Nous remercions tout particulièrement les anciens gardiens de B. coprophila (Jacob E. Bliss, Paula Bonazinga, Anne W. Kerrebrock, Ingrid M. Mercer, Heidi S. Smith) et le personnel de recherche (en particulier Robert Baird, Michael S. Foulk, Donna Kubai, John M. Urban, Yutaka Yamamoto) pour avoir peaufiné les protocoles d’élevage. Les premières instructions sur les soins à donner à B. coprophila ont été fournies par Helen V. Crouse, Natalia Gabrusewycz-Garcia, Reba M. Goodman, Charles W. Metz et Ellen Rasch. Avec gratitude à Yukiko Yamashita et Anne W. Kerrebrock pour avoir pris en charge le centre boursier Bradysia (Sciara). Nous remercions les personnes suivantes pour leur préparation utile des figures : Brian Wiegmann (figure 1), John M. Urban (figure 4 , panneau supérieur), Laura Ross (figure 4 , panneau inférieur), Yutaka Yamamoto (figure 5 , panneau gauche), Leo Kadota (figure 7 et figure 8). Un grand merci à Ava Filiss et au laboratoire multidisciplinaire de l’Université Brown pour leur aide en matière de photographie et de tournage. Merci à Robert Baird pour ses commentaires sur ce manuscrit. Nos recherches et notre entretien de B. coprophila ont été soutenus par les NIH et la NSF, y compris le soutien le plus récent des NIH GM121455 à S.A.G. De plus amples détails sur B. coprophila sont disponibles sur les sites Web du Centre de stockage Bradysia (Sciara) (https://sites.brown.edu/sciara/ et https://sciara.wi.mit.edu) qui sont actuellement en cours de construction.

&lt;i&gt;Bradysia coprophila&lt;/i&gt; Lab Protocols and Chromosomal Research

L’auteur n’a aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Les protocoles présentés ici pour l’élevage de B. coprophila seront utiles aux scientifiques qui souhaitent élever cet organisme dans leurs laboratoires pour des expériences visant à approfondir ses caractéristiques biologiques uniques. La description initiale de la méthode d’alimentation à l’aide de levures et de poudre de champignons saupoudrées sur une base de gélose pour maintenir B. coprophila29 a été utilisée au laboratoire de Metz pour élever 14 espèces différentes de mouches Sciarides5. Par la suite, il a été observé que l’ajout de poudre d’ortie et/ou d’épinards augmentait encore la vitalité de B. coprophila (Gabrusewycz-Garcia, communication personnelle). Ces méthodes ont permis de maintenir des espèces apparentées de la famille des Sciaridae, notamment Bradysia impatiens et Lycoriella ingenua qui sont actuellement en culture (Robert Baird, communication personnelle).
D’autres méthodes (telles que les méthodes d’alimentation alternatives décrites ci-dessous) ont été essayées pour élever B. coprophila, mais les protocoles décrits ici ont été optimisés pour avoir le rapport le plus favorable de larves par surface de gélose afin d’obtenir les adultes gras les plus fertiles et de minimiser la croissance de moisissures. Pour passer à l’échelle, l’accouplement de masse peut être effectué dans des flacons en verre, comme décrit dans le protocole 2 ci-dessus. Alternativement, quelques (2-4) femelles adultes peuvent être placées ensemble avec deux fois plus de mâles adultes dans un flacon tel que celui utilisé pour élever la drosophile (bouteille jetable de 6 oz = 177,4 ml en polypropylène Drosophila à fond carré). Dans les deux cas, le chercheur doit être pleinement convaincu que le flacon ne contient que toutes les mères productrices ou toutes les mères productrices mâles.
Ne nourrissez que les larves car les pupes et les adultes ne mangent pas. Ne donnez pas le flacon si les larves se sont transformées en pupes (un signe de cela est lorsque les premières mouches adultes à émerger tôt apparaissent). Une fois que les adultes sont fermés, placez les flacons dans un incubateur plus froid (p. ex. 16 °C) s’il y en a, car cela permettra aux adultes de vivre plus longtemps. Nourrissez les larves trois fois par semaine (p. ex., lundi, mercredi et vendredi), en augmentant la quantité de nourriture donnée par flacon à mesure que les larves vieillissent. Nourrissez généreusement et vous serez récompensé par des adultes gras et fertiles. Cependant, si vous donnez trop, de la moisissure blanche apparaîtra et c’est un signe qu’il faut réduire la quantité de nourriture que vous déposez dans un flacon. De plus, si vous nourrissez trop, un épais tampon de nourriture se développera sur le dessus de la gélose et rendra plus difficile l’émergence des adultes (vous pouvez retirer le tampon avec une pince, mais veillez à ne pas retirer les larves avec le tampon - il est préférable de ne pas avoir à le faire du tout). Les flacons contenant peu de larves (marqués « peu ») ont besoin de moins de nourriture. Si vous nourrissez trop peu, les larves grimperont sur les parois de la fiole à la recherche de nourriture. Les larves sous-alimentées donnent de petits adultes moins fertiles.
Méthodes d’alimentation alternatives Diverses méthodes ont été tentées pour nourrir les larves une seule fois au stade larvaire plutôt que 3 fois par semaine. B. coprophila ne se développera pas sur des aliments de type drosophile . John Urban (communication personnelle) a essayé de mélanger de la nourriture de B. coprophila avec l’agar, mais trop de moisissure s’est développée. Il a découvert que l’ajout de deux inhibiteurs de moisissure (tégosept et acide propionique) en combinaison et séparément, en essayant plusieurs concentrations différentes, était tous toxiques pour B. coprophila à des niveaux qui inhibent la moisissure. La gélose doit avoir un pH de 6-7 (neutre) car B. coprophila tombe malade à un pH acide (comme avec l’acide propianique). Alternativement, pour éviter de se nourrir trois fois par semaine, il a essayé d’utiliser une spatule ou une seringue sans aiguille pour distribuer une pâte de levure épaisse (levure sèche active Red Star mélangée à un peu d’eau distillée pour l’humidifier) comme une cuillerée sur la gélose dans chaque flacon une semaine après l’accouplement (c’est-à-dire à peu près au moment où les larves commenceront à émerger).
Une autre méthode pour éviter de nourrir trois fois par semaine consiste à ajouter une culture vivante de champignons à chaque flacon. Bath et Sponsler37 ont rapporté qu’une surface de gélose oblique avec du milieu de Sabouraud devrait être striée d’une culture fongique des genres Chaetoconidia (le meilleur) ou bien Baplosporangia ou Xllescheria. Le champignon a été cultivé de plusieurs jours à une semaine avant l’introduction de B. coprophilara . Aucune alimentation n’a été nécessaire après cela. Une variante de cette méthode a également été employée par Ellen Rasch (communication personnelle). Dans nos mains, les flacons étaient trop humides avec cette méthode et les larves se sont noyées, mais elle a pu être réessayée pour optimiser le nombre de larves par rapport aux flacons avec des champignons vivants.
Arthur Forer (communication personnelle) a eu un certain succès dans l’élevage de B. coprophila de la même manière que les tipules38. Avec cette approche, les pupes ont été élevées sur du papier mâché humide. Par la suite, les adultes ont été accouplés et les œufs ont été déposés sur du papier mâché frais et humide. Les larves résultantes ont été conservées sur du papier mâché dans des boîtes de Pétri et nourries avec des feuilles d’ortie en poudre deux fois par semaine. Les pupes ont été placées dans une cage pour répéter le cycle.
Yukiko Yamashita (communication personnelle) a essayé sans succès d’élever B. coprophila sur le sol, imitant les conditions où ils se trouvent dans la nature dans les plantes en pot et les serres à forte humidité. Cependant, la moisissure peut devenir un problème lorsque le taux d’humidité est élevé. Néanmoins, un sol humide a été utilisé avec succès pour élever des larves de Pseudolycoriella (anciennement Bradysia) hygida dans des boîtes en plastique avec un sol humide ; ils sont nourris avec des feuilles d’Ilex paraguariensis décomposées, complétées à la fin de la vie larvaire avec 1,2% d’extrait de levure, 1,4% d’amidon de maïs, 0,8% de farine d’avoine, 1,2% d’agar12. De même, le sol humide peut être remplacé par de la mousse de tourbe humide avec des haricots rouges broyés pour élever des mouches Sciarides39,40.
D’autres méthodes encore ont été employées pour maintenir les cultures de Bradysia en laboratoire : (i) pomme de terre autoclave à laquelle on ajoute de la levure et de l’engrais pour sang séché41 ; ii) fumier42, 43, 44 auquel on peut ajouter du sang séché45 ; iii) récipients en plastique avec des cotons et des essuie-tout humides avec du soja moulu46.
Acariens Les acariens peuvent être transférés de la drosophile à B. coprophila. Pour minimiser cela, il est préférable de garder B. coprophila dans un incubateur ou une pièce séparés, pas à proximité des stocks de drosophiles . De plus, effectuez tout travail d’entretien de B. coprophila tôt dans la journée avant de manipuler la drosophile. Les acariens peuvent également être transférés à B. coprophila à partir de plantes d’intérieur, alors ne gardez pas les plantes dans la même pièce que B. coprophila. Si les acariens envahissent les flacons, ils peuvent être vus comme de petits organismes sphériques blancs rampant sur le corps de B. coprophila. Les traitements chimiques qui détruisent les acariens chez la drosophile ne peuvent pas être utilisés pour B. coprophila car les produits chimiques tuent B. coprophila (B. coprophila est également sensible aux vapeurs organiques telles que le phénol). Le seul traitement pour débarrasser les stocks d’acariens de B. coprophila consiste à recueillir manuellement les embryons sur une plaque de gélose, à examiner chacun d’eux pour s’assurer qu’il n’y en a pas, puis à les transférer dans des flacons de gélose fraîche à l’aide d’un pinceau fin. Les bouchons de gaze remplis de coton et les flacons en mousse d’acétate de cellulose (comme ceux utilisés pour les flacons en polypropylène de drosophile ) aident tous deux à empêcher l’entrée d’acariens dans les flacons.
Utilité des protocoles d’élevage Les protocoles décrits ici permettront à la communauté croissante de scientifiques d’élever B. coprophila en tant qu’organisme modèle nouveau/ancien afin d’étudier ses caractéristiques biologiques uniques. De nouveaux groupes de laboratoire sont encouragés à se joindre à la communauté croissante pour maintenir et étudier les caractéristiques biologiques uniques de Bradysia (Sciara).

Une compréhension complète des principes biologiques nécessite l’étude de nombreux organismes divers couvrant l’arbre de la vie. Bien qu’un large éventail d’organismes ait été décrit jusqu’à la fin duXIXe siècle, au milieu duXXe siècle, les études expérimentales se sont limitées à une poignée de moins d’une douzaine d’organismes modèles. Avec l’avènement de l’ère génomique et l’objectif de séquencer les génomes de toutes les espèces dans l’Arbre de la Vie1, nous sommes maintenant en mesure d’élargir les types d’organismes utilisés pour les expériences en laboratoire et de tirer parti de leur diversité. Une telle expansion d’organismes modèles émergents pour les expériences a une condition préalable à leur maintien en laboratoire. Ici, des protocoles sont décrits pour l’élevage d’un tel organisme modèle émergent, nouveau/ancien.
La majorité de la vie animale sur Terre est représentée par quatre super-radiations d’insectes2. Parmi les insectes, il existe environ 158 000 espèces de diptères (mouches vraies)3, avec environ 3000 espèces dans la famille des Sciaridae (mouches du terreau noir)4. La drosophile est la plus étudiée des mouches diptères. La mouche diptère inférieure (Nematocera), Bradysia (anciennement appelée Sciara) coprophila, a divergé il y a 200 millions d’années de la drosophile, qui est une mouche « diptère supérieur » (Brachycera). Par conséquent, B. coprophila est dans une position taxonomique favorable pour les études comparatives avec D. melanogaster (Figure 1). De plus, B. coprophila possède de nombreuses caractéristiques biologiques uniques qui méritent d’être étudiées à part entière 5,6,7. Beaucoup de ces caractéristiques désobéissent à la règle de constance de l’ADN dans laquelle toutes les cellules d’un organisme ont le même contenu en ADN. Chez B. coprophila, (i) le génome paternel est éliminé sur un fuseau monopolaire dans la méiose I mâle ; (ii) il n’y a pas de disjonction de la dyade X dans la méiose II masculine ; (iii) les chromosomes (L) limités à la lignée germinale sont éliminés du soma ; et (iv) un ou deux chromosomes X sont éliminés dans l’embryon précoce en fonction du sexe de l’individu. L’empreinte chromosomique permettant de distinguer les homologues maternels des homologues paternels a été découverte pour la première fois chez B. coprophila et est à l’origine de bon nombre de ces événements d’élimination chromosomique. En plus de l’élimination des chromosomes, un autre contournement de la constance de l’ADN se produit via l’amplification de l’ADN régulée par le développement et spécifique au locus au niveau des loci de la bouffée d’ADN dans les chromosomes polytènes des glandes salivaires larvaires. L’étude de ces caractéristiques uniques nécessite l’entretien en laboratoire de B. coprophila ; Les détails de son élevage sont présentés ici pour faciliter ces études.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66751/66751fig01v3.jpg"> Figure 1 : Phylogénie de Bradysia (Sciara) coprophila. Les organismes modèles populaires sont indiqués en bleu et leur ordre taxonomique en rouge. Bradysia et d’autres mouches sciarides ainsi que les moustiques sont des mouches diptères inférieures (anciennement sous-ordre des Nematocera), tandis que les espèces de drosophiles sont des mouches diptères supérieures (sous-ordre : Brachysera). L’information sur le côté gauche de la figure provient de Misof et al.33 ; les informations du côté droit proviennent de Bertone et al.34 et de Wiegmann et al.2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66751/66751fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Auparavant, le genre Sciara comptait le plus grand nombre (700) d’espèces pour tous les eucaryotes, ce qui a incité Steffan à les subdiviseren 8. Par la suite, Shin a proposé que la famille des Sciaridae soit subdivisée en la sous-famille des Sciarinae (avec six genres dont Sciara, Trichosia et Leptosciarella), la sous-famille des Megalosphyinae (y compris le genre Bradysia) et trois autres groupes (y compris Pseudolycoriella)9. La phylogénie des Sciaridae a été étudiée plus avant par plusieurs groupes ces dernières années 9,10,11. Au cours des dernières décennies, les noms de nombreux organismes de la famille des Sciaridae ont changé12. Bien que la majeure partie de la littérature couvrant plus d’un siècle fasse référence à l’organisme que nous étudions sous le nom de Sciara coprophila, son nom taxonomique actuel est maintenant Bradysia coprophila (syn. Bradysia tilicola et autres synonymes)10. Ils se trouvent dans le monde entier et sont communément appelés moucherons fongiques car ils mangent des champignons et d’autres champignons. Ils ont été décrits pour la première fois en 1804 par Meigen13 en Europe, puis par Johannsen 14,15 en Amérique du Nord. B. coprophila a été récolté au laboratoire de Cold Spring Harbor et des stocks de laboratoire ont été établis par Charles Metz au début des années 1900 alors qu’il était étudiant diplômé à l’Université Columbia avec Thomas Hunt Morgan. Ainsi, les stocks actuels reflètent un siècle de consanguinité. De même, la biologie de B. coprophila a été élucidée par des décennies d’études cytogénétiques menées par Helen Crouse (qui a fait son travail de doctorat avec Barbara McClintock).
Dans les années 1930, Bradysia (Sciara) a concurrencé Drosophila melanogaster en tant que système modèle pour les études génétiques. Malgré ses nombreuses caractéristiques biologiques uniques, B. coprophila a été éclipsé par D. melanogaster en tant qu’organisme modèle populaire, car les mutations phénotypiques induites par les radiations étaient nécessaires pour les études génétiques et étaient plus faciles à réaliser dans ces dernières, même si B. coprophila n’est que légèrement plus résistant à l’irradiation gamma que D. melanogaster16. À l’ère moderne de la génomique, ce n’est plus une préoccupation. Étant donné que la séquencegénomique 17,18,19 (Urban, Gerbi et Spradling, données non présentées) et les méthodes de transformation 20,21 (Yamamoto et Gerbi, données non présentées) pour B. coprophila sont récemment devenues disponibles, le moment est maintenant venu de l’utiliser comme un système modèle émergent nouveau/ancien, comme le montre la communauté croissante de scientifiques qui l’ont adopté pour leurs recherches. Cet article décrit les procédures d’entretien de son laboratoire.
B. coprophila n’a pas de chromosome Y et le sexe de la progéniture est déterminé par la mère. Les femelles qui ont le chromosome X' (« X-prime ») avec une longue inversion paracentrique n’auront que des filles, tandis que les femelles qui sont homozygotes pour le chromosome X standard (non inversé) n’auront que des fils5 (Figure 2). Des informations sur la séquence sont disponibles pour le chromosome19 de l’X, mais le mécanisme moléculaire reste à élucider sur la façon dont le chromosome X détermine que la progéniture sera femelle. Les mâles n’ont jamais le chromosome X', et après fécondation, les femelles sont X’X (hétérozygote pour le X') ou XX. Les femelles X’X adultes se distinguent des femelles XX par des marqueurs phénotypiques sur l’aile (Figure 3). Les femelles X’X (qui n’auront que des filles) sont reconnaissables au marqueur dominant de l’aile ondulée (W) sur le X' (comme dans la crosse HoLo2)22. Alternativement, les femelles XX (qui n’auront que des fils) peuvent être reconnues par le marqueur d’aile petite (p) récessive sur le X comme dans la crosse91S 23. Dans ce cas, les femelles X’Xp auront des ailes pleine longueur (pas petites) et n’auront que des filles. La crosse 6980 porte un marqueur récessif sur le chromosome X pour les veines gonflées (sw)24, ainsi que le marqueur dominant ondulé sur le X', permettant deux marqueurs pour la sélection pour les croisements. Le degré d’expression de Wavy peut varier et semble plus faible dans les flacons surpeuplés où la nourriture est limitative ou si la température devient trop chaude. Le phénotype de l’aile ondulée est exceptionnellement fort si les larves sont gardées dans la chambre froide (4°-8 °C) au lieu des 21 °C habituels. Bien que le marqueur récessif de la petite aile ne soit pas variable et soit très facile à identifier, les souches 91S sont moins utilisées car elles sont moins saines que les souches HoLo2. Les schémas d’accouplement de B. coprophila sont présentés ici (figure 2) et décrits en détail pour les stocks HoLo2, 7298 et W14 (fichier supplémentaire 1), le stock 91S (fichier supplémentaire 1), le stock 6980 (fichier supplémentaire 1) et les stocks de translocation (fichier supplémentaire 1). Les stocks de translocation n’existent plus ; il s’agissait de translocations réciproques d’hétérochromomères (H1, H2 et H3) sur le bras court du X qui contient les gènes de l’ARN ribosomique 25,26,27.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66751/66751fig02.jpg"> Figure 2 : Schéma d’accouplement de B. coprophila. Cet organisme n’a pas de chromosome Y (le soma mâle a un seul X) ; Les mères déterminent le sexe de leur progéniture. Les XX mères n’ont que des fils et les femmes X’X n’ont que des filles. Le chromosome X a une longue inversion paracentrique par rapport au chromosome X. La lignée paternelle ou maternelle du chromosome X (ou X') est indiquée respectivement par du bleu ou du rouge dans cette figure. Les spermatozoïdes sont haploïdes pour les autosomes mais ont deux copies du chromosome X en raison de la non-disjonction dans la méiose II. La lignée somatique des embryons précoces élimine une ou deux copies du X d’origine paternelle, qu’ils soient respectivement féminins ou masculins. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66751/66751fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66751/66751fig03.jpg"> Figure 3 : Phénotypes des ailes de B. coprophila. Les mouches femelles adultes présentent différents phénotypes d’ailes : (A) aile droite (XX), (B) aile ondulée (X’WX), (C) aile ondulée extrême (X’WX) phénotype qui a un aspect ratatiné après avoir stocké les larves dans le room froid, (D) petite aile (XpXp) qui ressemble à un vestigial, (E) aile droite avec type sauvage (XX) et veines non gonflées, (F) aile droite avec des veines enflées (XswXsw) où de petites bulles (flèches noires) apparaissent sur le bord supérieur de l’aile et/ou près de l’extrémité des deux ailes, (G) exemple extrême de gonflement où une cloque (flèche blanche) apparaît sur une ou les deux ailes. Les mâles n’ont pas le chromosome X' et n’auront donc jamais d’ailes ondulées, mais ils ont des ailes petites ou gonflées dans la crosse 91S ou la crosse 6980, respectivement. Barre d’échelle = 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66751/66751fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
L’objectif de la maintenance du stock est d’effectuer des croisements où la moitié des croisements proviennent de mères productrices de femelles et l’autre moitié de mères productrices de mâles afin d’avoir un nombre égal d’adultes femelles et mâles dans la génération suivante pour les croisements ultérieurs. Cependant, cela implique également une planification, car le cycle de vie des mâles est plus court que celui des femelles et les mâles adultes émergent jusqu’à une semaine avant les femelles adultes. La nature s’accommode de cette asynchronie entre les sexes en faisant émerger les embryons mâles sous forme de larves 1 à 2 jours après les larves femelles d’un croisement à la même date. Cependant, pour s’assurer que les adultes mâles et femelles sont disponibles en même temps pour les croisements en laboratoire, le développement des femelles peut être quelque peu accéléré en laissant les flacons contenant des larves femelles à température ambiante plutôt qu’à 21 °C ou en plaçant les flacons contenant des larves mâles à des températures légèrement plus fraîches (p. ex. 16 °C). Une autre voie plus infaillible est de faire des croisements avec des mères productrices le lundi et des croisements avec des mères productrices mâles le vendredi de la même semaine. La voie la plus simple, c’est celle que nous utilisons, est d’effectuer des croisements avec des mères productrices et des mères productrices mâles le même jour chaque semaine et d’effectuer des croisements ce jour-là chaque semaine consécutive. Dans cette approche, les femelles adultes issues d’un croisement à la semaine 1 peuvent être accouplées avec des mâles adultes issus d’un croisement à la semaine 2.
Le cycle de vie de la femelle B. coprophila est de 5 semaines lorsqu’elle est élevée à 21 °C (tableau 1). La durée de leur cycle de vie est un peu plus longue à des températures plus fraîches ou s’ils sont sous-alimentés. Le cycle de vie des mâles B. coprophila est de ~4 à 4,5 semaines puisqu’ils se nymphosent 0,5 à 1 semaine avant les femelles. L’extrémité de chaque stade larvaire est marquée par l’excrétion de la cuticule, qui est déclenchée par une explosion du niveau de l’hormone stéroïde ecdysone. Contrairement à D. melanogaster, qui a trois stades larvaires, B. coprophila a quatre stades larvaires.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Stade de développement</td>
			<td>Jours après l’accouplement (dpm)</td>
			<td>Durée de l’étape (jours)</td>
		</tr><tr><td>Oeuf pondu</td>
			<td>1-2</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Embryon</td>
			<td>1-2 à 7-8</td>
			<td>~7 jours</td>
		</tr><tr><td>Larve</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Stades larvaires 1, 2 et 3</td>
			<td>7-8 à 16-19</td>
			<td>~10</td>
		</tr><tr><td>4e stade larvaire pré-oculaire</td>
			<td>16-19 au 21-24</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>4e stade larvaire du pronostic larvaire</td>
			<td>21-24 au 25-28</td>
			<td>4</td>
		</tr><tr><td>Chrysalide</td>
			<td>25-28 à 30-33</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>Adulte</td>
			<td colspan="2">vit 1 à 2 jours à 21 °C s’il est accouplé ou vit 2 à 3 semaines à 16 °C s’il n’est pas accouplé.</td>
		</tr></tbody></table>Tableau 1 : Cycle de vie de la femelle B. coprophila à 21 °C.
B. coprophila peut être conservé n’importe où dans la plage de 15 °C à 25 °C, le développement progressant plus lentement à des températures plus froides. Cet insecte préfère un environnement humide (se trouvant dans le sol des plantes d’intérieur ou des plates-bandes de champignons), nous gardons donc un bécher avec de l’eau déminéralisée dans l’incubateur. B. coprophila peut être conservé à température ambiante dans une boîte à pain en métal avec un couvercle lâche et contenant un bécher d’eau, mais ils subissent un choc thermique à 37 °C28, ce qui est un danger dans les climats chauds. Michael Ashburner et d’autres ont essayé, sans grand succès, de stocker D. melanogaster au froid pour réduire le temps nécessaire à la tenue des stocks. En revanche, un avantage majeur de B. coprophila est que les flacons contenant des larves à un stade intermédiaire peuvent être conservés jusqu’à 3 mois sur une étagère ouverte dans la chambre froide (4-8 °C) avec un soin minimal de ne nourrir qu’une fois par mois. Ils se développent extrêmement lentement dans le froid jusqu’au stade nymphal et émergeront en adultes fertiles lorsque les flacons seront ramenés à 21 °C. On peut supposer que cela imite leur hivernage dans la nature. Ce retard de développement induit par le froid pourrait être comparable à celui observé après l’irradiation gamma de larves de B. coprophila 16 à un stade intermédiaire, mais aucun retard de développement n’est observé chez les larves de stade avancé qui ont dépassé le point de non-retour de leur progression normale du développement.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar (bacteriological)</td>
			<td>U.S. Biological</td>
			<td>A0930</td>
			<td>https://www.usbio.net;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 FlyStuff Foot Pedal</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>59-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 FlyStuff Blowgun</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>54-104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 FlyStuff UltimaterFlypad</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>59-172</td>
			<td>https://www.geneseesci.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ether fume hood</td>
			<td>Labconco&#160;</td>
			<td>3955220</td>
			<td>Sits on top of lab bench</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160; &#160;</td>
			<td>&#160; &#160;</td>
			<td>&#160; &#160;</td>
			<td>Filter replacement&#160; cat # 6961300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Food: Brewer&#8217;s Yeast Powder</td>
			<td>Solgar</td>
			<td>&#160; &#160;</td>
			<td>Obtain from Amazon or health food store</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160; &#160;</td>
			<td>&#160; &#160;</td>
			<td>&#160; &#160;</td>
			<td>https://www.solgar.com;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Food: Nettle Powder&#160; (pesticide free)</td>
			<td>Starwest Botanicals</td>
			<td>209460-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Food: Shitake Mushrooms (pesticide free)</td>
			<td>Starwest Botanicals</td>
			<td>202127-5</td>
			<td>https://www.starwest-botanicals.com;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Food: Spinach Powder ( pesticide free)</td>
			<td>Starwest Botanicals</td>
			<td>209583-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Food: Straw (pesticide free )</td>
			<td>Starwest Botanicals</td>
			<td>209465-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jar: clear glass, polypropylene lid</td>
			<td>Fisher Scientific:</td>
			<td>FB02911765</td>
			<td>73 mm dia, 89 mm ht (240 ml) 
			https://www.fishersci.com;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle Probe, wooden handle</td>
			<td>US Geo Supply Inc</td>
			<td>SKU: 4190</td>
			<td>5.75&#8221; long probe, 
			stainless steel needle 
			https://usgeosupply.com; (970)-434-3708</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vials: glass, preferred:</td>
			<td>Wilmad LabGlass</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wilmad-glass custom vials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>28-33 mm inner dia, 33 mm outer dia, 9.5 cm ht 
			Wilmad: https://www.SP-WilmadLabglass.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vials: glass (cheaper and ok)&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-339-26H</td>
			<td>29 mm outer dia, 9.5 cm h 
			&#160;https://www.fishersci.com;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vials: glass (a bit narrow)&#160;</td>
			<td>Genesee Scientific&#160;</td>
			<td>32-201</td>
			<td>24.5 mm outer dia,9.5 cm h 
			thttps://www.geneseesci.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vials: polypropylene&#160;</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>32-114</td>
			<td>28.5 mm outer dia,9.5 cm ht</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vial Plugs</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>roll of non-absorbent cotton</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-456881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cheesecloth</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-055053</td>
			<td>https://www.fishersci.com;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

laboratory maintenance of the lower dipteran fly bradysia (sciara) coprophila: a new/old emerging model organism

Les stocks de laboratoire de la mouche des diptères inférieurs, Bradysia (Sciara) coprophila, sont maintenus depuis plus d’un siècle. Les protocoles d’entretien de B. coprophila en laboratoire sont présentés ici. Ces protocoles seront utiles au nombre croissant de laboratoires qui étudient B. coprophila pour tirer parti de ses caractéristiques biologiques uniques, notamment (1) un fuseau monopolaire dans la méiose mâle I ; (2) la non-disjonction de la dyade X dans la méiose masculine II ; (3) l’empreinte chromosomique pour distinguer les homologues maternels des homologues paternels ; (4) chromosomes (L) limités par la lignée germinale ; (5) l’élimination des chromosomes (chromosomes paternels dans la méiose I masculine ; un à deux chromosomes X chez les embryons précoces ; Chromosomes L du soma chez les embryons précoces) ; (6) la détermination du sexe par la mère (il n’y a pas de chromosome Y) ; et (7) l’amplification de l’ADN régulée par le développement au niveau des loci de l’ADN dans les chromosomes polytènes des glandes salivaires larvaires. 
Il est maintenant possible d’explorer ces nombreuses caractéristiques uniques de la mécanique chromosomique en utilisant les progrès récents dans le séquençage et l’assemblage du génome de B. coprophila et le développement d’une méthodologie de transformation pour l’ingénierie génomique. La communauté scientifique croissante qui utilise B. coprophila pour la recherche bénéficiera des protocoles décrits ici pour l’accouplement des mouches (marqueurs phénotypiques pour les mères qui n’auront que des fils ou des filles uniques ; détails de l’accouplement de masse pour les expériences biochimiques), la vérification de l’éclosion des embryons, l’alimentation des larves et d’autres commentaires sur son élevage.

A complete understanding of biological principles requires the study of many diverse organisms spanning the Tree of Life. Although a broad range of organisms were described through the end of the 19th century, by the middle of the 20th century experimental studies became restricted to a handful of less than a dozen model organisms. With the advent of the genomic era and the goal to sequence genomes from all species in the Tree of Life1, we are now in a position to expand the types of organisms being used for laboratory experiments and to reap the advantage of their diversity. Such expansion of emerging model organisms for experiments has a prerequisite of being able to maintain them in the laboratory. Here, protocols are described for rearing one such emerging new/old model organism.
The majority of animal life on Earth is accounted for by four super-radiations of Insects2. Within the Insects, there are about 158,000 species of Diptera (true flies)3, with about 3000 species in the family Sciaridae (black fungus gnats)4. The fruitfly Drosophila is the most thoroughly studied of the Dipteran flies. The lower Dipteran fly (Nematocera), Bradysia (previously called Sciara) coprophila, diverged 200 million years ago from Drosophila, which is a &#34;higher Dipteran&#34; fly (Brachycera). Therefore, B. coprophila is in a favorable taxonomic position for comparative studies with D. melanogaster (Figure 1). Moreover, B. coprophila has many unique biological features that are worthy of study in their own right5,6,7. Many of these features disobey the rule of DNA constancy in which all cells of an organism have the same DNA content. In B. coprophila, (i) the paternal genome is eliminated on a monopolar spindle in male meiosis I; (ii) there is non-disjunction of the X dyad in male meiosis II; (iii) germ line-limited (L) chromosomes are eliminated from the soma; and (iv) one or two X chromosomes are eliminated in the early embryo depending on the sex of the individual. Chromosome imprinting to distinguish maternal from paternal homologs was first discovered in B. coprophila and is at play for many of these chromosome elimination events. In addition to chromosome elimination, another bypass of DNA constancy occurs via developmentally regulated, locus-specific DNA amplification at the DNA puff loci in larval salivary gland polytene chromosomes. Studies of these unique features require laboratory maintenance of B.coprophila; details of its husbandry are presented here to facilitate such studies.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66751/66751fig01v3.jpg" /> 
Figure 1: Phylogeny of Bradysia (Sciara) coprophila. Popular model organisms are indicated in blue font and their taxonomic order in red font. Bradysia and other Sciarid fungus gnats as well as mosquitoes are lower dipteran flies (formerly, suborder Nematocera), whereas Drosophila species are higher dipteran flies (suborder: Brachysera). Information on the left side of the figure is from Misof et al.33; information on the right side is from Bertone et al.34 and Wiegmann et al.2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66751/66751fig01large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
Previously, the genus Sciara had the largest number (700) of species for any eukaryote, prompting Steffan to subdivide them8. Subsequently, Shin proposed that the Sciaridae family be subdivided into the subfamily Sciarinae (with six genera including Sciara, Trichosia, and Leptosciarella), the subfamiliy Megalosphyinae (including the genus Bradysia) and three other groups (including Pseudolycoriella)9. The phylogeny of the Sciaridae has been studied further by several groups in recent years9,10,11. Over the past several decades, the names of many organisms in the Sciaridae family have changed12. Although most of the literature spanning more than a century refers to the organism that we study as Sciara coprophila, its current taxonomic name is now Bradysia coprophila (syn. Bradysia tilicola and other synonyms)10. They are found worldwide and are commonly known as fungus gnats since they eat mushrooms and other fungi. They were first described in 1804 by Meigen13 in Europe and subsequently by Johannsen14,15 in North America. B. coprophila was collected at Cold Spring Harbor Laboratory and laboratory stocks were established by Charles Metz in the early 1900s when he was a graduate student at Columbia University with Thomas Hunt Morgan. Thus, the current stocks reflect a century of inbreeding. Similarly, the biology of B. coprophila was further elucidated by decades of cytogenetic studies by Helen Crouse (who did her Ph.D. work with Barbara McClintock).
In the 1930s, Bradysia (Sciara) competed with Drosophila melanogaster as a model system for genetic studies. Despite its many unique biological features, B. coprophila was eclipsed by D. melanogaster as a popular model organism since radiation-induced phenotypic mutations were needed for genetic studies and were easier to achieve in the latter, even though B. coprophila is only slightly more resistant to gamma irradiation than D. melanogaster16. In the modern era of genomics, this is no longer a concern. Since the genome sequence17,18,19 (Urban, Gerbi, and Spradling, data not shown) and methods for transformation20,21 (Yamamoto and Gerbi, data not shown) for B. coprophila have recently become available, the time is now ripe to utilize it as a new/old emerging model system, as seen by the growing community of scientists that have adopted it for their research. This article describes procedures for its laboratory maintenance.
B. coprophila lacks a Y chromosome, and the sex of the offspring is determined by the mother. Females that have the X&#39; (&#34;X-prime&#34;) chromosome with a long paracentric inversion will have only daughters, whereas females that are homozygous for the standard (non-inverted) X chromosome will have only sons5 (Figure 2). Sequence information is available for the X&#39; chromosome19, but the molecular mechanism remains to be elucidated on how the X&#39; chromosome determines that offspring will be females. Males never have the X&#39; chromosome, and after fertilization, females are X&#39;X (heterozygous for the X&#39;) or XX. Adult X&#39;X females can be distinguished from XX females by phenotypic markers on the wing (Figure 3). X&#39;X females (who will have only daughters) can be recognized by the dominant Wavy (W) wing marker on the X&#39; (as in the HoLo2 stock)22. Alternatively, XX females (who will have only sons) can be recognized by the recessive petite (p) wing marker on the X as in the 91S stock23. In this case, X&#39;Xp females will have full-length (not petite) wings and will have only daughters. The stock 6980 carries a recessive marker on the X chromosome for swollen (sw) veins24, as well as the dominant marker Wavy on the X&#39;, allowing two markers for selection for crosses. The degree of expression of Wavy can vary and seems weaker in overcrowded vials where food is limiting or if the temperature becomes too warm. The Wavy wing phenotype is exceptionally strong if larvae are kept in the cold room (4&#176;-8 &#176;C) instead of the usual 21 &#176;C. Although the recessive petite wing marker is not variable and is very easy to identify, 91S stocks are used less frequently since they are less healthy than the HoLo2 stock. The B. coprophila mating schemes are presented here (Figure 2), and described in detail for the HoLo2, 7298, and W14 stocks (Supplemental File 1), the 91S stock (Supplemental File 1), the 6980 stock (Supplemental File 1), and the translocation stocks (Supplemental File 1). The translocation stocks are no longer extant; they were reciprocal translocations of heterochromomeres (H1, H2, and H3) on the short arm of the X that contains the ribosomal RNA genes25,26,27.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66751/66751fig02.jpg" /> 
Figure 2: Mating scheme for B. coprophila. This organism has no Y chromosome (the male soma has a single X); mothers determine the sex of their offspring. XX mothers have only sons and X&#39;X females have only daughters. The X&#39; chromosome has a long paracentric inversion when compared to the X chromosome. The paternal or maternal lineage of the X (or X&#39;) chromosome is denoted by blue or red, respectively, in this figure. Sperm are haploid for the autosomes but have two copies of the X chromosome due to non-disjunction in meiosis II. The somatic lineage of early embryos eliminates one or two copies of the paternally derived X if they will be female or male, respectively. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66751/66751fig02large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66751/66751fig03.jpg" /> 
Figure 3: Wing phenotypes of B. coprophila. Adult female flies are shown with various wing phenotypes: (A) straight-wing (XX), (B) Wavy wing (X&#39;WX), (C) extreme Wavy wing (X&#39;WX) phenotype that has a shriveled appearance after storing larvae in the cold room, (D) petite wing (XpXp) that is vestigial-like, (E) straight wing with wildtype (XX) and not swollen veins, (F) straight wing with swollen veins (XswXsw) where small bubbles (black arrows) appear on the upper edge of the wing and/or near the tip of both wings, (G) extreme example of swollen where a blister (white arrow) occurs on one or both wings. Males lack the X&#39; chromosome and therefore will never have Wavy wings, but they have petite or swollen wings in the 91S stock or 6980 stock, respectively. Scale bar = 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66751/66751fig03large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
The goal in stock maintenance is to perform crosses where half the crosses are from female-producing mothers and half the crosses from male-producing mothers to have equal numbers of female and male adults in the next generation for subsequent crosses. However, this also involves planning since the life cycle for males is shorter than for females and adult males emerge up to a week before adult females. Nature accommodates for this asynchrony between the sexes by having the male embryos emerge as larvae 1-2 days after the female larvae from a cross on the same date. However, to ensure that male and female adults are available at the same time for laboratory crosses, female development can be somewhat speeded up by leaving vials with female larvae at room temperature rather than at 21 &#176;C or placing vials with male larvae at slightly cooler temperatures (e.g., 16 &#176;C). Another route that is more foolproof is to do crosses with female-producer mothers on Monday and crosses with male-producer mothers on Friday of the same week. The easiest route, which is what we employ, is to perform crosses with female-producer and male-producer mothers on the same day each week and perform crosses on that day in each consecutive week. In that approach, adult females from a cross on week 1 can be mated with adult males that emerged from a cross on week 2.
The life cycle for female B. coprophila is 5 weeks when raised at 21 &#176;C (Table 1). The length of their life cycle is somewhat longer at cooler temperatures or if they are underfed. The life cycle of male B. coprophila is ~4-4.5 weeks since they pupate 0.5-1 week before females. The end of each larval instar is marked by the shedding of the cuticle, which is triggered by a burst in the level of the steroid hormone ecdysone. Unlike D. melanogaster, which has three larval instars, B. coprophila has four larval instars.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Developmental Stage</td>
			<td>Days post mating (dpm)</td>
			<td>Length of stage (days)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg laid</td>
			<td>1-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo</td>
			<td>1-2 to 7-8</td>
			<td>~7 days</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Larva&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Larval instars 1, 2, and 3</td>
			<td>7-8 to 16-19</td>
			<td>~10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4th larval instar pre-eyespot</td>
			<td>16-19 to 21-24</td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4th larval instar eye-spot stage</td>
			<td>21-24 to 25-28</td>
			<td>4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pupa&#160;</td>
			<td>25-28 to 30-33</td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adult</td>
			<td colspan="2">lives 1-2 days at 21 &#176;C if mated or lives 2-3 weeks at 16 &#176;C if not mated.&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Table 1: Life cycle of female B. coprophila at 21 &#176;C.
B. coprophila can be kept anywhere in the range of 15 &#176;C-25 &#176;C, with development progressing more slowly at cooler temperatures. This insect prefers a humid environment (being found in the soil of houseplants or mushroom beds), so we keep a beaker with deionized water in the incubator. B. coprophila can be kept at room temperature in a metal bread box with a loosely fitting lid and containing a beaker of water, but they go into heat shock at 37 &#176;C28, which is a danger in hot climates. Michael Ashburner and others have tried with little success to store D. melanogaster in the cold to reduce the time needed for stockkeeping. In contrast, a major advantage of B. coprophila is that vials with mid-stage larvae can be stored for up to 3 months on an open shelf in the cold room (4-8 &#176;C) with minimal care of only feeding once a month. They develop extremely slowly in the cold up to the pupal stage and will emerge as fertile adults when the vials are brought back to 21 &#176;C. Presumably, this mimics their overwintering in the wild. This cold-induced developmental stalling might be comparable to that seen after gamma irradiation of mid-stage B. coprophila larvae16, but developmental stalling is not seen in late-stage larvae that have passed the point of no return for their normal developmental progression.

Author Spotlight: Exploring &lt;i&gt;Bradysia coprophila&#039;s&lt;/i&gt; Unique Biology &amp;#8211; A Guide to Laboratory Maintenance

Maintenance en laboratoire de la mouche des diptères inférieurs Bradysia (Sciara) coprophila : un organisme modèle nouveau/ancien émergent

Les protocoles décrits ici ont permis d’élever B. coprophila. Lorsque des adultes gras récemment enfermés sont choisis pour l’accouplement (figure 4), plus de 90 % des croisements peuvent être fertiles et donner une progéniture. Le succès de la fécondité varie selon les souches (tableau 2). La crosse 7298 (chromosome X avec marqueur ondulé) était la plus saine des actions, mais a traversé une période de déclin, apparemment en raison de l’activation d’éléments mobiles de l’ADN créant des réarrangements du génome32. Le stock HoLo2 représente une souche saine dérivée de 7298, où apparemment les réarrangements du génome se sont stabilisés, et il a remplacé le stock parental 7298 au centre du stock. La souche HoLo2 est celle qui a été utilisée pour séquencer le génome de B. coprophila et est celle qui est la plus largement utilisée par divers groupes de laboratoire. Récemment, la mutagenèse CRISPR des mouches HoLo2 a été utilisée pour créer le stock W14 avec un phénotype d’œil blanc à utiliser pour la transformation avec des marqueurs oculaires fluorescents (Yamamoto et Gerbi, données non présentées). La souche W14 est exceptionnellement robuste. La crosse 6980 (marqueurs d’aile ondulée et de veine gonflée) est un peu moins robuste et la crosse 91S (marqueur d’aile petite) est encore moins robuste.
Les croisements réussis donnent naissance à des embryons (figure 5). Les embryons subissent l’élimination des chromosomes X paternels imprimés au niveau de la division de clivage entre le 7e et le 9e . De plus, les chromosomes L limités à la lignée germinale sont éliminés de la lignée somatique chez les embryons à la 5e à la 6e division de clivage. Les embryons émergent sous forme de larves, qu’il ne faut pas confondre avec les moisissures qui peuvent également être présentes (Figure 6). Les ocelles (de l’œil de l’adulte) apparaissent dans la seconde moitié du 4e stade larvaire (figure 7). La taille des ocelles fournit un marqueur phénotypique pratique pour le début et la progression de l’amplification de l’ADN par bouffée d’ADN, qui est l’un des deux seuls exemples connus d’amplification intrachromosomique de l’ADN (gène) naturellement régulée par le développement. Par la suite, des pupes se développent, et la quantité de pigment remplissant leurs yeux peut servir de marqueur de développement pour la méiose I et II dans la spermatogenèse (Figure 8) avec ses comportements chromosomiques uniques dans ces divisions.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66751/66751fig04.jpg"> Figure 4 : Accouplement de mouches B. coprophila adultes. Le panneau supérieur montre les trois types de mouches adultes du stock HoLo2 : les mères productrices de femelles aux ailes ondulées (femelles adultes X’WX), les mères productrices mâles aux ailes droites (XX femelles adultes) et les mâles aux ailes droites (X0 mâles adultes). Notez l’ovipositeur pointu à l’extrémité postérieure des mouches femelles et le fermoir en forme de crochet à l’extrémité postérieure des mouches mâles. Le panneau inférieur montre un mâle et une femelle en train de s’accoupler, où le mâle a attrapé l’ovipositeur de la femelle. Le sperme sera stocké dans la spermathèque de la femelle et fécondera les ovules au fur et à mesure qu’ils seront déchargés vers l’extérieur. La longueur des adultes est de 2,0 mm (mâles), 2,5 mm (femelles). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66751/66751fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66751/66751fig05v2.jpg"> Figure 5 : Embryons de B. coprophila. Le panneau supérieur gauche est une vue d’embryons à l’aide d’une lumière standard dans un microscope à dissection ; Les noyaux du cytoplasme syncytial apparaissent sous forme de points noirs. Le panneau de droite utilise la microscopie à fluorescence pour visualiser les noyaux d’embryons colorés à l’iodure de propidium. Les embryons ont une longueur moyenne de 200 microns et une largeur moyenne de 150 microns. Les noyaux des cellules germinales se regroupent au pôle postérieur de l’embryon, comme on le voit pour les cycles 6 (embryon incliné vers l’avant) et 7-9, après quoi ils sont entrecoupés de noyaux somatiques. L’élimination du chromosome L dans la lignée somatique se produit dans la division de clivage 5 ou 6 ; L’élimination du chromosome X dans la lignée somatique se produit dans la 7e, 8e ou 9e divisionde clivage. La cellularisation se produit pendant l’interphase du cycle 11. Le tableau de gauche indique la durée moyenne de chaque cycle de division à 22 °C. La table de gauche et le panneau de droite sont adaptés avec la permission de de Saint Phalle et Sullivan35. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66751/66751fig05large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66751/66751fig06.jpg"> Figure 6 : Les embryons de B. coprophila émergent sous forme de larves. Une grappe d’embryons (flèche épaisse bleue) est visible près de l’ovipositeur de la femelle adulte morte après la ponte. Une semaine après la ponte, les embryons deviennent de jeunes larves, dont plusieurs sont indiquées par des flèches noires. Les larves nouvellement émergées ont une mâchoire noire à l’extrémité antérieure et un corps translucide. Ils se déplacent sur la surface de la gélose et ne doivent pas être confondus avec de la moisissure qui ne bouge pas. L’encart montre un peu de moisissure, avec un filament blanc (flèche rouge) et une spore noire à son extrémité (flèche verte), et est très légèrement plus petit que les larves nouvellement émergées. Barre d’échelle = 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66751/66751fig06large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66751/66751fig07.jpg"> Figure 7 : Stades oculaires des larves de B. coprophila. Les taches oculaires se forment à l’avant de la larve, juste derrière la mâchoire, et sont composées de granules de pigment dont le nombre augmente. Les ocelles sont l’anlage de l’œil adulte. Le panneau supérieur montre des larves qui ont été visualisées avec un microscope de dissection ; Le panneau inférieur est une vue agrandie des taches oculaires à l’aide d’un microscope à contraste de phase pour visualiser une larve sur une lame de microscope avec une goutte d’eau distillée et une lamelle flottant légèrement sur le dessus. La nomenclature des stades du sangle oculaire est conforme à Gabrusewycz-Garcia30 où le nombre de granules est compté dans la rangée la plus longue (par exemple, 12) et le nombre de rangées supplémentaires à l’exclusion de la rangée la plus longue est noté (par exemple, 6 pour le stade du point oculaire 12x6). L’initiation de l’amplification de l’ADN spécifique au site dans les chromosomes polytènes des glandes salivaires commence au stade 10x5 et se termine au stade 14x7 lorsqu’il y a une rafale de transcription au locus et une expansion des bouffées d’ADN31. Au stade suivant de l’œil de bord/mâchoire tombante, les granules de l’œil commencent à fusionner et s’éloignent latéralement de la ligne médiane ; La longueur du corps larvaire se raccourcit. De plus, les bouffées d’ADN se condensent à ce stade. Il faut environ une journée à 21 °C pour traverser chaque stade du point oculaire. Barre d’échelle = 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66751/66751fig07large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66751/66751fig08.jpg"> Figure 8 : Développement des pupes de B. copropila. Au cours de la nymphose, tous les tissus larvaires s’histolysent à l’exception du système nerveux et sont remplacés par des tissus adultes qui apparaissent par divisions cellulaires des disques imaginaux. La couleur du corps passe du blanc au beige au brun au noir. Le pigment remplit progressivement l’œil de la nymphe ; Les méioses I et II se produisent dans les pupes mâles dont les yeux sont remplis de pigment36. Barre d’échelle = 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66751/66751fig08large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Nom de l’action</td>
			<td>Marqueurs</td>
			<td>Taux de fécondité</td>
			<td>Commentaires</td>
		</tr><tr><td>7298</td>
			<td>Aile ondulée (W)</td>
			<td>~75 %</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>HoLo2</td>
			<td>Aile ondulée (W)</td>
			<td>~90 %</td>
			<td>dérivé de 7298</td>
		</tr><tr><td>W14</td>
			<td>Aile ondulée (W) ; Yeux blancs</td>
			<td>~95 %</td>
			<td>dérivé de HoLo2</td>
		</tr><tr><td>6980</td>
			<td>Aile ondulée (W) ; veines enflées (SW)</td>
			<td>~65 %</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>LES 91S</td>
			<td>aile ondulée (W) faible ; Petites (P) Ailes</td>
			<td>~50 %</td>
			<td>le marqueur ondulé a été introduit dans une croix pour sauver 91S</td>
		</tr></tbody></table>Tableau 2 : Stocks de Bradysia (Sciara) coprophila. Le tableau 1 de Gerbi6 énumère ces marqueurs et d’autres qui n’existent plus. Cinq translocations (T1, T23, T29, T32, T70) à l’extrémité centromère du X27 sont résumées dans la figure 8 de Gerbi6 mais n’existent plus.
Dossier supplémentaire 1 : Croisements HoLo2 (et 7298 et W14), Croisement 91S et sauvetage, Croisement 6980, Croisements de translocation. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66751/Supplemental%20Materials.zip" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>

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Cet article décrit l’entretien en laboratoire (y compris l’accouplement et l’alimentation) de la mouche diptère inférieur Bradysia (Sciara) coprophila.

Laboratory stocks of the lower dipteran fly, Bradysia (Sciara) coprophila, have been maintained for over a century. Protocols for laboratory upkeep of B. ...

Nous maintenons la mouche diptère inférieure, Bradysia, également connue sous le nom de Sciara coprophila pour étudier certaines de ses propriétés biologiques uniques, notamment un fuseau monopolaire et une non-disjonction x-dyad dans la méiose, l’empreinte chromosomique, les chromosomes spécifiques à la lignée germinale, l’élimination des chromosomes, la détermination du sexe maternel et l’amplification de l’ADN dans les bouffées d’ADN chromosomique polluantes. Dans notre laboratoire, Yutaka Yamamoto a développé une méthodologie pour la transformation génomique de Bradysia coprophila. De plus, le transcriptome de cet organisme a été rendu disponible, et son génome a été séquencé et assemblé par John Urban.Ces percées permettent d’explorer la biologie unique de Bradysia coprophila. Nous vous encourageons à rejoindre la communauté croissante de scientifiques pour aborder les propriétés uniques de Bradysia coprophila. Vos résultats permettront d’élucider des mécanismes moléculaires d’une importance fondamentale pour la biologie cellulaire et du développement.Les protocoles d’élevage présentés ici serviront de tutoriel pour l’entretien de Bradysia coprophila dans votre propre laboratoire.

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Research

JoVE Journal

Biology

Laboratory Maintenance of the Lower Dipteran Fly Bradysia (Sciara) coprophila: A New/Old Emerging Model Organism

577 vues.  Brown University. Nous maintenons la mouche diptère inférieure, Bradysia, également connue sous le nom de Sciara coprophila pour étudier certaines de ses propriétés biologiques uniques, notamment un fuseau monopolaire et une non-disjonction x-dyad dans la méiose, l’empreinte chromosomique, les chromosomes spécifiques à la lignée germinale, l’élimination des chromosomes, la détermination du sexe maternel et l’amplification de l’ADN dans les bouffées d’ADN chromosomique polluantes. Dans no...

Vidéo: Author Spotlight: Exploring Bradysia coprophila's Unique Biology &#8211; A Guide to Laboratory Maintenance

Laboratory stocks of the lower dipteran fly, Bradysia (Sciara) coprophila, have been maintained for over a century. Protocols for laboratory upkeep of B. coprophila are presented here. These protocols will be useful for the rapidly increasing number of laboratories studying B. coprophila to take advantage of its unique biological features, which include (1) a monopolar spindle in male meiosis I; (2) non-disjunction of the X dyad in male meiosis II; (3) chromosome imprinting to distinguish maternal from paternal homologs; (4) germ line-limited (L) chromosomes; (5) chromosome elimination (paternal chromosomes in male meiosis I; one to two X chromosomes in early embryos; L chromosomes from the soma in early embryos); (6) sex determination by the mother (there is no Y chromosome); and (7) developmentally regulated DNA amplification at the DNA puff loci in larval salivary gland polytene chromosomes. 
It is now possible to explore these many unique features of chromosome mechanics by using the recent advances in sequencing and assembly of the B. coprophila genome and the development of transformation methodology for genomic engineering. The growing scientific community that uses B. coprophila for research will benefit from the protocols described here for mating the flies (phenotypic markers for mothers that will have only sons or only daughters; details of mass mating for biochemical experiments), checking embryo hatch, feeding larvae, and other comments on its rearing.

This paper outlines the laboratory maintenance (including mating and feeding) of the lower dipteran fly Bradysia (Sciara) coprophila.

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Biologie

Maintenance and Rearing of Bradysia (Sciara) coprophila Larvae in a Laboratory Setup

To set up the mating crosses, place the Bradysia coprophila adult male flies on a white fly pad. Use fine tipped forceps to gently pick up the fattest adult by its middle or hind leg. Then place the anesthetized adult female flies on a white fly pad.Using fine tipped forceps, pick up an adult female by its hind leg. One day after mating, push the wings of the anesthetized adult females into 2.2%agar in a Petri plate. Once all the female flies are impaled on the agar, gently squeeze the thorax with forceps.The female will lay a cluster of fertilized eggs within 30 to 60 minutes. Use a dissecting microscope to score the newly emerged larvae. Observe the inch worm-like motion of the newly emerged larvae as they crawl on the surface of the 2.2%agar.After removing the vial plug, examine the vial for the age and number of larvae. Pick up some straw between the second and third fingers or between the thumb and second fingers, and rotate the fingers against each other to deposit the appropriate amount of straw into the vial. On the same day that the larvae emerged, or up to two days later, sprinkle in a tiny bit of food that has been poured into a small bowl for easier access, and replace the gauze plug.For one week old larvae, add more food to just cover the surface of the agar and replace the gauze plug. For the two week old larvae, sprinkle in a generous amount of food to cover the agar surface and replace the gauze plug. Once the larvae attain the late fourth instar stage and begin to pupate, add a generous amount of food on the agar surface.Stop feeding once adults begin to emerge. Do not feed vials with adult flies and do not remove the gauze plug. If there is white mold in the vial, use 70%ethanol on a laboratory wipe to clean a long metal probe.Insert the clean probe into the vial to tap down the mold on the surface of the agar. Then clean the probe with a laboratory wipe dampened with 70%ethanol before storing or using it on another vial. Add only a small amount of food without disturbing the top of the agar, and replace the plug.