動物モデルを惜しみなく共有してくれたUTサウスウェスタンメディカルセンターのエリックオルソン博士のグループに感謝の意を表します。UTダラスのDインキュベーターメンバーから提供されたすべての建設的なコメントに感謝します。この研究は、NIH R00HL148493(Y.D.)、R01HL162635(Y.D.)、およびUTダラスSTARSプログラム(Y.D.)の支援を受けました。

包括的な心臓イメージングのためのライトシート顕微鏡検査と組織透明化

著者には、開示すべき利益相反はありません。

イメージング、計算、および組織透明化方法の進歩は、心臓の構造と機能を広範囲に調査する比類のない機会を提供しました。これは、無傷のげっ歯類の心臓モデルを使用して、心臓の形態形成と病因の理解を深める大きな可能性を秘めています。同様のアプローチを用いたゼブラフィッシュの心臓のin vivo研究40,41,42,43とは対照的に、高度なLSM技術と組織透明化法の統合によ?...

心不全は、主に成熟した心筋細胞の再生能力の欠如により、世界中で依然として主要な死亡原因となっています1。心臓の複雑な構造は、その機能において重要な役割を果たし、発達過程への洞察を提供します。心筋梗塞に対する心臓の形態形成やリモデリングの根本的な過程を解明するためには、心臓の構造を深く理解することが不可欠です。近年の進歩により、新生児マウスは損傷後に心機能を回復できるが、成体マウスにはそのような再生能力がないことが示されている2。これにより、マウスモデルの構造的および機能的異常に関連する手がかりを調査するための基盤が確立されます。共焦点顕微鏡などの従来のイメージング方法には、透過深度の制限、低速な点走査方式、レーザー光への長時間の曝露による光損傷などの技術的な制限があります。これらは、無傷の心臓の包括的な3次元(3D)イメージングを妨げます。これに関連して、ライトシート顕微鏡(LSM)は強力なソリューションとして浮上し、高速イメージング、写真による損傷の低減、および卓越した光学セクショニング機能の利点を提供します3,4,5。LSMのユニークな特徴は、従来の技術の限界を克服するための有望な方法として位置付けられ、心臓の発生とリモデリングプロセスに関する前例のない洞察を提供します6,7,8。
このプロトコルでは、高度なLSMと適応した組織透明化アプローチ9を組み合わせたイメージング戦略を導入し、特定の標識や機械的切片化を必要とせずにマウス心臓全体のイメージングを可能にします。さらに、従来のLSMイメージングは、マルチビューデコンボリューション10または軸方向に掃引されたライトシート顕微鏡(ASLM)技術11,12,13,14,15によって強化され、軸方向の分解能を向上させることができることを提案する。さらに、これらの方法のいずれかと画像スティッチングを統合することで、空間分解能と視野(FOV)のトレードオフを効果的に克服し、成体マウスの心臓のイメージングを進歩させることができます。疎水性、親水性、およびハイドロゲルベースの方法を含む多数の組織透明化アプローチを組み込むことにより、心臓全体の形態を捕捉するためのより深い光透過が可能になります16,17,18,19。
現在のLSMシステムとは複数のクリアリング方法と互換性がありますが、目標は、脂質を屈折率に近い媒体に置き換えることにより、光子散乱を最小限に抑え、心臓などの組織への光の透過性を高めることです。iDISCOは代表20,21として選択され、その迅速な処理と高い透明性により、このプロトコルの自家蛍光イメージングに適合しました(図1A)。全体として、高度なLSMアプローチと組織除去技術の統合は、げっ歯類の心臓の複雑な心臓解剖学的構造を解明するための有望なフレームワークを提供し、心臓の形態形成と病因の理解を深めるための大きな可能性を秘めています。

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	<tbody>
		<tr>
			<td>1% Agarose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low melting point agarose</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>16520050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals for tissue clearing&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-Amino-1,3,3-trimethylcyclohexanemethylamine, mixture of cis and trans</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>118184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D.E.R.&#8482; 332</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>31185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D.E.R.&#8482; 736</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>31191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dibenzyl ether (DBE)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>33630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane (DCM)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>270997</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent beads</td>
			<td>Spherotech</td>
			<td>FP-0556-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide (H2O2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>216736</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>439193</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>47392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>79383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software and algorithms</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amira</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>2021.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BigStitcher</td>
			<td>H&#246;rl et al.22</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji-ImageJ</td>
			<td>Schindelin et al.20</td>
			<td>1.54f</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCImage Live</td>
			<td>Hamamatsu Photonics</td>
			<td>4.6.1.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabVIEW</td>
			<td>National Instruments Corporation</td>
			<td>2017 SP1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Key components of the customized light-sheet system</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.63 - 6.3X Zoom body</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>MVX-ZB10&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Illumination objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRH00105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X detection objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>MV PLAPO 1X/0.25&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>473nm DPSS Laser</td>
			<td>Laserglow Technologies</td>
			<td>LRS-0473-PFM-00100-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>532nm DPSS laser</td>
			<td>Laserglow Technologies</td>
			<td>LRS-0532-PFM-00100-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>589&#8201;nm DPSS laser</td>
			<td>Laserglow Technologies</td>
			<td>LRS-0589-GFF-00100-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BNC connector</td>
			<td>National Instrument</td>
			<td>BNC-2110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cylindrical lens</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>ACY254-050-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC-Motor Controller, 4 axes</td>
			<td>Physik Instrumente</td>
			<td>C-884.4DC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ETL</td>
			<td>Optotune</td>
			<td>EL-16-40-TC-VIS-5D-1-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ETL Cable</td>
			<td>Optotune</td>
			<td>CAB-6-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ETL Lens Driver</td>
			<td>Optotune</td>
			<td>EL-E-4i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET525/30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET585-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET645-75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter wheel&#160;</td>
			<td>Shutter Instrument</td>
			<td>LAMBDA 10-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized translation stage</td>
			<td>Physik Instrumente</td>
			<td>L-406.20DG10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized translation stage</td>
			<td>Physik Instrumente</td>
			<td>L-406.40DG10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized translation stage</td>
			<td>Physik Instrumente</td>
			<td>M-403.4PD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NI multifunction I/O</td>
			<td>National Instrument</td>
			<td>PCIe-6363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sCMOS camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C13440-20CU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stepper motor</td>
			<td>Pololu</td>
			<td>1474</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube lens</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>MVX-TLU</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

light-sheet imaging to reveal cardiac structure in rodent hearts

ライトシート顕微鏡(LSM)は、心臓の複雑な3次元(3D)構造を理解する上で極めて重要な役割を果たし、基本的な心臓生理学と病理学的反応に関する重要な洞察を提供します。ここでは、マウスモデルにおける心臓のマイクロアーキテクチャを解明するためのLSM技術の開発と実装を掘り下げます。この手法は、カスタマイズされたLSMシステムと組織透明化技術を統合し、体積イメージングのための心臓組織内の光散乱を軽減します。従来のLSMと画像スティッチングおよびマルチビューデコンボリューションアプローチを組み合わせることで、心臓全体をキャプチャできます。軸方向の分解能と視野(FOV)の間の固有のトレードオフに対処するために、焦点の合っていない光を最小限に抑え、伝搬方向全体で心臓を均一に照らす軸方向に掃引ライトシート顕微鏡(ASLM)法をさらに導入します。一方、iDISCOなどの組織透明化法は、光の透過性を高め、深部構造の可視化を容易にし、心臓全体の心筋を包括的に検査することができます。提案されたLSMと組織透明化法の組み合わせは、げっ歯類の心臓の心臓構造を解明する上で研究者にとって有望なプラットフォームを提供し、心臓の形態形成とリモデリングの理解に大きな可能性を秘めています。

Heart failure remains the leading cause of mortality worldwide, primarily due to the lack of regenerative capacity of mature cardiomyocytes1. The intricate architecture of the heart plays a crucial role in its function and provides insights into developmental processes. A profound understanding of cardiac structure is essential for elucidating the fundamental processes of cardiac morphogenesis and remodeling in response to myocardial infarction. Recent progress has demonstrated that neonatal mice can restore cardiac function following injury, while adult mice lack such regenerative capacity2. This establishes a foundation for investigating cues associated with structural and functional abnormalities in mouse models. Traditional imaging methods, such as confocal microscopy, have technical limitations, including restricted penetration depth, slow point-scanning scheme, and photo damage from prolonged exposure to laser light. These hinder comprehensive three-dimensional (3D) imaging of the intact heart. In this context, light-sheet microscopy (LSM) emerges as a powerful solution, offering the advantages of high-speed imaging, reduced photo damage, and exceptional optical sectioning capabilities3,4,5. The unique features of LSM position it as a promising method to overcome the limitations of conventional techniques, providing unprecedented insights into cardiac development and remodeling processes6,7,8.
In this protocol, we introduce an imaging strategy that combines advanced LSM with adapted tissue clearing approaches9, allowing for the imaging of entire mouse hearts without the need for specific labeling and mechanical sectioning. We further propose that conventional LSM imaging can be enhanced through multiview deconvolution10 or axially swept light-sheet microscopy (ASLM) techniques11,12,13,14,15 to improve axial resolution. Additionally, the integration of image stitching with either of these methods can effectively overcome the trade-off between spatial resolution and field of view (FOV), thereby advancing the imaging of adult mouse hearts. The incorporation of numerous tissue clearing approaches, including hydrophobic, hydrophilic, and hydrogel-based methods, enables deeper light penetration for capturing the morphology of the entire heart16,17,18,19.
While multiple clearing methods are compatible with current LSM systems, the goal is to minimize photon scattering and enhance light penetration in tissues, like the heart, by replacing lipids with a medium that closely matches its refractive index. iDISCO was chosen as the representative20,21 and adapted for autofluorescence imaging in this protocol due to its rapid processing and high transparency (Figure 1A). Collectively, the integration of the advanced LSM approach with tissue clearing techniques offers a promising framework to unravel intricate cardiac anatomy in rodent hearts, holding significant potential for advancing our understanding of cardiac morphogenesis and pathogenesis.

著者スポットライト:げっ歯類の心臓の心筋構造を調査するためのカスタマイズされたライトシートイメージング

げっ歯類の心臓の構造を明らかにするためのライトシートイメージング

Our research aims at customizing a light-sheet imaging system to investigate the myocardial structures of the intact rodent heart at a cellular level. We have developed a workflow to explore the intact myocardium with isotropic resolution at the micron level from neonatal to adult rodent hearts. Our study fills a gap in investigating the intricate myocardial microstructures, such as trabeculation, inside the intact ventricles, with high spatial resolution.This imaging strategy provides an entry point to assess microstructure without physical slicing, leading to an enhanced understanding of cardiac development and remodeling. We will concentrate on exploring the structural changes of the myocardium in response to cardiac injury and remodeling.

LSMは、明視野および点走査技術6,8,38,39,40のような他の光学イメージング方法とは対照的に、光損傷のリスクが最小限であり、高い空間分解能、および光学切片化により、心臓研究31,32,33,34,35,36,37を促進することが実証されている</su...

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このプロトコルは、高度なライトシート顕微鏡法と適応した組織透明化法を利用して、げっ歯類の心臓の複雑な心臓構造を調査し、心臓の形態形成とリモデリングの理解に大きな可能性を秘めています。

Light-sheet microscopy (LSM) plays a pivotal role in comprehending the intricate three-dimensional (3D) structure of the heart, providing crucial insights ...

私たちの研究は、ライトシートイメージングシステムをカスタマイズして、無傷のげっ歯類の心臓の心筋構造を細胞レベルで調べることを目的としています。私たちは、新生児から成虫のげっ歯類の心臓まで、ミクロンレベルで等方性の分解能を持つ無傷の心筋を探索するワークフローを開発しました。私たちの研究は、無傷の心室内の小柱などの複雑な心筋の微細構造を高い空間分解能で調査する際のギャップを埋めます。このイメージング戦略は、物理的なスライスなしで微細構造を評価するためのエントリポイントを提供し、心臓の発達とリモデリングの理解を深めることにつながります。心臓損傷やリモデリングに応答した心筋の構造変化を探ることに集中します。

light-sheet-imaging-to-reveal-cardiac-structure-in-rodent-hearts

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Light-Sheet Imaging to Reveal Cardiac Structure in Rodent Hearts

554 ビュー.  The University of Texas at Dallas. 私たちの研究は、ライトシートイメージングシステムをカスタマイズして、無傷のげっ歯類の心臓の心筋構造を細胞レベルで調べることを目的としています。私たちは、新生児から成虫のげっ歯類の心臓まで、ミクロンレベルで等方性の分解能を持つ無傷の心筋を探索するワークフローを開発しました。私たちの研究は、無傷の心室内の小柱などの複雑な心筋の微細構?...