Notre laboratoire conçoit des récepteurs immunitaires artificiels, comme des récepteurs antigéniques chimériques, et étudie comment ils affectent la biologie régulatrice des lymphocytes T. En inventant de nouvelles séquences d’ADN et en utilisant des modèles murins humanisés de maladies, nous visons à créer des thérapies cellulaires immunitaires modifiées pour les maladies auto-immunes, le rejet de greffe, le cancer et le vieillissement. Lors de la conception de récepteurs antigéniques chimériques pour les lymphocytes T régulateurs, il est crucial de tenir compte de leur force.
Les CAR Tregs de haute affinité se comportent davantage comme des lymphocytes T effecteurs, produisant une augmentation des cytokines inflammatoires et démontrant une plus grande activité destructrice. Nos recherches en cours indiquent que la réduction de l’affinité CAR conduit à une amélioration des profils et de la fonction des cytokines chez les CAR Tregs. Le domaine des Treg CAR est naissant et manque de standardisation.
Notre protocole introduit une approche robuste et universelle pour générer et tester des CAR Tregs. Cela améliore la reproductibilité et accélère l’innovation tout en guidant les laboratoires novices dans la recherche sur les Tregs en RCA, en particulier compte tenu des défis de la rareté des Tregs et des exigences spécialisées. Nous étudions les mécanismes utilisés par les lymphocytes T régulateurs pour maintenir l’équilibre immunitaire et favoriser la cicatrisation des tissus.
Nos recherches comprennent la compréhension de la signalisation et de la fonction des CAR Treg, ainsi que l’exploration de nouveaux contextes pathologiques où la thérapie CAR Treg peut offrir des avantages uniques par rapport aux stratégies actuelles. Pour commencer, transférez le contenu du leukopak dans un tube conique de 50 millilitres. Ajouter un volume égal de DPBS avec 2 % de sérum de bovin fœtal et mélanger délicatement à l’aide d’une pipette.
Faites tourner le tube à 300g pendant 10 minutes à température ambiante. Une fois le surnageant aspiré, reconstituez la pastille cellulaire dans deux millilitres de DPBS avec 2 % de sérum bovin fœtal. Ensuite, ajoutez huit millilitres de solution de chlorure d’ammonium à la suspension cellulaire et mélangez par inversion douce.
Avec la pause, essorez les cellules lavées à 150g pendant 10 minutes à température ambiante. Après avoir aspiré le surnageant, remettre en suspension la pastille cellulaire dans 30 millilitres de DPBS avec 2 % de sérum bovin fœtal. Ensuite, faites tourner 10 à la puissance huit à 10 à la puissance neuf PBMC à 500 g pendant cinq minutes à température ambiante.
Et remettre en suspension dans le tampon de séparation des cellules à une concentration de cinq fois 10 à la puissance sept cellules par millilitre. Pour le tri cellulaire assisté par fluorescence des lymphocytes T régulateurs, faites tourner les cellules CD4 positives à 500 g pendant cinq minutes. Ensuite, reconstituez des cellules dans 200 microlitres de DPBS.
Pour chaque million de cellules, ajoutez un microlitre de CD4 FITC anti-humain, un microlitre de CD25 APC anti-humain et un microlitre de CD127 PE anti-humain. Après avoir doucement fait tourbillonner le tube, placez-le dans un réfrigérateur à quatre degrés Celsius pendant 30 minutes. Une fois que les cellules sont lavées avec 10 millilitres de DPBS avec 2 % de sérum de bovin fœtal, essorez-les à 500g pendant cinq minutes et remettez doucement en suspension les cellules colorées à 1,5 fois 10 à la puissance sept cellules par millilitre dans du DPBS avec 2 % de sérum de bovin fœtal. Ensuite, passez la suspension cellulaire colorée à travers un capuchon filtrant de 40 micromètres dans des tubes de tri cellulaire assistés par fluorescence.
Préparez des tubes de prélèvement de 15 millilitres contenant trois millilitres de milieu RPMI10 et placez-les sur de la glace. Enfin, triez les lymphocytes T régulateurs CD4 positifs, CD25 élevés, CD127 négatifs et les lymphocytes T conventionnels CD4 positifs, CD25 faibles et CD127 positifs à l’aide du tri cellulaire assisté par fluorescence. Pour commencer, prélevez des lymphocytes T régulateurs isolés du sang humain 48 heures après l’activation et mettez-les en suspension.
Après avoir compté les cellules, faites tourner à 500 g pendant cinq minutes à température ambiante. Remettre en suspension les lymphocytes T régulateurs dans RPMI10 à raison de 1,25 fois 10 à la puissance six cellules par millilitre avec 1 000 unités internationales par millilitre d’interleukine-2. Maintenant, ajoutez chaque aliquote de lentivirus à 2,5 fois 10 à la puissance de cinq lymphocytes T régulateurs dans 200 microlitres dans un tube de microcentrifugation.
Spinoculer à 1 000 g pendant une heure à 32 degrés Celsius. Déplacez chaque réaction de 200 microlitres vers une plaque de 24 puits. Incuber la plaque avec les lymphocytes T régulateurs transduits dans un incubateur de culture tissulaire pendant la nuit.
Complétez chaque puits à deux millilitres avec du milieu RPMI10, la concentration finale d’interleukine-2 étant de 1 000 unités internationales par millilitre. Évaluez l’efficacité de la modification génique à l’aide de la cytométrie en flux, comme illustré ici. Pour commencer, prenez des lymphocytes T régulateurs remis en suspension avec des billes anti-CD3, CD28 dans un tube conique de 15 millilitres 48 heures après l’activation.
Incuber la suspension cellulaire dans un aimant pendant trois minutes. Pendant qu’ils sont dans l’aimant, transférez les cellules dans le milieu à l’aide d’une pipette dans un nouveau tube. Après l’élimination des billes, laissez les lymphocytes T régulateurs déperlés reposer dans RPMI10 pendant deux heures.
Ensuite, faites tourner les lymphocytes T régulateurs à 500 g pendant cinq minutes. Une fois que le surnageant est décanté, remettre les cellules en suspension dans un milieu sérique réduit préchauffé à quatre fois 10 à la puissance six cellules par millilitre. Cellules aliquotes dans 100 microlitres dans des tubes à centrifuger de 1,5 millilitre à faible liaison protéique.
Ajouter le virus adéno-associé du récepteur antigénique chimérique à une multiplicité d’infection de 20 000 à chaque échantillon et remettre en suspension. Ensuite, incubez les tubes réactionnels dans l’incubateur de culture tissulaire pendant une heure. Pendant l’incubation, préparez des complexes ribonucléoprotéiques CRISPR-Cas9 en ajoutant 8,3 microlitres de protéine Cas9 à 2,5 microlitres d’ARN guide unique, en ciblant le locus du gène de suivi.
Après avoir bien mélangé les composants, incubez le mélange de ribonucléoprotéines pendant 15 minutes à 37 degrés Celsius dans l’incubateur de culture tissulaire. Ensuite, remplissez un tube d’électroporation frais avec trois millilitres de tampon d’électroporation à haute osmolarité. Insérez le tube d’électroporation rempli dans la station de pipette du système d’électroporation jusqu’à ce qu’un clic se fasse entendre.
Réglez les conditions d’électroporation à 2, 200 volts, 20 millisecondes, une impulsion dans le système d’électroporation. Lorsque l’incubation d’une heure avec le virus adéno-associé est terminée, faites tourner les cellules avec le virus à 300 g pendant cinq minutes à température ambiante. Une fois le surnageant aspiré, remettre en suspension la pastille cellulaire dans 100 microlitres du tampon de remise en suspension cellulaire fourni par le système d’électroporation par échantillon.
Ensuite, ajoutez 10,8 microlitres de complexe ribonucléoprotéique par échantillon et mélangez bien avec une pipette sans créer de bulles. Maintenant, insérez un embout d’électroporation de 100 microlitres en poussant la pipette jusqu’à sa deuxième butée pour ouvrir la pince. Positionnez la tête supérieure de la pipette dans la pointe d’électroporation jusqu’à ce que la pince s’engage solidement avec la tige de montage du piston.
Relâchez progressivement le bouton tout en maintenant une pression vers le bas sur la pipette pour vous assurer que la pointe s’adapte parfaitement sans aucun espace. Ensuite, appuyez sur la pipette jusqu’à la première butée et plongez l’embout d’électroporation dans le mélange de ribonucléoprotéines cellulaires. Tirez doucement l’échantillon dans la pipette sans aucune bulle.
Insérez la pipette avec l’embout d’électroporation monté contenant l’échantillon verticalement dans le tube E jusqu’à ce qu’un clic se fasse entendre. Après avoir confirmé les paramètres optimaux pour les cellules T régulatrices humaines, appuyez sur Start sur l’écran tactile pour électropoler les cellules. Attendez que l’écran tactile s’affiche complètement.
Retirez délicatement la pipette et transférez immédiatement l’échantillon dans la plaque à six puits préparée contenant 2,5 millilitres de milieu RPMI10 préchauffé sans antibiotique avec de l’interleukine-2 par puits. Après avoir doucement secoué la plaque en mouvements linéaires, placez-la dans l’incubateur de culture tissulaire. Le lendemain, 16 à 18 heures plus tard, remplacez le milieu par un milieu contenant un antibiotique.
Comptez les cellules T régulatrices électroporées et cultivez-les à la puissance 10 à la puissance six cellules par millilitre avec 1 000 unités internationales par millilitre d’interleukine-2.
