Pulse-מרדף ניתוח של N-linked שרשראות סוכר מ גליקופרוטאינים בתאי יונקים

Summary

אנו מתארים שיטה לניתוח שינוי של N-linked glycans דרך חיים המוקדם של גליקופרוטאינים לאחר ביוסינתזה שלהם בתאי יונקים. זו מושגת על ידי ניתוח הדופק מרדף של glycans שכותרתו מטבולית, לשחרר האנזימטית של גליקופרוטאינים ובחינה על ידי HPLC.

Abstract

קובץ מצורף של Glc

Protocol

הפרוטוקול הבא מיועד לניתוח של שרשראות סוכר של גליקופרוטאינים או סך של גליקופרוטאין ספציפי של עניין. הליך זה בעצם אותו דבר עבור שניהם מקרים עם שינויים מעטים כאמור בכל פרוטוקול.

1. עבור תיוג המטבולית של N-linked glycans אחד צריך להשתמש תרבות subconfluent של בתאי יונקים בוגרים לילה בצלחת 90 ​​מ"מ עבור כל דגימה (דגימות עשוי לייצג נקודות זמן שונות או טיפולים). פרוטוקול זה הוא אופטימיזציה עבור תאים NIH 3T3.
2. להרעיב את התאים גלוקוז על ידי הדגירה ב 5 מ"ל של מדיום מראש התחמם (37 ° C) גלוקוז ללא המוכן טרי, מסופק עם 10% dialyzed FCS ו 4 נתרן mM pyruvate במשך 5-15 דקות.
3. החלף את המדיום רעב עם 1 מ"ל של טרום התחמם (37 ° C) גלוקוז ללא בינוני המכיל 400 μCi של ^[2-3 H] שכותרתו מנוז (ריכוז נמוך יותר של 65 μCi / ml משמש עבור תיוג של גליקופרוטאינים סה"כ), ו דגירה התאים בתרבית בתנאים נורמליים ברקמות במשך שעה 1.
4. הסר את המדיום תיוג מכל מדגם, ובזהירות מוסיפים 2 מ"ל PBS ב 4 ° C עד דגימות המתאים הדופק ומניחים אותם על הקרח (דגימות אלה מכונים פולסים), בעוד דוגמאות המתאים המרדף צריך להיות שטופים 3 פעמים עם 2 מ"ל של טרום התחמם (37 ° C) תרבות נורמליים בינוני מלא, ולאחר מכן להציב CO ₂ באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס עם 5 מ"ל של מדיום מראש חימם קבוע לתקופות לרדוף הרצוי.
5. שוטפים את דגימות הדופק (ממוקם בעבר על הקרח) 3 פעמים עם 2 מ"ל של קר כקרח PBS. התאים מגורד אז את המנה ב 2 מ"ל PBS באמצעות מגרד תא, מכניסים צינור 2 Eppendorf מ"ל.
6. קצר ספין התאים ב 16000Xg (6-10 שניות), לבטל את supernatant ולהקפיא התא גלולה ב -80 ° C.
7. בצע שלבים 5 ו 6 גם דגימות לרדוף בסוף הזמן לרדוף.
8. הסרת תאים מהמקפיא lyse אותם על ידי תוספת של 300 μl של חיץ, vortexing בקצרה דוגרים במשך 20 דקות על הקרח, או במקרה של ניתוח גליקופרוטאינים הכולל, על ידי הדגירה 20 דקות על הקרח עם חיץ B, ואחריו sonication (4 פעמים, 10 שניות, מקסימום אמפליטודה), ואז להרתיח את דגימות 5min.
9. צנטריפוגה lysates ב 16000Xg במשך 20 דקות ב 4 ° C. מעבירים את supernatant לצינור חדש Eppendorf וזורקים את הכדור.
10. אם ניתוח גליקופרוטאינים הכולל, המשך סינון deglycosylation מולקולרית (שלב 17). עבור immunoprecipitation של גליקופרוטאין H2a הפגינו כאן, להוסיף 20l/sample של חלבון (Repligen) A-agarose חרוזים 01:01 ההשעיה ו 3 μl / מדגם של נוגדן ארנבת polyclonal שלנו H2a אנטי עבור גליקופרוטאין הרצויה (נוגדן שלנו נגד H2a למשל ), כדי supernatant משלב 9.
11. דגירה דגימות עבור 4-16 שעות 4 ° C, ללא הרף ערבוב על ידי סיבוב איטי.
12. ספין למטה חרוזים ב 16000Xg למשך 30 שניות, ובזהירות להסיר את האבק באמצעות supernatant.
13. שוטפים את החרוזים, על ידי הוספת 500 חיץ D μl ו vortexing. ספין כמו בשלב 12 ולהסיר את supernatant. חזור על לשטוף 3 פעמים.
14. הוסף חוצץ denaturing 10μl (מסופק עם Endo-H חוד בערכה) ועד גלולה חרוז לרתיחה דגימות במשך 5 דקות (כאשר חלבונים סך מנותחים, deglycosylation מבוצע על המסנן Microcon, שלב 17).
15. ספין למטה חרוזים (16000Xg למשך 30 שניות), ולהעביר את supernatant לתוך צינור Eppendorf חדש. ואז 0.5μl של האנזים H אנדו מתווספים מדגם זה יחד עם 10 μl של למאגר תגובה (מסופק גם עם אנדו חוד H קיט), וכן דגימות מודגרת על 37 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות.
16. כדי להפריד את glycans שוחרר מן החלבונים, המדגם הוא מדולל עם מים 5 פעמים deionized והניח על גבי מסנן מולקולרית (Microcon Ultracel YM30), עם 30kDa חתוכים, centrifuged אז 3 דקות ב 14000Xg. החל 50μl מים deionized ו צנטריפוגה חוזרת של הדגימות. כשלון זה חוזר על עצמו פעמים 2 יותר, תוך שמירה על זרימה דרך.
17. אם אתה מנתח גליקופרוטאינים הכולל, להחיל את supernatant של lysates (משלב 9) כדי לסנן את Microcon. שטפו את תמצית עם 100 μl של חיץ E, 3 פעמים על ידי צנטריפוגה חזר על 14000Xg דקות 3. הוסף 3 μl של חיץ 10X התגובה H אנדו 1.5 μl של האנזים אנדו H ל retentate Microcon ו דגירה במשך 3 שעות ב 37 ° C. Glycans שפורסמו הם eluted עם מים deionized על ידי 3 centrifugations חוזרות ונשנות, כמו בשלב 16.
18. אם תרצה, retentates מן השלבים 16 ו 17, המכיל אנדו H עמידים גליקופרוטאינים מודגרת אז μl 15 של חיץ C עם 200mU של N-F glycosidase, על 37 מעלות צלזיוס למשך 16 ח Elution עם מים deionized מתבצעת כמו בשלב 16.
19. מניחים את הצינור המכיל את התגובה H אנדו flow-through (שלבים 16 ו -17) ב concentrator SpeedVac, ויבש דגימות לחלוטין (זה יכול להיעשות עד 45 ° C כדי להאיץ את התהליך הזה).
20. כדי להכין את דגימות עבור HPLC, resuspend את כדורי יבש 12 μl של הממס HPLC (אצטוניטריל: מים, 60:40, חומצה זרחתית 1%).
21. התאמת מכשיר HPLC (מחובר בטור Spherisorb) אל זרם בלתי פוסק של הממס (1 mL / min) והלחץ (ערך מסוים בין 1000 ו - 2000 psi), ואת המקום אספן חלק לשנות צינור בכל דקה 1.
22. טען את הדגימות לתוך המכשיר HPLC ולהתחיל את אספן חלק בו זמנית.
23. איסוף השברים של 48 מ"ל 1 מ לרוץ כל המדגם מהריצה של תערובת oligosaccharide סטנדרטי.
24. העברת 500 μl של שבריר לכל בקבוקון הנצנץ, ומערבבים את תכולת עם 3 מ"ל של נוזל מים בליל הנצנץ.
25. טען את צלוחיות לקרוא מונה הנצנץ.
26. Readout לדקה הוא זמם כפונקציה של מספר שברים.
27. הערכים לדקה בתוך לשיא מייצגים מינים glycan ספציפיים כדלקמן: שברים 18-21 מתאימות M5, M6 ל 22-26 שברים, שברים 27-31 כדי M7, שברים 32-35 כדי M8, שברים 36-39 כדי M9, שברים 40-42 כדי G1M9 ושברים 43-45 כדי G2M9.
28. סכום הערכים עותקים לדקה עבור שברים בתוך שיא כל משקפת את הסכום המוחלט של מין glycan ספציפיים. כדי לפצות על העובדה כי מינים המכיל שאריות מנוז יותר לרכוש התווית יותר, "טוחנת כמות יחסית" של כל מין glycan מחושב כדלקמן: הסכום המוחלט של כל מין glycan מחולק במספר שאריות מנוז שהוא מכיל . ערך זה מחולק אז בסכום של הסכומים טוחנת היחסי של כל המינים glycan להשיג כדי להשיג את "אחוזים מסך" לכל מיני glycan ספציפיים.

צ'ייס (ח)	0	4
יצא עם אנדו H (CPM)	90000	16800
יצא עם N-glycosidase (CPM) F ב	20400	3900
גליקופרוטאינים ב retentate (CPM) ג	371700	127695
Dolichol-אוליגוסכרידים ב retentate (CPM) ד	4350	540
Dolichol-אוליגוסכרידים ב retentate (%) דואר	1.4 ± 0.7	0.2 ± 0.2

טבלה 1. ניתוח שחרורו של N-linked שרשראות סוכר עם deglycosidases ואת נוכחותם של dolichol-אוליגוסכרידים בדגימות גליקופרוטאין.

אנו להחיל את ההליך הדופק כדי לרדוף lysate מתאי NIH 3T3. לאחר סינון Microcon, שכותרתו N-linked אוליגוסכרידים שוחררו בעיקר אחרי הדופק תיוג (סוג מנוז גבוהה) עם טיפול נוסף עם F N-glycosidase לאחר תקופה מרדף, אשר יתאים לסוג מורכבות (Golgi עיבוד glycans) עם אנדו H, אנדו H אוליגוסכרידים עמידים. זה ניתוח כמותי נקבע כי dolichol-אוליגוסכרידים, היוו חלק משמעותי של התווית retentate הראשונית.

הערות:

1. תאים NIH 3T3 היו הדופק שתויגו עם ^[2-3 H] מנוז ורדפו להשלים עם בינוניות. לאחר תמוגה התא סינון דרך Microcon YM30, גבוה מנוז N-linked אוליגוסכרידים שוחררו retentates ידי הדגירה עם אנדו ח
2. אנדו H עמידות החומר retentates Microcon מ (א) הודגר אז עם F N-glycosidase ושוחרר אוליגוסכרידים נמדד מונה הנצנץ.
3. Retentates Microcon שהושגו כמו (א) לפני טיפול H אנדו, חולצו 4 פעמים עם כלורופורם: מתנול: מים 10:10:03 להסיר glycolipids מבשר, ואת החומר unextracted solubilized ב NaOH 1N ו נספר מונה הנצנץ.
4. Dolichol-אוליגוסכרידים היו מטוהרים מן קטעים (ג) כפי שמתואר 1 ו נספר מונה הנצנץ.
5. ממוצע של 3 ניסויים אחוז dolichol-אוליגוסכרידים (ד) עותקים לדקה סך retentate (ג + ד).

נציג תוצאות

באיור 1. Pulse-מרדף ניתוח הכולל גליקופרוטאינים NIH 3T3 בתאים שלא טופלו ועל עיכוב proteasomal לאחר 1h הדופק עם תיוג. ^[2-3-H] השגנו פרופיל צפוי עם כמה glucosylatedמבשרי הנותר (Glc ₂ Man ₉ GlcNAc ₂ (G2M9) ו G1M9), אבל רוב התווית נוכח M9 ו M8 מינים, כיוון שזה תוצאה של זמירה של גלוקוז כל אחד שאריות מנוז (איור 1). מבשרי לא קטן מנוז חינם או אחרים התגלו, המעידים על יסודיות של טיהור. בעקבות ארוכה למדי 8h מרדף היה נרחב יותר זמירה כדי M7-6 ו כמות קטנה של M5, אבל המינים העיקריים המשיך להיות M8 M9 ו (איור 1 ב '). אם המרדף בוצע בנוכחות מעכב proteasomal (30 מיקרומטר MG-132), היה רק ​​הצטברות קלה של מינים אלה גזוז אותו (איור 1 ג').

איור 2. ניתוח כמותי של שרשראות סוכר המצע ERAD לעומת סך גליקופרוטאינים. (א) ניסוי דומה לזה בתרשים 1, טוחנת כמויות היחסי של כל המינים oligosaccharide חושבו בהתבסס על תוכן מנוז. אנו המיר את הערכים המתקבלים לדקה לכל מיני glycan, אחוז אחד המינים ביחס לסכום הכולל של הסכומים טוחנת היחסי של כל המינים היה נוכח זממו אז כפונקציה של הזמן לרדוף בממוצע של שני ניסויים. (ב) דומים ל (A) אלא glycans שוחרר מן המצע ERAD ASGPR H2a נותחו לאחר תיוג הדופק ולרדוף עד 4H, בנוכחות או העדר מעכב proteasomal MG-132. (ג) ערכים עבור 4H לרדוף בנוכחות של MG-132 מבית (א) ו - (ב) מושווים עבור ASGPR H2a ובריכת גליקופרוטאין. (ד ') תוכנית של רשת N-linked סוכר זמירה תהליכי המיון. סוכר זמירה תהליכים שיובילו M6-5 קשור חלבונים (R) הממוקדות ERAD לעומת M9-8 על אלה יציאה Golgi ומעבר. תוצאות המחקר מראות כי התהליך ERAD קשורה מנוז זמירה של N-glycans להניב מינים עם 5-6 שאריות מנוז הנותרים.

Discussion

ניתוח הדופק מרדף של glycans בתאים חיים עם הפרדה HPLC מספק שיטה ללמוד את הדינמיקה של שינויים מבניים oligosaccharide לאורך החיים של גליקופרוטאין. יש ראיות הולכות ומצטברות כי שינויים כאלה הם מעורבים בייצור אותות לקיפול ER, בקרת איכות ומערכות ^2-5 סחר. השיטה יכול להיות מיושם לא רק ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
600E Multisolvent delivery System controller	Waters	WAT062710
Acetonitrile LiChrosolv (gradient grade for liquid chromatography)	Merck & Co., Inc.	1.0003
Microcon Amicon Ultra 0.5 ml 30K or Centricon ultracel YM-30	EMD Millipore	UFC503024 or 4208
Concentrator 5301, incl. 48 x 1.5 / 2.0 ml fixed-angle rotor	Eppendorf	5301 000.016
Dialyzed F–tal Calf Serum	Biological Industries	04-011-1A
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium	GIBCO, by Life Technologies	41965039
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - glucose free	Sigma-Aldrich	D5030
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma-Aldrich	D1408
EDTA disodium salt(Titriplex Iii)	Merck & Co., Inc.	1084180250
Endo Hf Kit (1,000,000 units/ml)	New England Biolabs	p0703S
F–tal Calf Serum (FCS)	Biological Industries	04-001-1A
Frac-100 fraction collector	Amersham	18-1000-77
LS 6500 Liquid Scintillation Counting systems	Beckman Coulter Inc.	510720
Mannose, D-[2-3H(N)]- (Specific Activity: 15-30Ci/mmol)	PerkinElmer, Inc.	NET570A
N-carbobenzoxyl-leucinyl-leucinyl-leucinal (MG-132)	Calbiochem	474790
N-glycosidase F (1000 units/ml)	Roche Group	11365177
N-octylglucoside	Sigma-Aldrich	O3757
NIH 3T3 cells	American Type Culture Collection	CRL-1658
Opti-Flour	PerkinElmer, Inc.	6013199
Phosphoric acid solution ( 49-51%, for HPLC)	Fluka	79607
Protease Inhibitor Cocktail	Sigma-Aldrich	P2714
Protein A-Sepharose beads	Repligen	IPA300
Rabbit polyclonal anti-H2 carboxy-terminal 6
Sodium deoxycholate	Sigma-Aldrich	30970
Sodium dodecyl sulfate	Bio-Rad	161-0301
Sodium phosphate	Sigma-Aldrich	342483
Sodium pyruvate solution (100mM)	Sigma-Aldrich	S8636
Spherisorb NH2 Column, 5 μm, 4.6 x 250 mm	Waters	PSS831115
Triton X-100	VWR	306324N
Vibra-Cell ultrasonic processors VCX 750	Sonics and Materials, Inc.	690-003
Buffer A: 1% Triton X-100, 0.5% w/v sodium deoxycholate, Protease inhibitor cocktail 2% v/v in PBS
Buffer B: 0.5% w/v SDS, Protease inhibitor cocktail 2% v/v in PBS
Buffer C: N-glycosidase F reaction buffer: 200mM Na3PO4, pH 8.0, 4mM EDTA, 1.5% N-octylglucoside
NIH 3T3 stably expressing H2a 6
Buffer D: 0.5% Triton X-100, 0.25% w/v sodium deoxycholate,0.5% w/v SDS, Protease inhibitor cocktail 2% v/v in PBS
Buffer E: 0.5% w/v SDS, 1% v/v 2-Mercapt–thanol, Protease inhibitor cocktail 2% v/v in PBS
2-mercapt–thanol	Sigma-Aldrich	M3148