Le champ de nos recherches se concentre principalement sur le développement de cellules humaines iPSC CAR NK avec une activité antitumorale améliorée et une persistance in vivo pour mieux traiter diverses tumeurs malignes. Avec ce nouveau protocole de génération de NK CAR iPSC, nous visons à répondre à la question de savoir comment ces cellules peuvent surmonter la résistance micro-environnementale tumorale et améliorer l’efficacité et assurer une production sûre et évolutive. Les principaux défis expérimentaux dans le développement de cellules CAR NK dérivées d’iPSC comprennent la réalisation d’une différenciation cohérente et efficace des iPSC en cellules fonctionnelles dans les cas, la garantie d’une expression stable des CAR sans aucun effet indésirable et l’amélioration de la persistance in vivo.
De plus, les chercheurs sont confrontés à des défis en matière d’évolutivité, de rejets immunitaires et de détenteurs de régulateurs pour les applications cliniques. Nous avons considérablement fait progresser la recherche sur les cellules CAR NK dérivées d’iPSC en établissant une intégration efficace des gènes CAR non viraux en utilisant des modifications géniques basées sur des transposons. De plus, nous avons optimisé CRISPR-Cas9 au niveau iPSC pour supprimer les points de contrôle immunitaires, les facteurs TMA pour améliorer et cas l’efficacité des cellules et des tumeurs et la persistance in vivo dans des modèles de tumeurs solides.
Avec notre protocole utilisant l’expression du gène CAR médiée par un vecteur piggyback non viral, nous visons à combler le manque de développement de modifications géniques sûres, efficaces et évolutives pour les cellules CAR NK iPSC, cette méthode réduit le risque de mutagenèse insertionnelle améliore la reproductibilité et la rentabilité de la génération de cellules CAR NK pour l’immunothérapie du cancer. À l’avenir, notre laboratoire se concentrera sur le développement de nouvelles cellules NK dérivées d’iPSC ciblant les points de contrôle immunitaires. Nous étudierons également le ciblage de divers facteurs microenvironnementaux tumoraux en utilisant des anticorps bispécifiques ou trispécifiques pour améliorer la spécificité, la persistance in vivo et l’activité antitumorale.
Pour commencer le passage de formation du corps embryonnaire de spin ou de l’EB, environ 200 000 iPSC CAR modifiées par puits dans une matrice de membrane basale de six puits précodée contenant un surplus de MT, incubez les cellules à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone, après deux jours, retirez le milieu de culture et détachez les cellules en incubant avec un millilitre de TrypLE Select préchauffé à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes. Ensuite, dissociez soigneusement les agrégats cellulaires en une suspension à cellule unique et transférez la suspension dans un tube conique de 15 millilitres. Ajoutez trois millilitres de PBS pour arrêter la réaction de dissociation.
Ensuite, remettez les cellules en suspension dans le milieu MK SR-plus et filtrez-les à travers une crépine de cellules de 70 micromètres pour éliminer les agrégats. Centrifugez les cellules. Lavez le granulé avec cinq millilitres de PBS, puis mettez-le en suspension dans un millilitre de milieu de formation EB.
Après le comptage, diluez les cellules à la densité appropriée à l’aide d’un milieu de formation d’EB contenant des cytokines et un inhibiteur de ROCK à 10 micromolaires. À l’aide d’une pipette multicanaux, grainez 3000 à 10 000 cellules par puits dans 100 microlitres de milieu EB dans une plaque de 96 puits. Centrifugez les cellules à 300 G pendant cinq minutes et incubez à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone pendant six jours.
Pour vérifier la qualité du corps de l’embryon, préparez d’abord quatre millilitres de trypsine préchauffée à 0,25 % avec du sérum de poulet à 0,4 % pour dissocier les EB. après six jours, transférez 10 à 30 EB dans un tube conique de 15 millilitres. Ajoutez une solution de sérum de poulet à la trypsine dans les EB et incubez-les dans un bain-marie.
Vortex des EB pendant la dissociation toutes les trois à cinq minutes pendant 10 minutes. Pipeter les EB trypsinisés en mélangeant plusieurs fois vers le haut et vers le bas pour assurer une dissociation complète. Ajoutez ensuite cinq millilitres de PBS pour arrêter le processus de trypsinisation.
Filtrez la solution cellulaire à travers une crépine de cellule de 70 micromètres dans un nouveau tube conique. Ensuite, centrifugez les cellules à 300 G pendant cinq minutes et remettez la pastille en suspension dans trois à cinq millilitres de milieu EB frais. Après le comptage, colorez les cellules avec des marqueurs EB typiques.
Ajoutez le volume recommandé d’anticorps dans chaque tube contenant des cellules uniques dissociées d’EB dans 100 microlitres de tampon d’écoulement et incubez sur de la glace pendant 30 minutes. Après l’incubation, lavez les cellules deux fois avec un tampon d’écoulement. Ajouter le colorant mort vivant bleu SYTOX et analyser à l’aide de l’analyse par cytométrie en flux.
Commencez par coder chaque puits d’une plaque à six puits avec cinq à 10 microlitres d’une solution de gélatine stérilisée à 2 %. Incuber l’assiette à 37 degrés Celsius pendant deux à quatre heures. Après l’incubation, aspirez toute solution de gélatine restante et ajoutez trois millilitres du tueur naturel ou du milieu de différenciation NK contenant des cytokines dans chaque puits de la plaque à six puits enrobée de gélatine.
Ensuite, à l’aide d’une pipette d’un millilitre, transférez soigneusement les EB de spin dérivés des iPSC CAR dans une boîte de 10 centimètres. Ajouter trois millilitres de milieu de différenciation NK contenant des cytokines dans chaque puits de la plaque à six puits. À l’aide d’une micro-pipette d’un millilitre, on distribue 16 à 20 EB dans chaque puits de la plaque à six puits et on les incube à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone pendant trois à quatre semaines.
Après l’incubation, évaluer l’expression des marqueurs de cellules NK CD45 positifs et CD56 positifs par cytométrie en flux sur des cellules en suspension. Lorsque plus de 80 % des cellules en suspension expriment CD45 positif et CD56 positif. Récoltez les cellules en les passant à travers un filtre de 70 micromètres pour éliminer les grumeaux.
Avant de co-cultiver des cellules présentatrices d’antigènes artificielles ou des APC artificiels dans des cellules NK, irradiez les APC artificiels avec 100 gris et conservez-les sous forme de tiges congelées. Après avoir récolté des cellules NK, cultivez-les à une densité de cinq fois 10 à la puissance cinq cellules par millilitre dans un milieu d’expansion NK complété par 50 unités par millilitre d’Interleukine-2 et d’Interleukin-15. Ajoutez des APC artificiels irradiés décongelés aux cellules NK dans un rapport de un pour un et incubez à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone.
Pour commencer, allumez le cytomètre de flux. Évaluer l’expression du récepteur d’activation NK sur les cellules NK dérivées de l’iPSC anti GPC3 CAR afin de déterminer l’activité et l’état de maturation des cellules du cas car. Pour les dosages Caspase-3/7.
Comptez les cellules cibles dans les cellules NK dérivées de GPC3 CAR iPSC et pré-colorez-les avec le colorant CellTrace Violet à une concentration finale de cinq micromolaires dans le PBS sous protection lumineuse pendant 15 minutes à 37 degrés Celsius. Laver les cellules cibles de coloration dans un milieu de culture complet avant la co-culture avec des cellules NK dérivées de CAR iPSC à divers rapports effecteur/cible à 37 degrés Celsius. Après trois heures et 30 minutes de co-culture.
Ajouter le réactif de détection vert Caspase-3/7 et incuber pendant encore 30 minutes. Ajouter la solution de coloration des cellules mortes SYTOX pendant les cinq dernières minutes de coloration et mélanger délicatement. Analysez les cellules colorées à l’aide de la cytométrie en flux.
La formation d’EB de spin à partir d’IPC conçus par GPC3 CAR a été observée le sixième jour. Confirmation de la différenciation précoce. Les cellules tueuses naturelles différenciées ou NK des CAR IPC GPC3 ont montré une morphologie distincte à différents stades du troisième au 28e jour.
L’analyse cytométrique en flux démontre l’expression des antigènes hématopoïétiques CD34 et CD31 ainsi qu’une petite quantité de CD43 mais n’exprimant pas encore CD45 dans les EB de spin dérivés des iPSC de type sauvage et GPC3 CAR au sixième jour. Au 35e jour, des marqueurs spécifiques ont été détectés dans le type sauvage mature dans les cellules NK dérivées de GPC3 CAR iPSC. Confirmation de la différenciation réussie en cellules NK.
Des cellules NK de type sauvage élargi et dérivées d’iPSC anti GPC3 ont présenté divers marqueurs d’activation, démontrant la maturation des cellules NK. L’expression de l’antigène GPC3 a été confirmée sur des lignées cellulaires tumorales à l’aide de la cytométrie en flux, validant la spécificité cible des cellules NK dérivées de CAR iPSC anti GPC3. Les cellules NK dérivées d’iPSC anti-GPC3 ont démontré une activité cytotoxique plus élevée contre les lignées cellulaires HepG2, SNU-449, CAL 27 et SKOV3 exprimant GPC3 par rapport aux cellules NK iPSC de type sauvage.
