Ce protocole décrit un processus simplifié et conforme au GNP de transduction de cellules T primaires humaines avec un gène d’intérêt. Cette technique particulière a été conçue pour être rentable et conforme au GNP sans l’utilisation de plates-formes de fabrication en système fermé coûteuses actuellement disponibles dans de nombreux centres universitaires. Cette méthode pourrait potentiellement être appliquée à la génération de thérapies cellulaires génétiquement modifiées, y compris, mais sans s’y limiter, les cellules CAR-T, qui ont constitué un changement de paradigme pour lutter contre les hémopathies malignes.
Pour isoler la PBMC des cellules prélevées après leucaphérèse du sang du donneur, effectuer une centrifugation à gradient de densité à base de polysaccharides de l’échantillon, en maintenant un rapport réactif/échantillon de 1:2, en centrifugeant le mélange à 800 G pendant 30 minutes à température ambiante avec les freins desserrés. Ensuite, à l’aide d’une micropipette, prélevez les PBMC dans un tube propre de 50 millilitres. Laver les cellules deux fois avec du PBS par centrifugation.
Avant de remettre en suspension les cellules lavées dans un milieu hématopoïétique complet. Activez environ 20 millions de cellules obtenues en ajoutant 10 microlitres de réactif de stimulation des lymphocytes T pour 2 millions de cellules. Ensuite, après avoir ajouté de l’interleukine-2 humaine recombinante à raison de 20 unités par millilitre, mélangez doucement la solution et transférez-la dans une plaque à six puits.
Incuber les cellules à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant 72 heures avant d’effectuer la transduction virale. Le troisième jour, transférez la culture cellulaire dans un tube conique de 50 millilitres et mélangez-la soigneusement. Centrifugez le tube à 300G pendant 10 minutes à température ambiante pour éliminer le réactif d’activation.
Jetez complètement le surnageant et remettez la pastille en suspension dans un millilitre de milieu complet avant de compter les cellules. Ajustez le volume de suspension cellulaire à l’aide d’un milieu complet pour obtenir une concentration qui permet de plaquer 0,5 million de cellules par puits dans une plaque de 24 puits. Ajouter de l’interleukine-7 humaine recombinante et de l’interleukine-15 humaine recombinante aux cellules à des concentrations appropriées.
Dans un tube séparé, ajouter la quantité désirée de vectofusine-1 au milieu Opti-MEM, en tenant compte du volume viral final à utiliser. Combinez ce mélange avec le virus concentré dans un rapport de un pour un, en assurant un mélange complet. Ensuite, ajoutez le mélange résultant contenant le virus aux cellules.
Ajuster le volume total de chaque puits à 400 microlitres en utilisant un milieu complet si nécessaire. Après avoir recouvert la plaque d’un couvercle, scellez-la à l’aide d’un film de paraffine avant de la centrifuger à 1000G pendant deux heures à 32 degrés Celsius. Incuber la plaque pendant la nuit à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone.
Le lendemain, prélevez et tirez les cellules de chaque puits dans un tube de 50 millilitres. Ensuite, centrifugez les cellules à 400 G et à température ambiante pendant cinq minutes. Après avoir soigneusement retiré le surnageant, remettre complètement la pastille en suspension dans un millilitre de milieu complet avant de compter les cellules.
Ajustez ensuite la concentration cellulaire avec le milieu pour atteindre 1 million de cellules par millilitre et ajoutez de l’interleukine-7 recombinante humaine et de l’interleukine-15 recombinante humaine à 155 et 290 unités par millilitre respectivement avant de cultiver les cellules. Une fois le nombre de cellules souhaité atteint, récoltez et transférez les cellules dans des tubes de 50 millilitres et centrifugez-les. Après avoir retiré le surnageant, remettre la pastille en suspension dans 10 millilitres de milieu pour compter les cellules.
Après une nouvelle centrifugation, jeter complètement le surnageant et remettre la pastille en suspension dans une solution de cryoconservation composée de 50 % de HSA et de 40 % de HBSS, à une concentration de 10 millions de cellules par millilitre par flacon cryogénique. Transférez 0,9 millilitre de suspension cellulaire chacun dans le nombre requis de flacons cryogéniques et ajoutez 10 % de diméthylsulfoxyde dans chaque flacon cryogénique. Placez les flacons cryogéniques sur de la glace et déplacez-les rapidement dans un congélateur à débit contrôlé pour la cryoconservation.
Transférez ensuite les échantillons cryoconservés dans un réservoir d’azote liquide surveillé pour un stockage à long terme. Pour évaluer l’efficacité de la transduction, ajoutez 500 microlitres de tampon FACS à l’échantillon dans un tube de tri cellulaire activé par fluorescence ou FACS. Après avoir centrifugé l’échantillon à 400 G et à température ambiante pendant cinq minutes, éliminer complètement le surnageant à l’aide d’une pipette.
Remettre la pastille en suspension dans une solution diluée d’un à cinq CD3 dans un tampon FACS. Vortex l’échantillon et incuber pendant 30 minutes sur de la glace dans l’obscurité avant de centrifuger comme démontré précédemment. Ensuite, après avoir complètement éliminé le surnageant, remettre la pastille en suspension dans une solution diluée de 7-AAD dans un tampon FACS.
Faites tourbillonner ce mélange avant de l’incuber pendant 10 minutes sur de la glace dans un endroit sombre. Enfin, ajoutez-y 200 microlitres de tampon FACS et procédez à l’analyse de l’échantillon à l’aide d’un cytomètre en flux. L’analyse de la viabilité des cellules transduites a révélé qu’au 14e jour, plus de 95 % des cellules étaient CD3 positives et vivantes après exclusion des cellules 7-AAD positives, ce qui indique une activation et une expansion réussies des lymphocytes T.
L’efficacité de la transduction au sein de la population CD3 positive a été mesurée à 58,7 % par rapport aux cellules non transduites, qui présentaient une efficacité de transduction de 0,51 %. Le produit a subi divers tests de contrôle de qualité et a répondu à tous les critères définis, indiquant son aptitude à une utilisation ultérieure. L’ensemble de la procédure doit être effectué avec des techniques strictement aseptiques.
Et l’étape la plus délicate est le processus de transduction où il faut prendre en compte tous les réactifs à ajouter afin de maintenir un volume total spécifique.
