نعرب عن امتناننا لمجموعة الدكتور إريك أولسون في مركز UT Southwestern الطبي لمشاركتها بسخاء النماذج الحيوانية. نحن نقدر جميع التعليقات البناءة التي قدمها أعضاء حاضنة D في UT Dallas. تم دعم هذا العمل من قبل NIH R00HL148493 (Y.D.) و R01HL162635 (Y.D.) وبرنامج UT Dallas STARS (Y.D.).

الفحص المجهري للصفائح الضوئية وتنظيف الأنسجة لتصوير القلب الشامل

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

لقد وفر تقدم طرق التصوير والحساب وتنظيف الأنسجة فرصة لا مثيل لها للتحقيق على نطاق واسع في بنية القلب ووظيفته. هذا يحمل إمكانات كبيرة لتعميق فهمنا لتشكل القلب والتسبب في المرض باستخدام نموذج قلب القوارض السليم. على عكس الدراسات في الجسم الحي لقلب الزرد باستخدام نهج مماثل40</sup...

لا يزال قصور القلب هو السبب الرئيسي للوفيات في جميع أنحاء العالم ، ويرجع ذلك أساسا إلى نقص القدرة على التجدد لخلايا عضلة القلب الناضجة1. تلعب البنية المعقدة للقلب دورا حاسما في وظيفته وتوفر نظرة ثاقبة للعمليات التنموية. يعد الفهم العميق لبنية القلب أمرا ضروريا لتوضيح العمليات الأساسية لتشكل القلب وإعادة تشكيله استجابة لاحتشاء عضلة القلب. وقد أظهر التقدم الأخير أن الفئران الوليدية يمكنها استعادة وظيفة القلب بعد الإصابة، في حين تفتقر الفئران البالغة إلى هذه القدرة على التجدد2. هذا يضع أساسا للتحقيق في الإشارات المرتبطة بالتشوهات الهيكلية والوظيفية في نماذج الماوس. طرق التصوير التقليدية ، مثل الفحص المجهري متحد البؤر ، لها قيود فنية ، بما في ذلك عمق الاختراق المقيد ، ونظام المسح البطيء للنقاط ، وتلف الصور الناتج عن التعرض الطويل لضوء الليزر. هذه تعيق التصوير الشامل ثلاثي الأبعاد (3D) للقلب السليم. في هذا السياق ، يظهر المجهر ذو الألواح الضوئية (LSM) كحل قوي ، حيث يوفر مزايا التصوير عالي السرعة وتقليل تلف الصور وقدرات التقسيم البصري الاستثنائية3،4،5. الميزات الفريدة ل LSM تضعها كطريقة واعدة للتغلب على قيود التقنيات التقليدية ، مما يوفر رؤى غير مسبوقة في تطوير القلب وعمليات إعادة التصميم6،7،8.
في هذا البروتوكول ، نقدم استراتيجية تصوير تجمع بين LSM المتقدم وأساليب إزالة الأنسجةالمعدلة 9 ، مما يسمح بتصوير قلوب الفئران بأكملها دون الحاجة إلى وضع علامات محددة وتقسيم ميكانيكي. نقترح أيضا أنه يمكن تحسين تصوير LSM التقليدي من خلال تقنيات إزالة الالتفاف متعدد الرؤية10 أو تقنيات الفحص المجهري للصفائح الضوئية (ASLM)11،12،13،14،15 لتحسين الدقة المحورية. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن يؤدي دمج خياطة الصور مع أي من هذه الطرق إلى التغلب بشكل فعال على المفاضلة بين الدقة المكانية ومجال الرؤية (FOV) ، وبالتالي تطوير تصوير قلوب الفئران البالغة. يتيح دمج العديد من أساليب إزالة الأنسجة ، بما في ذلك الأساليب الكارهة للماء ، والمحبة للماء ، والقائمة على الهيدروجيل ، تغلغل أعمق للضوء لالتقاط مورفولوجيا القلب بأكمله16،17،18،19.
في حين أن طرق التطهير المتعددة متوافقة مع أنظمة LSM الحالية ، فإن الهدف هو تقليل تشتت الفوتون وتعزيز تغلغل الضوء في الأنسجة ، مثل القلب ، عن طريق استبدال الدهون بوسط يتطابق بشكل وثيق مع معامل الانكسار. تم اختيار iDISCO كممثل20,21 وتم تكييفه للتصوير الذاتي في هذا البروتوكول نظرا لمعالجته السريعة وشفافيته العالية (الشكل 1 أ). بشكل جماعي ، يوفر تكامل نهج LSM المتقدم مع تقنيات إزالة الأنسجة إطارا واعدا لكشف تشريح القلب المعقد في قلوب القوارض ، مما يحمل إمكانات كبيرة لتعزيز فهمنا لتشكل القلب والإمراض.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1% Agarose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low melting point agarose</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>16520050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals for tissue clearing&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-Amino-1,3,3-trimethylcyclohexanemethylamine, mixture of cis and trans</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>118184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D.E.R.&#8482; 332</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>31185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D.E.R.&#8482; 736</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>31191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dibenzyl ether (DBE)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>33630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane (DCM)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>270997</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent beads</td>
			<td>Spherotech</td>
			<td>FP-0556-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide (H2O2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>216736</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>439193</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>47392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>79383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software and algorithms</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amira</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>2021.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BigStitcher</td>
			<td>H&#246;rl et al.22</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji-ImageJ</td>
			<td>Schindelin et al.20</td>
			<td>1.54f</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCImage Live</td>
			<td>Hamamatsu Photonics</td>
			<td>4.6.1.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabVIEW</td>
			<td>National Instruments Corporation</td>
			<td>2017 SP1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Key components of the customized light-sheet system</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.63 - 6.3X Zoom body</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>MVX-ZB10&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Illumination objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRH00105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X detection objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>MV PLAPO 1X/0.25&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>473nm DPSS Laser</td>
			<td>Laserglow Technologies</td>
			<td>LRS-0473-PFM-00100-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>532nm DPSS laser</td>
			<td>Laserglow Technologies</td>
			<td>LRS-0532-PFM-00100-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>589&#8201;nm DPSS laser</td>
			<td>Laserglow Technologies</td>
			<td>LRS-0589-GFF-00100-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BNC connector</td>
			<td>National Instrument</td>
			<td>BNC-2110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cylindrical lens</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>ACY254-050-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC-Motor Controller, 4 axes</td>
			<td>Physik Instrumente</td>
			<td>C-884.4DC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ETL</td>
			<td>Optotune</td>
			<td>EL-16-40-TC-VIS-5D-1-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ETL Cable</td>
			<td>Optotune</td>
			<td>CAB-6-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ETL Lens Driver</td>
			<td>Optotune</td>
			<td>EL-E-4i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET525/30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET585-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET645-75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter wheel&#160;</td>
			<td>Shutter Instrument</td>
			<td>LAMBDA 10-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized translation stage</td>
			<td>Physik Instrumente</td>
			<td>L-406.20DG10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized translation stage</td>
			<td>Physik Instrumente</td>
			<td>L-406.40DG10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized translation stage</td>
			<td>Physik Instrumente</td>
			<td>M-403.4PD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NI multifunction I/O</td>
			<td>National Instrument</td>
			<td>PCIe-6363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sCMOS camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C13440-20CU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stepper motor</td>
			<td>Pololu</td>
			<td>1474</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube lens</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>MVX-TLU</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

light-sheet imaging to reveal cardiac structure in rodent hearts

يلعب المجهر ذو الصفيحة الضوئية (LSM) دورا محوريا في فهم البنية المعقدة ثلاثية الأبعاد (3D) للقلب ، مما يوفر رؤى حاسمة في فسيولوجيا القلب الأساسية والاستجابات المرضية. نتعمق هنا في تطوير وتنفيذ تقنية LSM لتوضيح البنية الدقيقة للقلب في نماذج الفئران. تدمج المنهجية نظام LSM المخصص مع تقنيات إزالة الأنسجة ، مما يخفف من تشتت الضوء داخل أنسجة القلب للتصوير الحجمي. يسمح الجمع بين LSM التقليدي مع خياطة الصور وطرق إزالة الالتفاف متعددة الرؤية بالتقاط القلب بأكمله. لمعالجة المفاضلة المتأصلة بين الدقة المحورية ومجال الرؤية (FOV) ، نقدم أيضا طريقة مجهر الورقة الضوئية (ASLM) التي اجتاحتها محوريا لتقليل الضوء خارج التركيز البؤري وإضاءة القلب بشكل موحد عبر اتجاه الانتشار. في غضون ذلك ، تعمل طرق إزالة الأنسجة مثل iDISCO على تعزيز تغلغل الضوء ، مما يسهل تصور الهياكل العميقة وضمان فحص شامل لعضلة القلب في جميع أنحاء القلب بأكمله. يقدم الجمع بين LSM المقترح وطرق إزالة الأنسجة منصة واعدة للباحثين في حل الهياكل القلبية في قلوب القوارض ، مما يحمل إمكانات كبيرة لفهم تشكل القلب وإعادة تشكيله.

Heart failure remains the leading cause of mortality worldwide, primarily due to the lack of regenerative capacity of mature cardiomyocytes1. The intricate architecture of the heart plays a crucial role in its function and provides insights into developmental processes. A profound understanding of cardiac structure is essential for elucidating the fundamental processes of cardiac morphogenesis and remodeling in response to myocardial infarction. Recent progress has demonstrated that neonatal mice can restore cardiac function following injury, while adult mice lack such regenerative capacity2. This establishes a foundation for investigating cues associated with structural and functional abnormalities in mouse models. Traditional imaging methods, such as confocal microscopy, have technical limitations, including restricted penetration depth, slow point-scanning scheme, and photo damage from prolonged exposure to laser light. These hinder comprehensive three-dimensional (3D) imaging of the intact heart. In this context, light-sheet microscopy (LSM) emerges as a powerful solution, offering the advantages of high-speed imaging, reduced photo damage, and exceptional optical sectioning capabilities3,4,5. The unique features of LSM position it as a promising method to overcome the limitations of conventional techniques, providing unprecedented insights into cardiac development and remodeling processes6,7,8.
In this protocol, we introduce an imaging strategy that combines advanced LSM with adapted tissue clearing approaches9, allowing for the imaging of entire mouse hearts without the need for specific labeling and mechanical sectioning. We further propose that conventional LSM imaging can be enhanced through multiview deconvolution10 or axially swept light-sheet microscopy (ASLM) techniques11,12,13,14,15 to improve axial resolution. Additionally, the integration of image stitching with either of these methods can effectively overcome the trade-off between spatial resolution and field of view (FOV), thereby advancing the imaging of adult mouse hearts. The incorporation of numerous tissue clearing approaches, including hydrophobic, hydrophilic, and hydrogel-based methods, enables deeper light penetration for capturing the morphology of the entire heart16,17,18,19.
While multiple clearing methods are compatible with current LSM systems, the goal is to minimize photon scattering and enhance light penetration in tissues, like the heart, by replacing lipids with a medium that closely matches its refractive index. iDISCO was chosen as the representative20,21 and adapted for autofluorescence imaging in this protocol due to its rapid processing and high transparency (Figure 1A). Collectively, the integration of the advanced LSM approach with tissue clearing techniques offers a promising framework to unravel intricate cardiac anatomy in rodent hearts, holding significant potential for advancing our understanding of cardiac morphogenesis and pathogenesis.

تسليط الضوء على المؤلف: تصوير ورقة الضوء المخصصة للتحقيق في هياكل عضلة القلب في قلوب القوارض

التصوير بالضوء للكشف عن بنية القلب في قلوب القوارض

Our research aims at customizing a light-sheet imaging system to investigate the myocardial structures of the intact rodent heart at a cellular level. We have developed a workflow to explore the intact myocardium with isotropic resolution at the micron level from neonatal to adult rodent hearts. Our study fills a gap in investigating the intricate myocardial microstructures, such as trabeculation, inside the intact ventricles, with high spatial resolution.This imaging strategy provides an entry point to assess microstructure without physical slicing, leading to an enhanced understanding of cardiac development and remodeling. We will concentrate on exploring the structural changes of the myocardium in response to cardiac injury and remodeling.

ثبت أن LSM يعزز دراسات القلب31،32،33،34،35،36،37 بسبب الحد الأدنى من مخاطر تلف الصور ، والدقة المكانية العالية ، والتقسيم البصري على عكس طرق التصوير البصري الأخرى مثل ت...

Read this Scientific Article Protocol about Author Spotlight: Customized Light-Sheet Imaging for Investigating Myocardial Structures in Rodent Hearts at JoVE.com

يستخدم البروتوكول الفحص المجهري المتقدم للصفائح الضوئية جنبا إلى جنب مع طرق إزالة الأنسجة المكيفة للتحقيق في الهياكل القلبية المعقدة في قلوب القوارض ، مما يحمل إمكانات كبيرة لفهم تشكل القلب وإعادة تشكيله.

Light-sheet microscopy (LSM) plays a pivotal role in comprehending the intricate three-dimensional (3D) structure of the heart, providing crucial insights ...

يهدف بحثنا إلى تخصيص نظام تصوير ورقة ضوئية للتحقيق في هياكل عضلة القلب لقلب القوارض السليم على المستوى الخلوي. لقد قمنا بتطوير سير عمل لاستكشاف عضلة القلب السليمة بدقة الخواص على مستوى الميكرون من قلوب القوارض حديثي الولادة إلى قلوب القوارض البالغة. تملأ دراستنا فجوة في التحقيق في الهياكل المجهرية المعقدة لعضلة القلب ، مثل التربيق ، داخل البطينين السليمين ، بدقة مكانية عالية.توفر استراتيجية التصوير هذه نقطة دخول لتقييم البنية المجهرية دون تقطيع مادي ، مما يؤدي إلى فهم معزز لتطور القلب وإعادة تشكيله. سنركز على استكشاف التغيرات الهيكلية لعضلة القلب استجابة لإصابة القلب وإعادة التصميم.

light-sheet-imaging-to-reveal-cardiac-structure-in-rodent-hearts

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Light-Sheet Imaging to Reveal Cardiac Structure in Rodent Hearts

582 Views.  The University of Texas at Dallas. يهدف بحثنا إلى تخصيص نظام تصوير ورقة ضوئية للتحقيق في هياكل عضلة القلب لقلب القوارض السليم على المستوى الخلوي. لقد قمنا بتطوير سير عمل لاستكشاف عضلة القلب السليمة بدقة الخواص على مستوى الميكرون من قلوب القوارض حديثي الولادة إلى قلوب القوارض البالغة. تملأ دراستنا فجوة في ا?...

Video: تسليط الضوء على المؤلف: تصوير ورقة الضوء المخصصة للتحقيق في هياكل عضلة القلب في قلوب القوارض

Light-sheet microscopy (LSM) plays a pivotal role in comprehending the intricate three-dimensional (3D) structure of the heart, providing crucial insights into fundamental cardiac physiology and pathologic responses. We hereby delve into the development and implementation of the LSM technique to elucidate the micro-architecture of the heart in mouse models. The methodology integrates a customized LSM system with tissue clearing techniques, mitigating light scattering within cardiac tissues for volumetric imaging. The combination of conventional LSM with image stitching and multiview deconvolution approaches allows for the capture of the entire heart. To address the inherent trade-off between axial resolution and field of view (FOV), we further introduce an axially swept light-sheet microscopy (ASLM) method to minimize out-of-focus light and uniformly illuminate the heart across the propagation direction. In the meanwhile, tissue clearing methods such as iDISCO enhance light penetration, facilitating the visualization of deep structures and ensuring a comprehensive examination of the myocardium throughout the entire heart. The combination of the proposed LSM and tissue clearing methods presents a promising platform for researchers in resolving cardiac structures in rodent hearts, holding great potential for the understanding of cardiac morphogenesis and remodeling.

The protocol utilizes advanced light-sheet microscopy along with adapted tissue clearing methods to investigate intricate cardiac structures in rodent hearts, holding great potential for the understanding of cardiac morphogenesis and remodeling.