Les auteurs tiennent à remercier Priyanka Subrahmanyam pour des discussions utiles. Les auteurs n&#39;ont aucun conflit d&#39;intérêt financier. Ce travail a été soutenu par des subventions de l&#39;American Cancer Society, le NIH / NCI K01 CA131487, CA162273 R21, R21 CA162277, et P30 immunologie tumorale et programme d&#39;immunothérapie à TJ Webb. Le contenu relève de la seule responsabilité des auteurs et ne reflètent pas nécessairement les vues officielles de l&#39;Institut national du cancer ou de la National Institutes of Health.

1. Génération de aAPC <ol><li> Avant d&#39;ajouter des protéines à des billes, préparer tous les réactifs et tampons: tampon borate 0,1 M, D-1X PBS (sans Ca 2 + et Mg 2 +); (azoture de PBS 1X +5% de sérum AB humain + sodium à 0,02%) de tampon de lavage perle , milieu complet (milieu RPMI 100 mM de pyruvate de sodium, 10 mM de solution de vitamines non essentiels, 100 mM MEM vitamine solution, 1% de 2-mercaptoéthanol, 10 uM ciprofloxacine, 5% de sérum AB humain); tampon MACS (1 L de PBS gratuit de Ca 2 + et Mg 2 +, 5 g de BSA, et EDTA 2 mmol). </li><li> Rincez 1 ml perles Dynabeads Epoxy M-450 avec 3 ml tampon 0,1 M stérile Borate (acide borique et de l&#39;eau, pH 7,0-7,4) dans un flacon en verre de 5 ml borosilicate clair filetée. </li><li> Dans une autre tube de 1,5 ml, ajouter 100 mg hCD1d-Ig dimère et 20 pg molécules co-stimulatrices (par exemple: anti-CD28mAb) à 1 ml de PBS w / o Ca 2 + ou Mg 2 +. </li> &lt;li&gt; Lieu perle flacon en verre contenant l&#39;aimant et un tampon de borate aspiration à partir de perles. Ajouter le mélange de protéines à partir de l&#39;étape 1.2 de flacon en verre et remettre le capuchon. Mélanger immédiatement en retournant le flacon, le bouchon de couvrir avec du parafilm et placer sur un agitateur et incuber une nuit à 4 ° C. </li><li> Le lendemain, flacon en verre lieu sur l&#39;aimant et retirer mélange de protéines, tout en évitant soigneusement perles. Laver les billes en ajoutant 3 ml de tampon de lavage perle (PBS avec 5% de sérum AB azoture de sodium +0,02%), et l&#39;incubation à 4 ° C sur un agitateur pendant 5 min. Répéter deux fois. </li><li> Billes peuvent être stockées dans ce mélange de lavage bourrelet. Pour faire aAPC fonctionnelle, retirer une petite aliquote et compter les perles à l&#39;aide d&#39;un hématimètre. Vérifiez que les protéines sont chargées de façon stable sur les billes par coloration avec des anticorps (ex. PE-conjugué anti-IgG1 de souris) et de réaliser des analyses de cytométrie en flux. </li><li> Pour charger des perles avec l&#39;antigène, retirez 5 x 10 7 perles, et les ajouter à un petit flacon en verre 1,5 ml, rincer perles avec 1 ml de PBS stérile. Resuspend lavé perles avec 1 ml de PBS stérile et ajouter antigène; exemple: Chargez α-GalCer/KRN7000 (5mg/ml). * Remarque: Bien, nous n&#39;avons pas détecté de problèmes avec liposolubilité ou formation de micelles, les lipides doivent être manipulés conformément aux recommandations du fabricant. Plus précisément, KRN7000 a été reconstitué dans du DMSO (1mg/ml) pour ces études. KRN7000 et d&#39;autres antigènes glycolipides peuvent également être dissous dans 0,2 mg / ml de PBS contenant 0,5% de Tween-20 (soniquer 2 h. À 37 ° C). IMPORTANT-La aAPC besoin d&#39;être chargé pendant au moins 48-72 heures avant de l&#39;utiliser. </li></ol> 2. Isolement du CD161 + cellules CD3 + <ol><li> Recueillir les cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC). Pour une densité Ficoll gradient de séparation centrifugation de lymphocytes d&#39;un buffy coat ou pack leucophérèse, d&#39;abord diluer le sang hépariné avec un volume égal de PBS 1X à température ambiante. </li><li> Ajouter 15 ml de Ficoll (réchauffé à température ambiante) pour tubes de 50 ml coniques. Lentement superposition25 ml de sang dilué le mélange au-dessus de la Ficoll. Centrifuger à 2000 rpm pendant 30 min à température ambiante avec le frein hors tension. </li><li> Retirez délicatement l&#39;interface lymphocytaire (anneau blanc entre les médias et le Ficoll) avec une pipette Pasteur et transférer dans un nouveau tube de 50 ml conique. </li><li> Laver les cellules en remplissant le tube de 50 ml avec du PBS et centrifugation à 1500 rpm pendant 5 min. Jeter le surnageant et combiner les tubes d&#39;un seul individu à un seul tube et laver les cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) à nouveau avec 20 ml de PBS. Comptez ensuite les PBMC et remettre en suspension à une concentration de 5 x 10 7 cellules / ml dans un tampon MACS (1 L de PBS sans Ca 2 + et Mg 2 +, 5 mmol g de BSA et 2 EDTA). </li><li> Afin d&#39;isoler la fraction de cellules T, commencez avec 2 ml de PBMC (10 8 cellules) et ajouter 100 ul de Pan T solution d&#39;enrichissement de cellules à partir du Kit EasySep Human T enrichissement de cellules. Incuber à température ambiante pendant 10 min. </li&gt; <li> Ajouter 100 ul de particules magnétiques à la solution et incuber à température ambiante pendant 10 min. Amener le volume final de 2,5 ml de solvant à et placer le tube dans l&#39;aimant violet pendant 5 min. Verser rapidement au large de la fraction CD3 + dans un tube conique de 15 ml. </li><li> Laver les cellules en ajoutant 5 ml de tampon MACS froid, comptez le nombre de cellules viables, et enlever une partie aliquote pour la coloration FACS. </li><li> Pour sélectionner les cellules CD161 +, d&#39;abord remettre les lymphocytes T enrichis en 980 ul de tampon MACS glace froide, ajouter 10 mg de lutte contre CD161 anticorps monoclonal, et incuber au réfrigérateur pendant 10 min. </li><li> Centrifuger les cellules à 1500 rpm à 4 ° C pendant 5 min. Puis reconstituer le culot de cellules dans 800 ul de tampon MACS. Ajouter 200 ul d&#39;anti-souris IgG1 microbilles et incuber la solution pendant 10 min à 4 ° C. </li><li> Au cours de cette étape d&#39;incubation, à équilibrer une colonne LS en ajoutant 3 ml de tampon MACS. </li><li> Ensuite, laver les cellules par centrifugation 1500 rpm à 4 ° C pendant 5 min. Resupasser les cellules dans 3 ml de tampon MACS. Puis ajouter les cellules dans la colonne de séparation LS MACS. Assurez-vous d&#39;éviter de générer des bulles par pipetage lentement. Rincer la colonne en ajoutant 3 ml de tampon MACS. Répéter deux fois. </li><li> Ajouter 3 ml de tampon MACS frais et retirez la colonne de l&#39;aimant. Lieu colonne dans un tube conique de 15 ml. Insérez plongeur et pousser sur le contenu pour obtenir purifiés CD161 + CD3 + cellules. Le comte de cellule NKT fraction enrichie. Vous devriez avoir 2-4 millions de cellules. </li></ol> 3. aAPC médiée par l&#39;expansion des cellules NKT <ol><li> Mettre en place une co-culture en ajoutant 10 6 enrichis CD161 + CD3 + cellules T et 10 6 AAPC dans 16 ml de milieu complet (milieu complet + IL-2, 100 U / ml). Plaque de ce mélange en ajoutant 160 ul / puits volume final de 96 puits de culture tissulaire en polystyrène traitées, U-fond de la plaque avec une faible évaporation couvercle. Effectuer échange de milieu tous les jours 7 ème en ajoutant 80 pl de milieu frais. </li><li> Récoltecellules, compter, et effectuer une coloration FACS le jour 12-14. </li><li> Les cellules NKT peuvent être élargis réétalées comme décrit ci-dessus à l&#39;étape 3.1, en ​​particulier remettre en suspension les cellules T 10 6 10 6 élargis et VAMP dans 16 ml de milieu complet. Plaque de ce mélange en ajoutant 160 ul / puits de 96 puits à fond en U plaque. Continuer à rafraîchir milieu de coculture tous les jours 7 ème en ajoutant 80 pl de milieu frais. </li><li> Il est préférable de congeler les cellules NKT supplémentaires après le second tour de l&#39;expansion (1 x 10 6 / cryovial dans 1 ml-5% de DMSO / 95% de FBS.) </li></ol> 4. Test fonctionnel: aAPC médiée par la stimulation des cellules NKT <ol><li> Mettre en place 5x10 4 cellules NKT / bien avec 5x10 5 aAPC dans 200 ul volume final (milieu complet) dans 96 puits à fond en U plaque. </li><li> Surnageant de culture cellulaire pour la récolte ELISA après 24-48 heures. </li></ol>

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	<li>Fowlkes, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+population+of+T-cell+receptor+&#945;&#946;-bearing+thymocytes+which+predominantly+expresses+a+single+V&#946;+gene+family.">A novel population of T-cell receptor &#945;&#946;-bearing thymocytes which predominantly expresses a single V&#946; gene family.</a> Nature. 329, 251-254 (1987).</li><li>Prigozy, T. 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Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

aAPC peut être utilisée pour étudier les exigences de base pour l&#39;activation des cellules NKT et il a le potentiel de valeur clinique de l&#39;expansion ex vivo des cellules T NK pour l&#39;immunothérapie adoptive. Mescher et al. Décrit l&#39;un des systèmes à base de talon première, où biotinylé classe I du CMH murin-peptide seul assemblage de chaîne ont été combinées avec des molécules co-stimulatrices B7.1 et B7.2 biotinylés par la streptavidine à la surface de microsphères de latex 14, 15. Cette approche a été utilisée avec succès pour stimuler spécifiques de l&#39;antigène des cellules T provenant de souris transgéniques. En outre, étant donné que cette approche utilise une seule chaîne complexe CMH-peptide à assurer un chargement homogène des molécules du CMH, chaque antigène peptidique objectif, il faudrait une nouvelle transfection d&#39;expression de la chaîne désirée CMH-peptide complexe unique, ce qui limite la portée de ce approche. Surtout, le groupe du Dr Schneck pionnier de la perle base-aAPC, en développant un autre non-cellulaire aAPC perle base, Par couplage HLA-Ig, le signal 1, et anti-CD28, signal 2, sur des billes magnétiques. HLA-Ig, une forme unique multimérique de HLA fusionnée à une immunoglobuline échafaudage moléculaire 16, 17 a été élaboré par son groupe. Par la suite, ils ont développé MHC-Ig base aAPC, qui ont montré sa capacité à élargir le CMV et MART-1 CTL spécifiques 18. Ici, nous avons démontré que CD1d-Ig aAPC base peut être utilisée pour étendre fonctionnelles des cellules NKT. Une étude a utilisé un système similaire pour examiner l&#39;interaction physique avec des cellules NK CD1 19. Notamment, nous avons conçu une cellule présentatrice d&#39;antigène artificielle qui s&#39;adapte à toutes les exigences que nous trouvons nécessaire pour la prolifération des cellules NKT optimale. La méthode d&#39;expansion aAPC fournit une méthode simple et fiable pour élargir et d&#39;enrichir les cellules NKT. Notre aAPC peuvent être modifiés pour évaluer systématiquement le rôle d&#39;un panel de molécules de co-stimulation potentiels et d&#39;évaluer leur rôle dans la NKT prolifération cellulairetion et de la fonction. Ainsi, aAPC représentent une technologie robuste polyvalent utiles pour induire et l&#39;expansion des cellules NKT. La génération de VAMP prend moins d&#39;une semaine, et est adapté à la production de grandes quantités de perles. Cependant, une étape cruciale dans la génération de la aAPC est de confirmer que CD1d-Ig est stable immobilisé sur la surface des billes et d&#39;évaluer leur fonctionnalité pour assurer la cohérence de lot à lot. Une limite potentielle de ce système est qu&#39;il n&#39;y a pas de mécanisme en place pour éteindre la stimulation, autre que l&#39;enlèvement mécanique des billes. Plus précisément, l&#39;engagement du récepteur des cellules T (TCR) avec l&#39;antigène: complexe CD1d/MHC génèrent habituellement la synapse immunologique de concert avec accessoires / molécules d&#39;adhésion, ce qui peut entraîner l&#39;induction de facteurs inhibiteurs ou de suppression à la fois sur la cellule T et Cellule présentatrice d&#39;antigène. Dans le système aAPC, ces facteurs peuvent être régulée à la hausse par la cellule T, mais le talon ne serait pas exprimer les ligands apparentéspour ces récepteurs. En outre, les cellules NKT CD4 + ont été montré pour supprimer les réponses anti-tumorales chez la souris et chez l&#39;homme, il est donc possible que l&#39;activation non sélective de toutes les cellules NKT (c.-à-stimulation globale avec α-GalCer) ou l&#39;activation du sous-ensemble erronée pourrait entraîner immunologique indésirable résultats. Par conséquent, il faut phénotypiquement et fonctionnellement caractériser la population aAPC expansé cellules NKT. Comme le montre la figure 4, nous avons constaté que la stimulation avec α-GalCer chargé aAPC exprimant anti-CD28 peut entraîner cellules NKT produisent Th1, Th2, Th17 et des cytokines de type. Des études ont rapporté que les souris défi avec de l&#39;IL-33, une cytokine récemment identifiée, a entraîné une augmentation des niveaux de circulation cytokines inflammatoires telles que l&#39;IL-5 et IL-13. Le traitement des cellules NKT avec de l&#39;IL-33 amélioré leur production de cytokines 20. IL-33 est un ligand spécifique pour ST2 et il a été montré que ST2 soluble can blocs IL-33 de signalisation. Ainsi, à titre d&#39;exemple d&#39;une application future, ST2 aAPC exprimer pourraient être générés et utilisés pour déterminer si l&#39;on pouvait inhiber sélectivement la production de cytokines Th2, tout en induisant la sécrétion de cytokines Th1 par les cellules NKT. Il a également été rapporté que l&#39;injection intraveineuse de Ko exprimant aAPC en C57BL / 6 a entraîné dans les métastases du poumon a diminué de 21 tumeur. Fait important, ces données démontrent que le trafic aAPC dans les poumons et sont capables d&#39;activer des lymphocytes T effecteurs sous-ensembles. Par conséquent, on peut générer plusieurs types de aAPC et d&#39;examiner l&#39;interaction entre les sous-ensembles spécifiques de l&#39;antigène des cellules T. En résumé, ces études démontrent que CD1d-Ig aAPC base peut être utilisé pour remplacer normale APC cellulaire, et ont le potentiel d&#39;améliorer les approches actuelles cliniques de cellules NKT base-immunothérapie adoptive.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires (optionnel) </td></tr><tr><td> Ficoll-Paque PLUS </td><td> GE Sciences de la Vie </td><td> 17-1440 </td><td></td></tr><tr><td> EasySep Human T Kit enrichissement de cellules </td><td> StemCell Technologies </td><td> 19051 </td><td></td></tr><tr><td> Allophycocyanine CD161 humain mAb </td><td> Pharmingen </td><td> 550968 </td><td></td></tr><tr><td> EasySep Magnet </td><td> StemCell Technologies </td><td> 18002 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-souris IgG1 Microbilles </td><td> Miltenyi Biotec </td><td> 130-047-101 </td><td></td></tr><tr><td> Dimère soluble recombinant XI souris CD1d dimère: protéine de fusion IG </td><td> BD Biosciences </td><td> 557599 </td><td></td></tr><tr><td&gt; Anti-CD28 monoclonal </td><td> BioLegend </td><td> 302914 </td><td></td></tr><tr><td> M-450 perles époxy </td><td> Life Technologies </td><td> 150-11 </td><td></td></tr><tr><td> Alpha-galactosylcéramide (KRN7000) </td><td> Axxora, LLC </td><td> BML-SL232-0100 </td><td></td></tr><tr><td> Milieu RPMI 1640 </td><td> Sigma Aldrich </td><td> R 0883 </td><td></td></tr><tr><td> Pyruvate de sodium </td><td> Gibco </td><td> 11360-070 </td><td></td></tr><tr><td> Non-acides aminés essentiels </td><td> Gibco </td><td> 11140-050 </td><td></td></tr><tr><td> Solution vitamine </td><td> Gibco </td><td> 11120-052 </td><td></td></tr><tr><td> 2-mercaptoéthanol </td><td> Gibco </td><td></td><td></td></tr><tr><td> La ciprofloxacine </td><td> Alexis Biochemicals </td><td> 380 à 288-G025 </td><td></td></tr><tr><td> PE-Vα24Jα18 </td><td> BioLegend </td><td> 342904 </td><td></td></tr><tr><td> PE-Vα24 (Clone C15) </td><td> Beckman Coulter </td><td> A66907 </td><td></td></tr><tr><td> FITC-Vβ11 (Clone C21) </td><td> Beckman Coulter </td><td> A66905 </td><td></td></tr><tr><td> PE-CD1d </td><td> BioLegend </td><td> 123510 </td><td></td></tr><tr><td> PE anti IgG1 de souris </td><td> BD Biosciences </td><td> 556650 </td><td></td></tr><tr><td> FITC anti-IgG2a de souris </td><td> BioLegend </td><td> 407105 </td><td></td></tr><tr><td> DPBS, pas de calcium, de magnésium ne </td><td> Life Technologies </td><td> 14190250 </td><td></td></tr><tr><td> D&#39;azoture de sodium </td><td> Sigma Aldrich </td><td> S8032 </td><td></td></tr><tr><td> Sérum Albumine Bovine </td><td> Américaine bioanalytique </td><td> AB00440-00100 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 431788 </td><td></td></tr><tr><td> IL-2 (Proleukin) </td><td> BD Biosciences </td><td> 354043 </td><td></td></tr><tr><td> Sérum humain AB </td><td> Atlanta Biologicals </td><td> S40110 </td><td></td></tr><tr><td> Rotator Tube Labquake </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13 à 687-10Q </td><td></td></tr><tr><td> BD Falcon 5 ml en polystyrène à fond rond tubes </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14 à 959-1A </td><td></td></tr><tr><td> Flacons en verre Wheaton exemples avec Cap </td><td> Fisher Scientific </td><td> Petit (03-343-6A) Large (03-343-6E) </td><td></td></tr></tbody></table>

artificial antigen presenting cell (aapc) mediated activation and expansion of natural killer t cells

Natural Killer T (NKT), les cellules sont un sous-ensemble unique de cellules T qui affichent des marqueurs caractéristiques des deux tueuses naturelles (cellules NK) et les cellules T 1. Contrairement aux cellules T classiques, les cellules NKT reconnaissent l&#39;antigène lipide dans le contexte de molécules CD1 2. Les cellules NKT expriment un réarrangement de la chaîne invariante TCRα: Vα14Jα18 chez la souris et chez l&#39;homme Vα24Jα18, qui est associée avec des chaînes Vß de faible diversité 3-6, et sont appelés canoniques ou invariant NKT (i NKT) des cellules. Semblables à des cellules T conventionnelles, les cellules NKT se développer à partir CD4-CD8-thymiques des cellules T précurseurs à la suite de la signalisation appropriée par CD1d 7. La possibilité d&#39;utiliser des cellules NKT à des fins thérapeutiques a considérablement augmenté la capacité de stimuler et d&#39;accroître l&#39;homme cellules NKT avec α-galactosylcéramide (α-GalCer) et une variété de cytokines 8. Fait important, ces cellules ont conservé leur origine phenotype, des cytokines sécrétées, et affichée fonction cytotoxique contre des lignées cellulaires tumorales. Ainsi, ex vivo des cellules NKT étendues restent fonctionnels et peuvent être utilisés pour une immunothérapie adoptive. Cependant, à base de cellules NKT-immunothérapie a été limitée par l&#39;utilisation de cellules autologues présentant l&#39;antigène et de la quantité et de la qualité de ces cellules stimulatrices peuvent varier considérablement. DC dérivées de monocytes de patients atteints de cancer ont été signalés à exprimer des niveaux réduits de molécules de co-stimulation et produisent des cytokines inflammatoires moins 9,10. En fait, DC murines plutôt que d&#39;APC autologues ont été utilisés pour tester la fonction des cellules NKT de patients atteints de LMC 11. Cependant, ce système ne peut être utilisé pour des tests in vitro depuis les cellules NKT ne peut pas être étendu par murin DC, puis utilisés pour une immunothérapie adoptive. Ainsi, un système normalisé qui s&#39;appuie sur les cellules présentatrice d&#39;antigène artificielle (VAMP) pourrait produire des effets stimulants de DC en évitant les pièges d&#39;allo-ou xénogénique CElls 12, 13. Nous décrivons ici une méthode pour générer CD1d basée aAPC. Depuis l&#39;engagement du récepteur des cellules T (TCR) par CD1d complexes antigène-est une exigence fondamentale de l&#39;activation des cellules NKT, l&#39;antigène: CD1d-Ig complexes de fournir une méthode fiable d&#39;isoler, d&#39;activer et de développer des populations de cellules effectrices NKT.

Ici, nous décrivons une méthode pour générer CD1d-Ig base aAPC, faite par couplage covalent de CD1d-Ig et anti-CD28 mAb à des billes magnétiques pour stimuler les cellules NKT comme une méthode normalisée pour la propagation des cellules NKT (figure 1). Tout d&#39;abord, il faut démontrer que les protéines de fusion CD1d-Ig sont stablement immobilisé sur la surface des billes magnétiques. Comme le montre la Figure 2A, CD1d-Ig et d&#39;anticorps anti-CD28 ont été tous les deux exprimés à la surface des billes magnétiques. Pour examiner la capacité de stimulation de l&#39;AAPC, nous co-cultivées hybridomes de cellules NKT avec VAMP nuit, les surnageants de la culture récoltés et mesurés de production d&#39;IL-2 par ELISA. Nous avons constaté que CD1d-Ig base aAPC étaient capables de stimuler les cellules NKT hybridomes à des niveaux égaux ou supérieurs à leurs homologues cellulaires (figure 3, les données non présentées). Fait intéressant, nous avons constaté que nos cellules NKT hybridomes de souris sont stimulés par CD1d humaine basée sur aAPC (Figure 2B), qui fournit une méthode simple pour tester chaque lot de aAPC. Ensuite, nous avons cherché à démontrer le potentiel de propagation de aAPC, donc des cellules T ont été isolés à partir du sang périphérique. D&#39;abord le CD161 + CD3 + fraction des lymphocytes T a été enrichi par séparation bille magnétique. Ensuite, les cellules T ont été stimulés bimensuel avec α-GalCer chargé aAPC. Surtout, nous avons constaté que même avec une population relativement faible de cellules NKT initial (0,03%), nous avons été en mesure d&#39;étendre les cellules à environ 67% Vα24 + Vβ11 + (figure 3). Nous avons élargi les cellules NKT de l&#39;PBMC de nombreux volontaires sains et des patients atteints de cancer et ont constaté que les α-GalCer chargé aAPC ont pu développer des cellules NKT la population dans les deux groupes. Notamment, le taux d&#39;expansion a été très dépendante des bailleurs de fonds. Comme prévu, le plus élevé de la population initiale de cellules Vα24 +, plus le pourcentage d&#39;expansion. En outre,lors de l&#39;utilisation d&#39;une population de départ de 2 millions de cellules CD161 + cellules T CD3 +, on peut obtenir&gt; 10 7 cellules après deux tours de l&#39;expansion (tableau 1). Environ 80-90% des cellules NKT sont élargis CD4 +, ~ 5% CD8 +, et les autres sont sans doute CD4-CD8-doubles négatifs cellules NKT. Ces cellules NKT étendues peuvent être utilisés pour des études fonctionnelles comme le montre la Figure 4A-C. Nous avons trouvé que notre expansion ex vivo des cellules NKT continuent de répondre aux α-GalCer stimulation et sont de puissants producteurs d&#39;IL-17A, le TNF-α, l&#39;IFN-γ et. Il est à noter que si la population initiale T cellule d&#39;enrichissement est faible et l&#39;on est incapable d&#39;effectuer la deuxième étape d&#39;enrichissement CD161, l&#39;expansion aAPC médiation peut ne pas donner les résultats escomptés (voir la figure 4D, Donateur 1). Toutefois, si le pourcentage de cellules NKT circulants est supérieure à 0,1%, il faut toujours être en mesure d&#39;obtenir une expansion significativedes cellules NKT i. Collectivement, ces données démontrent que CD1d base-aAPC peut être utilisé efficacement pour développer et stimuler les primaires des cellules NKT. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/4333/4333fig1.jpg" /> Figure 1. Schéma de CD1d: Ig à base de VAMP parties extracellulaires de la molécule CD1d sont fusionnés à la région constante d&#39;une chaîne lourde d&#39;immunoglobuline protéine séparés par un lieur acide aminé court. Ces molécules peuvent être facilement chargé avec des antigènes lipidiques, tels que α-GalCer, simplement en les incubant avec un excès de lipide d&#39;intérêt. aAPC ont été faites par couplage CD1d-Ig et anti-CD Abs à des billes magnétiques. Dans ce système, CD1d-Ig est utilisé pour fournir le spécifique d&#39;un antigène apparenté de signal à travers le TCR et anti-CD28 monoclonal fournit le signal de co-stimulation. <img alt="Figure 2" fo:content-width="4.25in" fo: src = &quot;/ files/ftp_upload/4333/4333fig2highres.jpg&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/4333/4333fig2.jpg&quot; /&gt; Figure 2. . Coloration FACS des protéines de surface sur VAMP VAMP A) ont été testés pour la présence de CD1d: IgG dimère (par coloration avec PE-conjugué anti-IgG1 de souris) ainsi que anticorps anti-CD28 (en utilisant conjugué au FITC anti-souris IgG2a) histogrammes. ouverts indiquent contrôle isotypique; histogrammes pleins représentent les anticorps indiqués. CD1d-Ig Exprimant aAPC peut stimuler la production d&#39;IL-2 par les cellules NKT. B) Le Vα14 + souris NKT cellulaire d&#39;hybridome, DN32.D3, a été co-cultivées avec un milieu, d&#39;un antigène soluble (α-GalCer), déchargé aAPC ou α-GalCer chargé aAPC. Les surnageants de culture ont été récoltés et sandwich ELISA standard a été utilisé pour mesurer la production d&#39;IL-2. <img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/4333/4333fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4333/4333fig3.jpg" /> Figure 3. Expansion des cellules NKT par CD1d-Ig cellules couvertes d&#39;antigène artificielles présentant. (A) primaire CD3 + CD161 + cellules doublement positives ont été isolées à partir des PBMC en utilisant la séparation magnétique. Les cellules triées ont été stimulées avec α-GalCer chargé, CD1d-Ig aAPC couché pendant 14 jours. Les cellules ont été colorées pour Vα24 et Vβ11 stimulation aAPC suivante. (B) des cellules humaines primaires NKT lyse d&#39;une lignée de lymphome des cellules B. C1R-CD1d cellules incubées avec des cellules NKT dans les proportions indiquées, en présence ou en l&#39;absence d&#39;antigène, une GalCer-(100 ng / ml) en 96-puits à fond en U des plaques de 20-24 h. Cellules NKT la lyse cellulaire a été évaluée par la norme par 51Cr-release dosage. <img alt="Figure 4" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/4333/4333fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4333/4333fig4.jpg" /> Figure 4. Profils de cytokine de cellules NKT-aAPC élargis. </strong&gt; Après stimulation avec α GalCer aAPC chargé pendant deux semaines, les cellules NKT élargies (1 × 10 5 / puits) ont été co-cultivées avec α-GalCer soluble, PMA / ionomycine, anti-CD3/28 microbilles, ou α-GalCer chargé aAPC (2 x 10 5 / puits) pendant 48 heures. (A) l&#39;IL-17A, (B) le TNF-α, et (C) l&#39;IFN-γ a été mesuré par production de cytokine ELISA standard. Les données présentées sont la production de cytokines net après déduction des contrôles négatifs (les médias et les perles vides). (D) les cellules T primaires ont été isolées à partir des PBMC en utilisant magnétique de séparation du talon. Les cellules triées ont été stimulées pendant deux semaines avec l&#39;indication a-GalCer chargé-aAPC. Les cellules ont été colorées en utilisant Abs spécifiques pour Vα24 + et + Vβ11 et analysées par cytométrie en flux.

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Artificial Antigen Presenting Cell aAPC Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

Nous décrivons ici une méthode pour l&#39;activation et l&#39;expansion des cellules NKT de gros populations de cellules T en utilisant des cellules présentant l&#39;antigène artificielles (VAMP). L&#39;utilisation de CD1d basée aAPC offre une méthode normalisée pour générer des nombres élevés de cellules NKT fonctionnelles.

Présentatrice d&#39;antigène artificielle d&#39;activation à médiation cellulaire (AAPC) et l&#39;expansion des cellules T tueuses naturelles

Natural killer T (NKT) cells are a unique subset of T cells that display markers characteristic of both natural killer (NK) cells and T cells1. Unlike ...

artificial-antigen-presenting-cell-aapc-mediated-activation-expansion

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Artificial Antigen Presenting Cell (aAPC) Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

17.9K vues.  University of Maryland. Nous décrivons ici une méthode pour l'activation et l'expansion des cellules NKT de gros populations de cellules T en utilisant des cellules présentant l'antigène artificielles (VAMP). L'utilisation de CD1d basée aAPC offre une méthode normalisée pour générer des nombres élevés de cellules NKT fonctionnelles.

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Preparation and Use of HIV-1 Infected Primary CD4+ T-Cells as Target Cells in Natural Killer Cell Cytotoxic Assays

Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK cells to recognize and lyse HIV-1 infected cells because identifying any aberrancy in NK cell function against HIV-infected cells could potentially lead to therapies that would enhance their cytolytic activity. There is a need to use HIV-infected primary T-cell blasts as target cells rather then infected-T-cell lines in the cytotoxicity assays. T-cell lines, even without infection, are quite susceptible to NK cell lysis. Furthermore, it is necessary to use autologous primary cells to prevent major histocompatibility complex class I mismatches between the target and effector cell that will result in lysis. Early studies evaluating NK cell cytolytic responses to primary HIV-infected cells failed to show significant killing of the infected cells 1,2. However, using HIV-1 infected primary T-cells as target cells in NK cell functional assays has been difficult due the presence of contaminating uninfected cells 3. This inconsistent infected cell to uninfected cell ratio will result in variation in NK cell killing between samples that may not be due to variability in donor NK cell function. Thus, it would be beneficial to work with a purified infected cell population in order to standardize the effector to target cell ratios between experiments 3,4. Here we demonstrate the isolation of a highly purified population of HIV-1 infected cells by taking advantage of HIV-1's ability to down-modulate CD4 on infected cells and the availability of commercial kits to remove dead or dying cells 3-6. The purified infected primary T-cell blasts can then be used as targets in either a degranulation or cytotoxic assay with purified NK cells as the effector population 5-7. Use of NK cells as effectors in a degranulation assay evaluates the ability of an NK cell to release the lytic contents of specialized lysosomes 8 called "cytolytic granules". By staining with a fluorochrome conjugated antibody against CD107a, a lysosomal membrane protein that becomes expressed on the NK cell surface when the cytolytic granules fuse to the plasma membrane, we can determine what percentage of NK cells degranulate in response to target cell recognition. Alternatively, NK cell lytic activity can be evaluated in a cytotoxic assay that allows for the determination of the percentage of target cells lysed by release of 51Cr from within the target cell in the presence of NK cells.

Cytotoxicity assays to measure natural killer cell lytic responses to HIV-infected cells is limited by the purity of the target cells. We demonstrate here the isolation of a highly purified population of HIV-1 infected primary T-cell blasts by taking advantage of HIV-1 s ability to down-modulate CD4.

Préparation et utilisation de VIH-1 primaires CD4 + T-cellules comme cellules cibles dans des cellules tueuses naturelles Tests cytotoxiques

 Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK ...

Recherche

Immunologie et infection

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

CTL with optimal effector function play critical roles in mediating protection against various intracellular infections and cancer. However, individuals may exhibit suppressive immune microenvironment and, in contrast to activating CTL, their autologous antigen presenting cells may tend to tolerize or anergize antigen specific CTL. As a result, although still in the experimental phase, CTL-based adoptive immunotherapy has evolved to become a promising treatment for various diseases such as cancer and virus infections. In initial experiments ex vivo expanded CMV (cytomegalovirus) specific CTL have been used for treatment of CMV infection in immunocompromised allogeneic bone marrow transplant patients. While it is common to have life-threatening CMV viremia in these patients, none of the patients receiving expanded CTL develop CMV related illness, implying the anti-CMV immunity is established by the adoptively transferred CTL1. Promising results have also been observed for melanoma and may be extended to other types of cancer2. 
While there are many ways to ex vivo stimulate and expand human CTL, current approaches are restricted by the cost and technical limitations. For example, the current gold standard is based on the use of autologous DC. This requires each patient to donate a significant number of leukocytes and is also very expensive and laborious. Moreover, detailed in vitro characterization of DC expanded CTL has revealed that these have only suboptimal effector function 3. 
Here we present a highly efficient aAPC based system for ex vivo expansion of human CMV specific CTL for adoptive immunotherapy (Figure 1). The aAPC were made by coupling cell sized magnetic beads with human HLA-A2-Ig dimer and anti-CD28mAb4. Once aAPC are made, they can be loaded with various peptides of interest, and remain functional for months. In this report, aAPC were loaded with a dominant peptide from CMV, pp65 (NLVPMVATV). After culturing purified human CD8+ CTL from a healthy donor with aAPC for one week, CMV specific CTL can be increased dramatically in specificity up to 98% (Figure 2) and amplified more than 10,000 fold. If more CMV-specific CTL are required, further expansion can be easily achieved by repetitive stimulation with aAPC. Phenotypic and functional characterization shows these expanded cells have an effector-memory phenotype and make significant amounts of both TNF&alpha; and IFN&gamma; (Figure 3).

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

A new DC independent method for induction and expansion of antigen-specific T cells is described. HLA A2-Ig based artificial Antigen Presenting Cells (aAPC) are loaded with HLA-A2 restricted peptides to efficiently expand CTL of diverse antigen specificity. This technology holds great potential for CTL-based adoptive immunotherapy.

HLA-Ig des cellules à base Antigène artificielle Présentation d&#39;Efficient Ex vivo Extension du CTL humaines

CTL with optimal effector function play critical roles in mediating protection against various intracellular infections and cancer. However, individuals ...

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer a biologic product with the potential for superior (i) recognition of tumor-associated antigens (TAAs), (ii) persistence after infusion, (iii) potential for migration to tumor sites, and (iv) ability to recycle effector functions within the tumor microenvironment. Most approaches to genetic manipulation of T cells engineered for human application have used retrovirus and lentivirus for the stable expression of CAR1-3. This approach, although compliant with current good manufacturing practice (GMP), can be expensive as it relies on the manufacture and release of clinical-grade recombinant virus from a limited number of production facilities. The electro-transfer of nonviral plasmids is an appealing alternative to transduction since DNA species can be produced to clinical grade at approximately 1/10th the cost of recombinant GMP-grade virus. To improve the efficiency of integration we adapted Sleeping Beauty (SB) transposon and transposase for human application4-8. Our SB system uses two DNA plasmids that consist of a transposon coding for a gene of interest (e.g. 2nd generation CD19-specific CAR transgene, designated CD19RCD28) and a transposase (e.g. SB11) which inserts the transgene into TA dinucleotide repeats9-11. To generate clinically-sufficient numbers of genetically modified T cells we use K562-derived artificial antigen presenting cells (aAPC) (clone #4) modified to express a TAA (e.g. CD19) as well as the T cell costimulatory molecules CD86, CD137L, a membrane-bound version of interleukin (IL)-15 (peptide fused to modified IgG4 Fc region) and CD64 (Fc-&gamma; receptor 1) for the loading of monoclonal antibodies (mAb)12. In this report, we demonstrate the procedures that can be undertaken in compliance with cGMP to generate CD19-specific CAR+ T cells suitable for human application. This was achieved by the synchronous electro-transfer of two DNA plasmids, a SB transposon (CD19RCD28) and a SB transposase (SB11) followed by retrieval of stable integrants by the every-7-day additions (stimulation cycle) of &gamma;-irradiated aAPC (clone #4) in the presence of soluble recombinant human IL-2 and IL-2113. Typically 4 cycles (28 days of continuous culture) are undertaken to generate clinically-appealing numbers of T cells that stably express the CAR. This methodology to manufacturing clinical-grade CD19-specific T cells can be applied to T cells derived from peripheral blood (PB) or umbilical cord blood (UCB). Furthermore, this approach can be harnessed to generate T cells to diverse tumor types by pairing the specificity of the introduced CAR with expression of the TAA, recognized by the CAR, on the aAPC.

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

T cells expressing a CD19-specific chimeric antigen receptor (CAR) are infused as investigational treatment of B-cell malignancies in our first-in-human gene therapy trials. We describe genetic modification of T cells using the Sleeping Beauty (SB) system to introduce CD19-specific CAR and selective propagation on designer CD19+ artificial antigen presenting cells.

Application clinique de<em&gt; Belle au Bois Dormant</em&gt; Et artificielle cellules présentatrices d&#39;antigènes pour modifier génétiquement des cellules T du sang de cordon ombilical et périphériques

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer  a biologic product with the potential for ...

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied by adverse side effects such as a reduced ability to control infections or malignancies. Therefore, new approaches need to be developed that target only the disease mediating cells and leave the remaining immune system intact. Over the past decade a variety of cell based immunotherapy strategies to modulate T cell mediated immune responses have been developed. Most of these approaches rely on tolerance-inducing antigen presenting cells (APC). However, in addition to being technically difficult and cumbersome, such cell-based approaches are highly sensitive to cytotoxic T cell responses, which limits their therapeutic capacity. Here we present a protocol for the generation of non-cellular killer artificial antigen presenting cells (KaAPC), which allows for the depletion of pathologic T cells while leaving the remaining immune system untouched and functional. KaAPC is an alternative solution to cellular immunotherapy which has potential for treating autoimmune diseases and allograft rejections by regulating undesirable T cell responses in an antigen specific fashion.

Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Guidelines are presented for the generation of killer artificial antigen presenting cells, KaAPC, an efficient tool for in vitro depletion of human antigen-specific T cells and an alternative solution to cellular immunotherapy for the treatment of T cell-mediated autoimmune diseases in an antigen-specific fashion without compromising the remaining immune system.

Tueur antigène artificielle cellules présentatrices (KaAPC) d&#39;utilisation efficace<em&gt; In Vitro</em&gt; L&#39;épuisement des lymphocytes T humains spécifiques de l&#39;antigène

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

An Optimized Method for Isolating and Expanding Invariant Natural Killer T Cells from Mouse Spleen

The ability to rapidly secrete cytokines upon stimulation is a functional characteristic of the invariant natural killer T (iNKT) cell lineage. iNKT cells are therefore characterized as an innate T cell population capable of activating and steering adaptive immune responses. The development of improved techniques for the culture and expansion of murine iNKT cells facilitates the study of iNKT cell biology in in vitro and in vivo model systems. Here we describe an optimized procedure for the isolation and expansion of murine splenic iNKT cells.
Spleens from C57Bl/6 mice are removed, dissected and strained and the resulting cellular suspension is layered over density gradient media. Following centrifugation, splenic mononuclear cells (MNCs) are collected and CD5-positive (CD5+) lymphocytes are enriched for using magnetic beads. iNKT cells within the CD5+ fraction are subsequently stained with &#945;GalCer-loaded CD1d tetramer and purified by fluorescence activated cell sorting (FACS). FACS sorted iNKT cells are then initially cultured in vitro using a combination of recombinant murine cytokines and plate-bound T cell receptor (TCR) stimuli before being expanded in the presence of murine recombinant IL-7. Using this technique, approximately 108 iNKT cells can be generated within 18-20 days of culture, after which they can be used for functional assays in vitro, or for in vivo transfer experiments in mice.

Here we present an adapted protocol that can be used to generate a large number of murine invariant natural killer T cells from mouse spleen. The protocol outlines an approach by which splenic iNKT cells can be enriched for, isolated and expanded in vitro using a limited number of animals and reagents.

Un procédé optimisé pour isoler et expansion Invariant Cellules T Tueuses Naturelles de Spleen souris

The ability to rapidly secrete cytokines upon stimulation is a functional characteristic of the invariant natural killer T (iNKT) cell lineage. iNKT cells ...

Development of an Antigen-driven Colitis Model to Study Presentation of Antigens by Antigen Presenting Cells to T Cells

Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic inflammation which affects the gastrointestinal tract (GIT). One of the best ways to study the immunological mechanisms involved during the disease is the T cell transfer model of colitis. In this model, immunodeficient mice (RAG-/- recipients) are reconstituted with naive CD4+ T cells from healthy wild type hosts.
This model allows examination of the earliest immunological events leading to disease and chronic inflammation, when the gut inflammation perpetuates but does not depend on a defined antigen. To study the potential role of antigen presenting cells (APCs) in the disease process, it is helpful to have an antigen-driven disease model, in which a defined commensal-derived antigen leads to colitis. An antigen driven-colitis model has hence been developed. In this model OT-II CD4+ T cells, that can recognize only specific epitopes in the OVA protein, are transferred into RAG-/- hosts challenged with CFP-OVA-expressing E. coli. This model allows the examination of interactions between APCs and T cells in the lamina propria.

In this antigen-driven colitis model, OT-II CD4+ T cells expressing a red fluorescent protein were adoptively transferred into RAG-/- mice that express a green fluorescent protein in mononuclear phagocytes (MPs). The hosts were challenged with Escherichia coli (E.coli) expressing the ovalbumin protein (OVA) fused to a cyan fluorescent protein (CFP).

Développement d&#39;un modèle Colite antigène conduit à étudier la présentation des antigènes par les cellules présentatrices d&#39;antigènes aux cellules T

Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic inflammation which affects the gastrointestinal tract (GIT). One of the best ways to study the immunological ...

Development of Stem Cell-derived Antigen-specific Regulatory T Cells Against Autoimmunity

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic self-tolerance. Tregs represent about 5 - 10% of the mature CD4+ T cell subpopulation in mice and humans, with about 1 - 2% of those Tregs circulating in the peripheral blood. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) can be differentiated into functional Tregs, which have a potential to be used for cell-based therapies of autoimmune diseases. Here, we present a method to develop antigen (Ag)-specific Tregs from iPSCs (i.e., iPSC-Tregs). The method is based on incorporating the transcription factor FoxP3 and an Ag-specific T cell receptor (TCR) into iPSCs and then differentiating on OP9 stromal cells expressing Notch ligands delta-like (DL) 1 and DL4. Following in vitro differentiation, the iPSC-Tregs express CD4, CD8, CD3, CD25, FoxP3, and Ag-specific TCR and are able to respond to Ag stimulation. This method has been successfully applied to cell-based therapy of autoimmune arthritis in a murine model. Adoptive transfer of these Ag-specific iPSC-Tregs into Ag-induced arthritis (AIA)-bearing mice has the ability to reduce joint inflammation and swelling and to prevent bone loss.

We present here a method to develop functional antigen (Ag)-specific regulatory T cells (Tregs) from induced pluripotent stem cells (iPSCs) for immunotherapy of autoimmune arthritis in a murine model.

Développement de cellules souches dérivées de cellules T régulatrices spécifiques de l&#39;antigène contre Autoimmunité

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and reproducibility of this assay can be considered unstable, either because of user&#39;s errors or because of the sensitivity of NK cells to experimental manipulation. To eliminate these issues, a workflow that reduces them to a minimum was established and is presented here. To illustrate, we obtained blood samples, at various time points, from runners (n = 4) that were submitted to an intense bout of exercise. First, NK cells are simultaneously identified and isolated through CD56 tagging and magnetic-based sorting, directly from whole blood and from as little as one milliliter. The sorted NK cells are removed of any reagent or capping antibodies. They can be counted in order to establish an accurate NK cell count per milliliter of blood. Secondly, the sorted NK cells (effectors cells or E) can be mixed with 3,3&#39;-Diotadecyloxacarbocyanine Perchlorate (DiO) tagged K562 cells (target cells or T) at an assay-optimal 1:5 T:E ratio, and analyzed using an imaging flow-cytometer that allows for the visualization of each event and the elimination of any false positive or false negatives (such as doublets or effector cells). This workflow can be completed in about 4 h, and allows for very stable results even when working with human samples. When available, research teams can test several experimental interventions in human subjects, and compare measurements across several time points without compromising the data&#39;s integrity.

This work describes an advanced workflow for the accurate and fast determination of NK (Natural Killer) cell count and NK cell cytotoxicity in human blood samples.

Cytométrie en flux Analyse des cellules tueuses naturelles lytique Activité dans le sang humain

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor microenvironment and the underlying mechanism is still largely unknown. The lack of a consistent and reliable source of NK cells limits the research progress of NK cell immunity. Here, we report an in vitro system that can provide high quality and quantity of bone marrow-derived murine NK cells under a feeder-free condition. More importantly, we also demonstrate that siRNA-mediated gene silencing successfully inhibits the E4bp4-dependent NK cell maturation by using this system. Thus, this novel in vitro NK cell differentiating system is a biomaterial solution for immunity research.

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Here, we present a protocol to mass-produce gene-silencing murine NK cells by using a feeder-free differentiation system for mechanistic study in vitro and in vivo.

Un nouveau système exempt d’alimentation pour la Production de masse des cellules tueuses naturelles murins In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...

Isolation and Adoptive Transfer of High Salt Treated Antigen-presenting Dendritic Cells

Excess dietary salt intake contributes to inflammation and plays a vital role in the development of hypertension. We previously found that antigen-presenting dendritic cells (DCs) can sense elevated extracellular sodium leading to the activation of the NADPH oxidase and formation of isolevuglandin (IsoLG)-protein adducts. These IsoLG-protein adducts react with self-proteins and promote an autoimmune-like state and hypertension. We have developed and optimized state-of-the-art methods to study DC function in hypertension. Here, we provide a detailed protocol for isolation, in vitro treatment with elevated sodium, and adoptive transfer of murine splenic CD11c+ cells into recipient mice to study their role in hypertension.

Here, we present a protocol to isolate dendritic cells from murine spleens by magnetic cell sorting and subsequent adoptive transfer into na&#239;ve mice. The model of high-salt activated dendritic cells was chosen to explain the step-by-step procedures of adoptive transfer and flow cytometry.