Notre laboratoire utilise la mouche des fruits comme organisme modèle pour étudier comment l’information gustative est traitée par les circuits neuronaux, de la détection des produits chimiques à l’impact sur le comportement. Nous utilisons ce protocole d’imagerie pour identifier les cellules gustatives qui répondent aux acides aminés et déterminer si différents états internes modulent la façon dont les cellules gustatives réagissent à ces nutriments essentiels. L’un des avantages de cette approche d’imagerie calcique est qu’elle permet d’enregistrer les réponses neuronales induites par le goût à partir de cellules spécifiques chez des animaux éveillés où les états internes restent intacts.
Nous pouvons maintenant identifier des circuits gustatifs présumés dans le nouveau connectome du cerveau entier de la drosophile et vérifier la dynamique neuronale fonctionnelle in vivo en utilisant cette approche d’imagerie calcique. Pour commencer, placez la mouche anesthésiée sous un microscope de dissection. À l’aide de ciseaux de dissection, retirez les pattes médiane et arrière au niveau de l’articulation tibiale fémorale et les quatre pattes au niveau du trochanter.
Ramassez la mouche par les ailes à l’aide d’une pince émoussée pour la positionner avec la tête au-dessus de la fente du col de l’utérus ciblée de la chambre d’imagerie tout en gardant le corps en dessous. À l’aide du côté émoussé des ciseaux et de la pince émoussée, poussez doucement la tête et le thorax simultanément dans la fente. Une fois que la mouche est bien à l’intérieur de la fente, poussez-la vers l’arrière et repositionnez-la doucement pour qu’elle fasse face à l’avant de la chambre.
Rassemblez une petite gouttelette de vernis à ongles à l’extrémité d’un cure-dent et appliquez une fine couche pour fixer la tête de la mouche à la chambre d’imagerie. Prenez le cireur d’une main et recueillez une petite gouttelette de cire sur la pointe. À l’aide d’une pince semi-tranchante, dans l’autre main, saisissez un palpe maxillaire et tirez doucement et maintenez la trompe en pleine extension.
Touchez l’extrémité du cireur vers la chambre près de la base de la trompe jusqu’à ce que la cire commence à couler. Déplacez-vous pour entrer en contact avec la base de la trompe et de la cire à mi-chemin de la tige, en évitant tout contact avec les sensilli labellaires. Ensuite, étendez complètement la trompe aussi droite que possible.
Placez maintenant les mouches montées dans une chambre d’humidité pendant 60 minutes pour récupérer. Retirez les mouches de la chambre d’humidité. À l’aide d’une pince très tranchante, pincez les deux antennes, pincez la cuticule pour créer un trou et insérez un côté de la pince tranchante.
Passez la pince sous la cuticule pour la retirer de la région couvrant la zone cérébrale d’intérêt. Pour laver le cerveau exposé, ajoutez environ 100 microlitres de solution d’hémolymphe artificielle, ou AHL, à la tête. Après le lavage, retirez l’AHL en laissant une fine couche pour éviter que le cerveau ne se dessèche.
À l’aide d’une pince tranchante, retirez les sacs d’air et tous les gros débris recouvrant le cerveau. Pour imager spécifiquement la zone sous-œsophagienne, ou ZES, coupez l’œsophage à la base près du proboscis et au point où il traverse le cerveau, à l’aide de pinces très tranchantes. Retirez ce morceau pour exposer la ZES.
Sous le microscope de dissection, placez la lamelle de 10 x 20 millimètres dans la fente inclinée de la chambre d’imagerie. Chargez environ deux microlitres d’eau, ou un autre contrôle négatif, dans le tube capillaire. Localisez la mouche disséquée et concentrez-vous sur le labelle à l’aide d’un objectif à fond clair par immersion dans l’air 10x.
Alignez le capillaire avec le labelle sous la vue 10x. Laissez la position capillaire directement devant le labelle en vous assurant qu’il est proche mais ne se touche pas. Déplacez la platine pour centrer la région cérébrale d’intérêt.
Passez à un objectif d’immersion dans l’eau à plus fort grossissement, tel que l’objectif 40x. Ajoutez environ 200 microlitres d’AHL sur le dessus du cerveau pour assurer le contact avec l’objectif d’immersion. Passez à une puissance laser de 488 nanomètres pour localiser l’expression de GCaMP dans la zone d’intérêt.
Après avoir recueilli au moins cinq secondes de fluorescence de base, déplacez manuellement le stimulateur de manière à ce que le capillaire recouvre le labelle pendant cinq secondes. Supprimez le stimulus et continuez à capturer aussi longtemps que vous le souhaitez. Ensuite, retirez l’AHL et revenez à 10x en fond clair pour confirmer que la lamelle, le stimulateur et le labelle restent dans la bonne position.
Retirez ensuite la chambre d’imagerie et utilisez une lingette non pelucheuse pour retirer la première solution du capillaire. Rincez la pipette avec de l’eau et pipetez environ deux microlitres du goût suivant dans le tube capillaire. La variation relative de la fluorescence chez les mouches Gr64f GCaMP était significativement plus élevée pour la stimulation du saccharose par rapport à l’eau, démontrant une réponse forte et soutenue des neurones récepteurs gustatifs sucrés.
Le pic de fluorescence relatif pour la stimulation du saccharose était significativement plus élevé que celui de l’eau. Le changement de fluorescence chez les mouches G66a GCaMP était significativement plus élevé pour la stimulation de la caféine que pour l’eau, montrant une réponse à l’apparition et à l’élimination de la caféine. Le modèle de projection des terminaisons axonales chez les mouches Gr66a était distinct de celui de Gr64f, démontrant la ségrégation anatomique des neurones récepteurs gustatifs sensibles à l’amertume et au sucre.
