Nous exprimons notre gratitude au groupe du Dr Eric Olson du UT Southwestern Medical Center pour avoir généreusement partagé les modèles animaux. Nous apprécions tous les commentaires constructifs fournis par les membres de D-incubator à UT Dallas. Ce travail a été soutenu par le programme NIH R00HL148493 (Y.D.), R01HL162635 (Y.D.) et UT Dallas STARS (Y.D.).

Microscopie à feuillet de lumière et nettoyage des tissus pour une imagerie cardiaque complète

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Les progrès de l’imagerie, du calcul et des méthodes d’élimination des tissus ont fourni une occasion sans précédent d’étudier en profondeur la structure et la fonction cardiaques. Cela présente un grand potentiel pour approfondir notre compréhension de la morphogenèse et de la pathogenèse cardiaques à l’aide d’un modèle de cœur de rongeur intact. Contrairement aux études in vivo du cœur de poisson-zèbre utilisant une approche similaire 40,41,42,43, l’intégration de techniques LSM av...

L’insuffisance cardiaque reste la principale cause de mortalité dans le monde, principalement en raison du manque de capacité de régénération des cardiomyocytes matures1. L’architecture complexe du cœur joue un rôle crucial dans sa fonction et donne un aperçu des processus de développement. Une compréhension approfondie de la structure cardiaque est essentielle pour élucider les processus fondamentaux de la morphogenèse et du remodelage cardiaques en réponse à l’infarctus du myocarde. Des progrès récents ont démontré que les souris néonatales peuvent restaurer la fonction cardiaque après une blessure, alors que les souris adultes n’ont pas une telle capacité de régénération2. Cela établit une base pour l’étude des indices associés aux anomalies structurelles et fonctionnelles dans les modèles murins. Les méthodes d’imagerie traditionnelles, telles que la microscopie confocale, présentent des limites techniques, notamment une profondeur de pénétration limitée, un schéma de balayage ponctuel lent et des dommages photographiques dus à une exposition prolongée à la lumière laser. Ceux-ci entravent l’imagerie tridimensionnelle (3D) complète du cœur intact. Dans ce contexte, la microscopie à feuillet de lumière (LSM) apparaît comme une solution puissante, offrant les avantages d’une imagerie à grande vitesse, d’une réduction des dommages photographiques et de capacités exceptionnelles de sectionnement optique 3,4,5. Les caractéristiques uniques de la LSM en font une méthode prometteuse pour surmonter les limites des techniques conventionnelles, fournissant des informations sans précédent sur les processus de développement et de remodelage cardiaques 6,7,8.
Dans ce protocole, nous introduisons une stratégie d’imagerie qui combine une LSM avancée avec des approches de clarification tissulaire adaptées9, permettant l’imagerie de cœurs de souris entiers sans avoir besoin d’un marquage spécifique et d’une section mécanique. Nous proposons en outre que l’imagerie LSM conventionnelle puisse être améliorée par des techniques de déconvolutionmultivue 10 ou de microscopie à feuillet de lumière à balayage axial (ASLM) 11,12,13,14,15 pour améliorer la résolution axiale. De plus, l’intégration de l’assemblage d’images avec l’une ou l’autre de ces méthodes peut surmonter efficacement le compromis entre la résolution spatiale et le champ de vision (FOV), faisant ainsi progresser l’imagerie des cœurs de souris adultes. L’incorporation de nombreuses approches de nettoyage des tissus, y compris les méthodes hydrophobes, hydrophiles et à base d’hydrogel, permet une pénétration plus profonde de la lumière pour capturer la morphologie de l’ensemble du cœur 16,17,18,19.
Bien que plusieurs méthodes de clarification soient compatibles avec les systèmes LSM actuels, l’objectif est de minimiser la diffusion des photons et d’améliorer la pénétration de la lumière dans les tissus, comme le cœur, en remplaçant les lipides par un milieu qui correspond étroitement à son indice de réfraction. iDISCO a été choisi comme représentant20,21 et adapté à l’imagerie par autofluorescence dans ce protocole en raison de son traitement rapide et de sa grande transparence (Figure 1A). Collectivement, l’intégration de l’approche LSM avancée avec des techniques de nettoyage des tissus offre un cadre prometteur pour démêler l’anatomie cardiaque complexe dans les cœurs de rongeurs, avec un potentiel important pour faire progresser notre compréhension de la morphogenèse et de la pathogenèse cardiaques.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>1% Agarose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low melting point agarose</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>16520050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals for tissue clearing&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-Amino-1,3,3-trimethylcyclohexanemethylamine, mixture of cis and trans</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>118184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D.E.R.&#8482; 332</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>31185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D.E.R.&#8482; 736</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>31191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dibenzyl ether (DBE)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>33630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane (DCM)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>270997</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent beads</td>
			<td>Spherotech</td>
			<td>FP-0556-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide (H2O2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>216736</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>439193</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>47392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>79383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software and algorithms</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amira</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>2021.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BigStitcher</td>
			<td>H&#246;rl et al.22</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji-ImageJ</td>
			<td>Schindelin et al.20</td>
			<td>1.54f</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCImage Live</td>
			<td>Hamamatsu Photonics</td>
			<td>4.6.1.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabVIEW</td>
			<td>National Instruments Corporation</td>
			<td>2017 SP1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Key components of the customized light-sheet system</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.63 - 6.3X Zoom body</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>MVX-ZB10&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Illumination objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRH00105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X detection objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>MV PLAPO 1X/0.25&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>473nm DPSS Laser</td>
			<td>Laserglow Technologies</td>
			<td>LRS-0473-PFM-00100-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>532nm DPSS laser</td>
			<td>Laserglow Technologies</td>
			<td>LRS-0532-PFM-00100-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>589&#8201;nm DPSS laser</td>
			<td>Laserglow Technologies</td>
			<td>LRS-0589-GFF-00100-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BNC connector</td>
			<td>National Instrument</td>
			<td>BNC-2110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cylindrical lens</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>ACY254-050-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC-Motor Controller, 4 axes</td>
			<td>Physik Instrumente</td>
			<td>C-884.4DC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ETL</td>
			<td>Optotune</td>
			<td>EL-16-40-TC-VIS-5D-1-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ETL Cable</td>
			<td>Optotune</td>
			<td>CAB-6-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ETL Lens Driver</td>
			<td>Optotune</td>
			<td>EL-E-4i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET525/30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET585-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET645-75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter wheel&#160;</td>
			<td>Shutter Instrument</td>
			<td>LAMBDA 10-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized translation stage</td>
			<td>Physik Instrumente</td>
			<td>L-406.20DG10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized translation stage</td>
			<td>Physik Instrumente</td>
			<td>L-406.40DG10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized translation stage</td>
			<td>Physik Instrumente</td>
			<td>M-403.4PD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NI multifunction I/O</td>
			<td>National Instrument</td>
			<td>PCIe-6363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sCMOS camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C13440-20CU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stepper motor</td>
			<td>Pololu</td>
			<td>1474</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube lens</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>MVX-TLU</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

light-sheet imaging to reveal cardiac structure in rodent hearts

La microscopie à feuillet de lumière (LSM) joue un rôle central dans la compréhension de la structure tridimensionnelle complexe (3D) du cœur, fournissant des informations cruciales sur la physiologie cardiaque fondamentale et les réponses pathologiques. Nous nous penchons ici sur le développement et la mise en œuvre de la technique LSM pour élucider la micro-architecture du cœur dans des modèles murins. La méthodologie intègre un système LSM personnalisé avec des techniques de nettoyage des tissus, atténuant la diffusion de la lumière dans les tissus cardiaques pour l’imagerie volumétrique. La combinaison d’un LSM conventionnel avec des approches d’assemblage d’images et de déconvolution multivues permet de capturer l’ensemble du cœur. Pour résoudre le compromis inhérent entre la résolution axiale et le champ de vision (FOV), nous introduisons une méthode de microscopie à feuillet de lumière à balayage axial (ASLM) pour minimiser la lumière floue et éclairer uniformément le cœur dans le sens de la propagation. Entre-temps, les méthodes de nettoyage des tissus telles que iDISCO améliorent la pénétration de la lumière, facilitant la visualisation des structures profondes et assurant un examen complet du myocarde dans l’ensemble du cœur. La combinaison du LSM proposé et des méthodes de nettoyage des tissus présente une plate-forme prometteuse pour les chercheurs dans la résolution des structures cardiaques dans les cœurs de rongeurs, avec un grand potentiel pour la compréhension de la morphogenèse et du remodelage cardiaques.

Heart failure remains the leading cause of mortality worldwide, primarily due to the lack of regenerative capacity of mature cardiomyocytes1. The intricate architecture of the heart plays a crucial role in its function and provides insights into developmental processes. A profound understanding of cardiac structure is essential for elucidating the fundamental processes of cardiac morphogenesis and remodeling in response to myocardial infarction. Recent progress has demonstrated that neonatal mice can restore cardiac function following injury, while adult mice lack such regenerative capacity2. This establishes a foundation for investigating cues associated with structural and functional abnormalities in mouse models. Traditional imaging methods, such as confocal microscopy, have technical limitations, including restricted penetration depth, slow point-scanning scheme, and photo damage from prolonged exposure to laser light. These hinder comprehensive three-dimensional (3D) imaging of the intact heart. In this context, light-sheet microscopy (LSM) emerges as a powerful solution, offering the advantages of high-speed imaging, reduced photo damage, and exceptional optical sectioning capabilities3,4,5. The unique features of LSM position it as a promising method to overcome the limitations of conventional techniques, providing unprecedented insights into cardiac development and remodeling processes6,7,8.
In this protocol, we introduce an imaging strategy that combines advanced LSM with adapted tissue clearing approaches9, allowing for the imaging of entire mouse hearts without the need for specific labeling and mechanical sectioning. We further propose that conventional LSM imaging can be enhanced through multiview deconvolution10 or axially swept light-sheet microscopy (ASLM) techniques11,12,13,14,15 to improve axial resolution. Additionally, the integration of image stitching with either of these methods can effectively overcome the trade-off between spatial resolution and field of view (FOV), thereby advancing the imaging of adult mouse hearts. The incorporation of numerous tissue clearing approaches, including hydrophobic, hydrophilic, and hydrogel-based methods, enables deeper light penetration for capturing the morphology of the entire heart16,17,18,19.
While multiple clearing methods are compatible with current LSM systems, the goal is to minimize photon scattering and enhance light penetration in tissues, like the heart, by replacing lipids with a medium that closely matches its refractive index. iDISCO was chosen as the representative20,21 and adapted for autofluorescence imaging in this protocol due to its rapid processing and high transparency (Figure 1A). Collectively, the integration of the advanced LSM approach with tissue clearing techniques offers a promising framework to unravel intricate cardiac anatomy in rodent hearts, holding significant potential for advancing our understanding of cardiac morphogenesis and pathogenesis.

Pleins feux sur l’auteur : Imagerie personnalisée à feuillet de lumière pour l’étude des structures myocardiques dans les cœurs de rongeurs

L’imagerie par feuillet de lumière révèle la structure cardiaque du cœur des rongeurs

Il a été démontré que la LSM favorise les études cardiaques 31,32,33,34,35,36,37 en raison du risque minimal de photodommages, de la haute résolution spatiale et du sectionnement optique par rapport à d’autres méthodes d’imagerie optique telles que les techniques de balayage en fond clair et en point <...

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Le protocole utilise la microscopie à feuillet de lumière avancée ainsi que des méthodes de nettoyage tissulaire adaptées pour étudier les structures cardiaques complexes dans les cœurs de rongeurs, ce qui présente un grand potentiel pour la compréhension de la morphogenèse et du remodelage cardiaques.

Light-sheet microscopy (LSM) plays a pivotal role in comprehending the intricate three-dimensional (3D) structure of the heart, providing crucial insights ...

Notre recherche vise à personnaliser un système d’imagerie à feuillet de lumière pour étudier les structures myocardiques du cœur intact d’un rongeur au niveau cellulaire. Nous avons développé un flux de travail pour explorer le myocarde intact avec une résolution isotrope au niveau du micron du cœur de rongeur néonatal à adulte. Notre étude comble une lacune dans l’étude des microstructures myocardiques complexes, telles que la trabéculation, à l’intérieur des ventricules intacts, avec une haute résolution spatiale.Cette stratégie d’imagerie fournit un point d’entrée pour évaluer la microstructure sans tranchage physique, ce qui permet de mieux comprendre le développement et le remodelage cardiaques. Nous nous concentrerons sur l’exploration des changements structurels du myocarde en réponse aux lésions cardiaques et au remodelage.

light-sheet-imaging-to-reveal-cardiac-structure-in-rodent-hearts

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Light-Sheet Imaging to Reveal Cardiac Structure in Rodent Hearts

607 vues.  The University of Texas at Dallas. Notre recherche vise à personnaliser un système d’imagerie à feuillet de lumière pour étudier les structures myocardiques du cœur intact d’un rongeur au niveau cellulaire. Nous avons développé un flux de travail pour explorer le myocarde intact avec une résolution isotrope au niveau du micron du cœur de rongeur néonatal à adulte. Notre étude comble une lacune dans l’étude des microstructures myocardiques complexes, telles que la trabéculation, à l’intérieur des ventri...

Vidéo: Pleins feux sur l’auteur : Imagerie personnalisée à feuillet de lumière pour l’étude des structures myocardiques dans les cœurs de rongeurs

Light-sheet microscopy (LSM) plays a pivotal role in comprehending the intricate three-dimensional (3D) structure of the heart, providing crucial insights into fundamental cardiac physiology and pathologic responses. We hereby delve into the development and implementation of the LSM technique to elucidate the micro-architecture of the heart in mouse models. The methodology integrates a customized LSM system with tissue clearing techniques, mitigating light scattering within cardiac tissues for volumetric imaging. The combination of conventional LSM with image stitching and multiview deconvolution approaches allows for the capture of the entire heart. To address the inherent trade-off between axial resolution and field of view (FOV), we further introduce an axially swept light-sheet microscopy (ASLM) method to minimize out-of-focus light and uniformly illuminate the heart across the propagation direction. In the meanwhile, tissue clearing methods such as iDISCO enhance light penetration, facilitating the visualization of deep structures and ensuring a comprehensive examination of the myocardium throughout the entire heart. The combination of the proposed LSM and tissue clearing methods presents a promising platform for researchers in resolving cardiac structures in rodent hearts, holding great potential for the understanding of cardiac morphogenesis and remodeling.

The protocol utilizes advanced light-sheet microscopy along with adapted tissue clearing methods to investigate intricate cardiac structures in rodent hearts, holding great potential for the understanding of cardiac morphogenesis and remodeling.