekspresyon Sistemi Kullanarak Antibiyotik Direnci Araştırmasını İlerletmek

Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes. In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific immune cell types, viral pathogens, parasites and bacteria can be followed in real-time within living animals 1-2. Application of bioluminescence imaging to the study of pathogens has advantages as compared to conventional strategies for analysis of infections in animal models3-4. Infections can be visualized within individual animals over time, without requiring euthanasia to determine the location and quantity of the pathogen. Optical imaging allows comprehensive examination of all tissues and organs, rather than sampling of sites previously known to be infected. In addition, the accuracy of inoculation into specific tissues can be directly determined prior to carrying forward animals that were unsuccessfully inoculated throughout the entire experiment. Variability between animals can be controlled for, since imaging allows each animal to be followed individually. Imaging has the potential to greatly reduce animal numbers needed because of the ability to obtain data from numerous time points without having to sample tissues to determine pathogen load3-4.
This protocol describes methods to visualize infections in live animals using bioluminescence imaging for recombinant strains of bacteria expressing luciferase. The click beetle (CBRLuc) and firefly luciferases (FFluc) utilize luciferin as a substrate5-6. The light produced by both CBRluc and FFluc has a broad wavelength from 500 nm to 700 nm, making these luciferases excellent reporters for the optical imaging in living animal models7-9. This is primarily because wavelengths of light greater than 600 nm are required to avoid absorption by hemoglobin and, thus, travel through mammalian tissue efficiently. Luciferase is genetically introduced into the bacteria to produce light signal10. Mice are pulmonary inoculated with bioluminescent bacteria intratracheally to allow monitoring of infections in real time. After luciferin injection, images are acquired using the IVIS Imaging System. During imaging, mice are anesthetized with isoflurane using an XGI-8 Gas Anethesia System. Images can be analyzed to localize and quantify the signal source, which represents the bacterial infection site(s) and number, respectively. After imaging, CFU determination is carried out on homogenized tissue to confirm the presence of bacteria. Several doses of bacteria are used to correlate bacterial numbers with luminescence. Imaging can be applied to study of pathogenesis and evaluation of the efficacy of antibacterial compounds and vaccines.

Methods for bioluminescence imaging of bacterial infections in living animals are decribed. Pathogens are modified to express luciferase allowing optical whole body imaging of infections in live animals. Animal models can be infected with luciferase expressing pathogens and the resulting course of disease visualized in real-time by bioluminescence imaging.

Farelerde Görüntü Bakteriyel Enfeksiyonlar Lusiferaz Kullanımı

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes.  In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Applying an Inducible Expression System to Study Interference of Bacterial Virulence Factors with Intracellular Signaling

The technique presented here allows one to analyze at which step a target protein, or alternatively a small molecule, interacts with the components of a signaling pathway. The method is based, on the one hand, on the inducible expression of a specific protein to initiate a signaling event at a defined and predetermined step in the selected signaling cascade. Concomitant expression, on the other hand, of the gene of interest then allows the investigator to evaluate if the activity of the expressed target protein is located upstream or downstream of the initiated signaling event, depending on the readout of the signaling pathway that is obtained. Here, the apoptotic cascade was selected as a defined signaling pathway to demonstrate protocol functionality. Pathogenic bacteria, such as Coxiella burnetii, translocate effector proteins that interfere with host cell death induction in the host cell to ensure bacterial survival in the cell and to promote their dissemination in the organism. The C. burnetii effector protein CaeB effectively inhibits host cell death after induction of apoptosis with UV-light or with staurosporine. To narrow down at which step CaeB interferes with the propagation of the apoptotic signal, selected proteins with well-characterized pro-apoptotic activity were expressed transiently in a doxycycline-inducible manner. If CaeB acts upstream of these proteins, apoptosis will proceed unhindered. If CaeB acts downstream, cell death will be inhibited. The test proteins selected were Bax, which acts at the level of the mitochondria, and caspase 3, which is the major executioner protease. CaeB interferes with cell death induced by Bax expression, but not by caspase 3 expression. CaeB, thus, interacts with the apoptotic cascade between these two proteins.

The method described here is used to induce the apoptotic signaling cascade at defined steps in order to dissect the activity of an anti-apoptotic bacterial effector protein. This method can also be used for inducible expression of pro-apoptotic or toxic proteins, or for dissecting interference with other signaling pathways.

Bir uyarılabilir İfade Sistemi uygulamak Hücre içi Sinyali ile Bakteriyel Virulans Faktörler Girişim Eğitim için

The technique presented here allows one to analyze at which step a target protein, or alternatively a small molecule, interacts with the components of a ...

Gene Expression Profiling of Infecting Microbes Using a Digital Bar-coding Platform

For most mammalian pathogens, gene expression profiling studies have been limited by technical difficulties to accurately quantify pathogen gene transcripts from infected tissues. Pathogen RNA constitutes a tiny portion of the total RNA isolated from infected tissue samples. Both microarray and RNAseq technologies have difficulties in generating reliable reads for weakly expressed pathogen genes. Mutant pathogen strains with reduced in vivo proliferation pose an even bigger challenge. Here we describe an in vivo gene expression profiling protocol that is very fast, extremely sensitive and highly reproducible. We developed this protocol during our investigation of the fungal pathogen Candida albicans in a murine model of hematogenously disseminated candidiasis. Using this protocol, we have documented time courses of dynamically regulated C. albicans gene expression during kidney infection, and discovered unexpected features of gene expression responses to antifungal drug treatment in vivo.

We developed a protocol that is fast, sensitive and reproducible for pathogen gene expression profiling during an infection.

Dijital Çizgi-kodlama Platform&#39;u kullanarak bulaşmasını Mikroplar Gen İfadesi profil

For most mammalian pathogens, gene expression profiling studies have been limited by technical difficulties to accurately quantify pathogen gene ...

In Vivo Investigation of Antimicrobial Blue Light Therapy for Multidrug-resistant Acinetobacter baumannii Burn Infections Using Bioluminescence Imaging

Burn infections continue to be an important cause of morbidity and mortality. The increasing emergence of multidrug-resistant (MDR) bacteria has led to the frequent failure of traditional antibiotic treatments. Alternative therapeutics are urgently needed to tackle MDR bacteria.
An innovative non-antibiotic approach, antimicrobial blue light (aBL), has shown promising effectiveness against MDR infections. The mechanism of action of aBL is not yet well understood. It is commonly hypothesized that naturally occurring endogenous photosensitizing chromophores in bacteria (e.g., iron-free porphyrins, flavins, etc.) are excited by aBL, which in turn produces cytotoxic reactive oxygen species (ROS) through a photochemical process.
Unlike another light-based antimicrobial approach, antimicrobial photodynamic therapy (aPDT), aBL therapy does not require the involvement of an exogenous photosensitizer. All it needs to take effect is the irradiation of blue light; therefore, it is simple and inexpensive. The aBL receptors are the endogenous cellular photosensitizers in bacteria, rather than the DNA. Thus, aBL is believed to be much less genotoxic to host cells than ultraviolet-C (UVC) irradiation, which directly causes DNA damage in host cells.
In this paper, we present a protocol to assess the effectiveness of aBL therapy for MDR Acinetobacter baumannii infections in a mouse model of burn injury. By using an engineered bioluminescent strain, we were able to noninvasively monitor the extent of infection in real time in living animals. This technique is also an effective tool for monitoring the spatial distribution of infections in animals.

In Vivo Investigation of Antimicrobial Blue Light Therapy for Multidrug-resistant Acinetobacter baumannii Burn Infections Using Bioluminescence Imaging

Infections caused by multidrug-resistant (MDR) bacterial strains have emerged as a serious threat to public health, necessitating the development of alternative therapeutics. We present a protocol to evaluate the effectiveness of antimicrobial blue light (aBL) therapy for MDR Acinetobacter baumannii infections in mouse burns by using bioluminescence imaging.

Çok ilaca dirençli için Antimikrobiyal Mavi Işık Tedavisinin Vivo İncelenmesinin Acinetobacter baumannii Biyoparlaklık ımaging&#39;i kullanarak Enfeksiyonlar Yanık

Burn infections continue to be an important cause of morbidity and mortality. The increasing emergence of multidrug-resistant (MDR) bacteria has led to ...

Monitoring Bacterial Colonization and Maintenance on Arabidopsis thaliana Roots in a Floating Hydroponic System

Bacteria form complex rhizosphere microbiomes shaped by interacting microbes, larger organisms, and the abiotic environment. Under laboratory conditions, rhizosphere colonization by plant growth-promoting bacteria (PGPB) can increase the health or the development of host plants relative to uncolonized plants. However, in field settings, bacterial treatments with PGPB often do not provide substantial benefits to crops. One explanation is that this may be due to loss of the PGPB during interactions with endogenous soil microbes over the lifespan of the plant. This possibility has been difficult to confirm, since most studies focus on the initial colonization rather than maintenance of PGPB within rhizosphere communities. It is hypothesized here that the assembly, coexistence, and maintenance of bacterial communities are shaped by deterministic features of the rhizosphere microenvironment, and that these interactions may impact PGPB survival in native settings. To study these behaviors, a hydroponic plant-growth assay is optimized using Arabidopsis thaliana to quantify and visualize the spatial distribution of bacteria during initial colonization of plant roots and after transfer to different growth environments. This system&#8217;s reproducibility and utility are then validated with the well-studied PGPB Pseudomonas simiae. To investigate how the presence of multiple bacterial species may affect colonization and maintenance dynamics on the plant root, a model community from three bacterial strains (an Arthrobacter, Curtobacterium, and Microbacterium species) originally isolated from the A. thaliana rhizosphere is constructed. It is shown that the presence of these diverse bacterial species can be measured using this hydroponic plant-maintanence assay, which provides an alternative to sequencing-based bacterial community studies. Future studies using this system may improve the understanding of bacterial behavior in multispecies plant microbiomes over time and in changing environmental conditions.

Monitoring Bacterial Colonization and Maintenance on Arabidopsis thaliana Roots in a Floating Hydroponic System

Here we describe a hydroponic plant growth assay to quantify species presence and visualize the spatial distribution of bacteria during initial colonization of plant roots and after their transfer into different growth environments.

Yüzen hidroponik sistemde Arabidopsis thaliana kökleri üzerinde bakteriyel kolonizasyon ve bakım izleme

Bacteria form complex rhizosphere microbiomes shaped by interacting microbes, larger organisms, and the abiotic environment. Under laboratory conditions, ...

Measurement of Pulse Propagation Velocity, Distensibility and Strain in an Abdominal Aortic Aneurysm Mouse Model

An abdominal aortic aneurysm (AAA) is defined as a localized dilation of the abdominal aorta that exceeds the maximal intraluminal diameter (MILD) by 1.5 times of its original size. Clinical and experimental studies have shown that small aneurysms may rupture, while a subpopulation of large aneurysms may remain stable. Thus, in addition to the measurement of intraluminal diameter of the aorta, knowledge of structural traits of the vessel wall may provide important information to assess the stability of the AAA. Aortic stiffening has recently emerged as a reliable tool to determine early changes in the vascular wall. Pulse propagation velocity (PPV) along with the distensibility and radial strain are highly useful ultrasound-based methods relevant for assessing aortic stiffness. The primary purpose of this protocol is to provide a comprehensive technique for the use of ultrasound imaging system to acquire images and analyze the structural and functional properties of the aorta as determined by MILD, PPV, distensibility and radial strain.

This manuscript describes a detailed protocol for using high frequency ultrasound imaging to measure luminal diameter, pulse propagation velocity, distensibility and radial strain on a mouse model of abdominal aortic aneurysm.

Abdominal Aort Anevrizması Fare Modelinde Nabız Yayılma Hızı, Şişkinlik ve GerinimÖlçümü

An abdominal aortic aneurysm (AAA) is defined as a localized dilation of the abdominal aorta that exceeds the maximal intraluminal diameter (MILD) by 1.5 ...

Separation of the Cell Envelope for Gram-negative Bacteria into Inner and Outer Membrane Fractions with Technical Adjustments for Acinetobacter baumannii

This method works by partitioning the envelope of Gram-negative bacteria into total, inner, and outer membrane (OM) fractions and concludes with assays to assess the purity of the bilayers. The OM has an increased overall density compared to the inner membrane, largely due to the presence of lipooligosaccharides (LOS) and lipopolysaccharides (LPS) within the outer leaflet. LOS and LPS molecules are amphipathic glycolipids that have a similar structure, which consists of a lipid-A disaccharolipid and core-oligosaccharide substituent. However, only LPS molecules are decorated with a third subunit known as the O-polysaccharide, or O-antigen. The type and amount of glycolipids present will impact an organism&#8217;s OM density. Therefore, we tested whether the membranes of bacteria with varied glycolipid content could be similarly isolated using our technique. For the LPS-producing organisms, Salmonella enterica serovar Typhimurium and Escherichia coli, the membranes were easily isolated and the LPS O-antigen moiety did not impact bilayer partitioning. Acinetobacter baumannii produces LOS molecules, which have a similar mass to O-antigen deficient LPS molecules; however, the membranes of these microbes could not initially be separated. We reasoned that the OM of A. baumannii was less dense than that of Enterobacteriaceae, so the sucrose gradient was adjusted and the membranes were isolated. The technique can therefore be adapted and modified for use with other organisms.

Separation of the Cell Envelope for Gram-negative Bacteria into Inner and Outer Membrane Fractions with Technical Adjustments for Acinetobacter baumannii

Gram-negative bacteria produce two spatially segregated membranes. The outer membrane is partitioned from the inner membrane by a periplasm and a peptidoglycan layer. The ability to isolate the dual bilayers of these microbes has been critical for understanding their physiology and pathogenesis.

Gram-negatif Bakteriler için Hücre Zarfının İç ve Dış Membran Fraksiyonlarına Ayrılması Acinetobacter baumannii için Teknik Ayarlamalar

This method works by partitioning the envelope of Gram-negative bacteria into total, inner, and outer membrane (OM) fractions and concludes with assays to ...

NF-&#954;B-dependent Luciferase Activation and Quantification of Gene Expression in Salmonella Infected Tissue Culture Cells

The dimeric transcription factor NF-&#954;B regulates many cellular response pathways, including inflammatory pathways by inducing the expression of various cytokines and chemokines. NF-&#954;B is constitutively expressed and is sequestered in the cytosol by the inhibitory protein nuclear factor of kappa light polypeptide gene enhancer in B cells inhibitor, alpha (I&#954;B&#945;). Activation of NF-&#954;B requires the degradation of I&#954;B&#945;, which then exposes a nuclear localization signal on NF-&#954;B and promotes its trafficking to the nucleus. Once in the nucleus, NF-&#954;B binds to the promotor region of NF-&#954;B target genes such as interleukin 6 (IL-6) and IL-23, to promote their expression.
The activation of NF-&#954;B occurs independently of transcription or translation. Therefore, the activation state of NF-&#954;B must be measured either by quantifying NF-&#954;B specifically in the nucleus, or by quantifying expression of NF-&#954;B target genes. In this protocol, cells stably transfected with an NF-&#954;B::luciferase reporter construct are assayed for NF-&#954;B activation using in vitro tissue culture techniques. These cells are infected with Salmonella Typhimurium to activate NF-&#954;B, which traffics to the nucleus and binds to &#954;B sites in the promoter region of luciferase, inducing its expression. Cells are lysed and analyzed with the luciferase assay system. The amount of luciferase produced by the cells correlates with the intensity of the luminescence signal, which is detected by a plate reader. The luminescence signal generated by this procedure provides a quick and highly sensitive method by which to assess NF-&#954;B activation under a range of conditions. This protocol also utilizes quantitative reverse transcription PCR (RT-qPCR) to detect relative mRNA levels that are indicative of gene expression.

Here, we present a protocol to quickly and easily measure nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells (NF-&#954;B) activation in cell lines expressing NF-&#954;B::luciferase reporter constructs, via measurements of luminescence in the cell lysate. Additionally, gene expression is determined via RT-qPCR isolated from cells infected with Salmonella Typhimurium.

Salmonella Enfekte Doku Kültür Hücrelerinde NF-κB bağımlı Luciferase Aktivasyonu ve Gen Ekspresyonunun Nicelleştirilmesi

The dimeric transcription factor NF-&#954;B regulates many cellular response pathways, including inflammatory pathways by inducing the expression of ...

Visualization of Bacterial Resistance using Fluorescent Antibiotic Probes

Fluorescent antibiotics are multipurpose research tools that are readily used for the study of antimicrobial resistance, due to their significant advantage over other methods. To prepare these probes, azide derivatives of antibiotics are synthesized, then coupled with alkyne-fluorophores using azide-alkyne dipolar cycloaddition by click chemistry. Following purification, the antibiotic activity of the fluorescent antibiotic is tested by minimum inhibitory concentration assessment. In order to study bacterial accumulation, either spectrophotometry or flow cytometry may be used, allowing for much simpler analysis than methods relying on radioactive antibiotic derivatives. Furthermore, confocal microscopy can be used to examine localization within the bacteria, affording valuable information about mode of action and changes that occur in resistant species. The use of fluorescent antibiotic probes in the study of antimicrobial resistance is a powerful method with much potential for future expansion.

Fluorescently tagged antibiotics are powerful tools that can be used to study multiple aspects of antimicrobial resistance. This article describes the preparation of fluorescently tagged antibiotics and their application to studying antibiotic resistance in bacteria. Probes can be used to study mechanisms of bacterial resistance (e.g., efflux) by spectrophotometry, flow cytometry, and microscopy.

Floresan Antibiyotik Probları Kullanılarak Bakteriyel Direncin Görüntülenmesi

Fluorescent antibiotics are multipurpose research tools that are readily used for the study of antimicrobial resistance, due to their significant ...

Gene Knock-in by CRISPR/Cas9 and Cell Sorting in Macrophage and T Cell Lines

Functional genomics studies of the immune system require genetic manipulations that involve both deletion of target genes and addition of elements to proteins of interest. Identification of gene functions in cell line models is important for gene discovery and exploration of cell-intrinsic mechanisms. However, genetic manipulations of immune cells such as T cells and macrophage cell lines using CRISPR/Cas9-mediated knock-in are difficult because of the low transfection efficiency of these cells, especially in a quiescent state. To modify genes in immune cells, drug-resistance selection and viral vectors are typically used to enrich for cells expressing the CRIPSR/Cas9 system, which inevitably results in undesirable intervention of the cells. In a previous study, we designed dual fluorescent reporters coupled to CRISPR/Cas9 that were transiently expressed after electroporation. This technical solution leads to rapid gene deletion in immune cells; however, gene knock-in in immune cells such as T cells and macrophages without the use of drug-resistance selection or viral vectors is even more challenging. In this article, we show that by using cell sorting to aid selection of cells transiently expressing CRISPR/Cas9 constructs targeting the Rosa26 locus in combination with a donor plasmid, gene knock-in can be achieved in both T cells and macrophages without drug-resistance enrichment. As an example, we show how to express human ACE2, a receptor of SARS-Cov-2, which is responsible for the current Covid-19 pandemic, in RAW264.7 macrophages by performing knock-in experiments. Such gene knock-in cells can be widely used for mechanistic studies.

This protocol uses fluorescent reporters and cell sorting to simplify knock-in experiments in macrophage and T cell lines. Two plasmids are used for these simplified knock-in experiments, namely a CRISPR/Cas9- and DsRed2-expressing plasmid and a homologous recombination donor plasmid expressing EBFP2, which is permanently integrated at the Rosa26 locus in immune cells.

MACROPHAGE ve T Hücre Hatlarında CRISPR/Cas9 ve Hücre Sıralama tarafından Gen Knock-in

Functional genomics studies of the immune system require genetic manipulations that involve both deletion of target genes and addition of elements to ...