Notre protocole de laboratoire permet de combiner l’édition du génome humain avec la thérapie cellulaire CAR-T. La procédure de laboratoire est l’approche avec CRISPR-Cas9 pour cibler jusqu’à trois gènes avec une grande efficacité. Enfin, notre approche peut se traduire par des essais cliniques sur l’homme.
Les méthodes décrites peuvent être appliquées à d’autres constructions CAR et gènes cibles. La base des techniques est suffisamment robuste pour être traduite à plus grande échelle et à des collaborateurs universitaires et industriels pour un développement ultérieur. Lorsque vous tentez ce protocole pour la première fois, limitez le nombre de groupes dans le criblage d’ARN guide pour permettre des temps d’incubation précis.
Le respect des conditions de culture et de la densité d’ensemencement décrites s’est avéré essentiel dans notre expérience. Pour commencer, obtenez des cellules mononucléaires autologues du sang périphérique, ou PBMC, auprès de donneurs volontaires sains et isolez les lymphocytes T CD4 et CD8 positifs à l’aide de trousses de sélection CD4 et CD8 disponibles dans le commerce. Combinez les lymphocytes T CD4 positifs et CD8 positifs dans un rapport de un à un et incubez 3 millions de cellules par millilitre dans R10, complétées par 5 nanogrammes par millilitre de chaque IL7 humain et de l’IL15 humain pendant la nuit à 37 degrés Celsius.
Le lendemain, comptez les lymphocytes T et centrifugez 5 à 10 millions de cellules à 300 fois G pendant cinq minutes. Jetez tout surnageant et lavez la pastille cellulaire dans un milieu essentiel minimal de sérum réduit. Re-suspendre la pastille dans 100 microlitres de solution d’affection nucléaire selon les instructions du fabricant.
Tout en lavant les cellules, préparez une ribonucléoprotéine, ou complexe RNP, en incubant 10 microgrammes de nucléase Cas9 avec 5 microgrammes d’ARN guide unique pendant 10 minutes à température ambiante. Incluez un contrôle fictif sans ARN guide unique. Combinez les cellules en suspension avec le complexe RNP et ajoutez 4,2 microlitres de quatre amplificateurs d’électroporation micromolaires.
Bien mélanger et transférer dans des cuvettes d’électroporation. Électroporater les cellules en utilisant le code d’impulsion EH111, puis incuber 5 millions de cellules par millilitre en R10, complétées par 5 nanogrammes par millilitre d’IL7 humain et d’IL15 humain à 30 degrés Celsius pendant 48 heures dans 12 plaques de puits. Après l’incubation, procéder à l’activation et à l’expansion des lymphocytes T.
Concevez les amorces de séquençage en entrant la séquence de l’amplicon PCR dans un logiciel de conception d’amorce standard. Le logiciel de conception suggérera plusieurs séquences d’amorces adaptées au séquençage sanger. Choisissez des amorces avant et arrière qui se lient avec l’amplicon au moins 150 paires de bases en amont ou en aval du site de coupe de l’ARNg pour assurer une bonne qualité de séquençage autour des indels.
Utilisez l’analyse TIDE pour détecter l’efficacité de l’élimination au niveau génomique. L’algorithme reconstruit avec précision le spectre des indels à partir des traces de séquence et calcule les valeurs carrées R. Après activation, les lymphocytes T sont développés en culture et cryoconservés pour de futures études.
Au cours de l’expansion, le doublement de la population et les changements de volume sont suivis tout au long du protocole pour les cellules CAR T simulées et modifiées. Aucun changement significatif n’a été détecté dans la prolifération et l’activation pendant l’expansion. Une fois les cellules cryoconservées, les niveaux d’expression de la CAR ont été déterminés pour d’autres études fonctionnelles pour les cellules CAR T simulées et knockout.
Aucun changement significatif n’a été observé. L’efficacité du knockout peut être déterminée à l’aide de plusieurs techniques. Dans ces diagrammes représentatifs de cytométrie en flux, les loci PDCD1 et TRAC ont été ciblés à l’aide d’un ARN guide unique, montrant une efficacité de 90 % pour l’ARN guide unique PDCD1 et de 98 % pour l’ARN guide unique TRAC chez plusieurs donneurs sains.
Il est important de s’assurer que les rapports molaires de Cas9 et des ARN guides sont exacts. Pendant la procédure, les cellules doivent toujours être maintenues à quatre degrés Celsius et ne pas être laissées dans la solution d’électroporation pendant de longues périodes. Après préservation de la CAR, les cellules CAR T conçues par CRISPR peuvent être utilisées pour des tests fonctionnels in vitro et in vivo, tels que des tests de cytotoxicité, la production de cytokines et des modèles murins de tumeurs syngénétiques ou xénographiques.
Notre approche utilisant la technologie CRISPR Cas9 est maintenant appliquée aux essais cliniques. L’approche peut être utilisée à la fois pour le cancer, ainsi que pour les troubles génétiques non malins, tels que les hémoglobinohaties, qui affectent des millions d’enfants et d’adultes dans le monde.
