A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Method Article
הטלומרים חיוניים יציבות הכרומוזום ואת מבנה הטלומרים G-הסככה חיוני תחזוקה telomerase בתיווך הטלומרים. אימצנו לאחרונה שתי שיטות לאיתור מבנה הטלומרים G-הסככה ב Trypanosoma brucei, שהם הילידים ג'ל הכלאה לבין קשירת בתיווך הרחבה פריימר, אשר יתוארו.
מבנה ה-G-הסככה הטלומרים זוהתה אאוקריוטים רבים, כולל שמרים, חוליות, ו Trypanosoma brucei. היא משמשת מצע עבור telomerase עבור סינתזה דה נובו הטלומרים בדנ"א, ולכן הוא חשוב לצורך תחזוקה הטלומרים. ט brucei הוא טפיל protozoan שגורמת מחלת השינה בבני אדם nagana בבקר. המארח יונקים נגועים פעם, ט תא brucei בקביעות מתגים אנטיגן פני השטח שלו להתחמק ההתקפה החיסונית של המארח. אנחנו הוכיחו לאחרונה כי ט מבנה brucei הטלומרים ממלא תפקיד חיוני בוויסות ביטוי הגנים אנטיגן פני השטח, שהוא קריטי עבור T. brucei בפתוגנזה. עם זאת, ט ' מבנה brucei הטלומרים לא נחקרה בהרחבה עקב הגבלה של שיטות ניתוח של מבנה זה המקצועית. יש לנו עכשיו אימצו בהצלחה את הילידים ג'ל הכלאה ו בתיווך קשירת תחל הרחבה שיטות בדיקה של מבנה ה-G-הסככה הטלומרים וכן קשירת מתאם שיטה לקביעת המסוף הטלומרים נוקלאוטיד ב ט brucei תאים. כאן, נתאר את הפרוטוקולים בפירוט ולהשוות יתרונות שונים שלהם ואת המגבלות.
1. זיהוי ט brucei הטלומרים G-הסככה באמצעות שפת In-ג'ל הכלאה 3
עקרון (איור 1): תחת מצב הילידים, קץ שכותרתו (CCCTAA) 4 (TELC) אוליגו בדיקה רק יכול להכליא את הטלומרים חד גדילי ה-G-הסככה האזור. עוצמת הכלאה הוא יחסי האורך של הסככה. לאחר denaturation ו נטרול, בדיקה אותה יוכלו להכליא באזור הטלומרים כולו. עוצמת הכלאה מייצג את הסכום הכולל דנ"א הטלומרים והוא יכול לשמש כביקורת הטעינה. שני הפקדים הרגילים לצורך הניסוי הזה הם הכלאה משתמש הקצה שכותרתו (TTAGGG) 4 (TELG) אוליגו בדיקה, אשר לא צריכים להניב כל אות כ ט תא brucei אין מבנה הטלומרים C-הסככה, ואת לטפל הדנ"א הגנומי עם 3'ספציפי יחיד תקועים exonucleases כגון EXO EXO אני או T לפני הכלאה, שאמור לחסל את האות יליד הכלאה TELC.
שלב 1. הכינו אטמי DNA עבור ג'ל אלקטרופורזה פעמו שדה (PFGE)
כרומוזומים שלם יופרדו על ידי PFGE. לכן, הדנ"א הגנומי מוכן כמו אטמי ה-DNA.
שלב 2. ט שלמים ונפרדים brucei הכרומוזומים באמצעות ג'ל אלקטרופורזה פעמו שדה
שלב 3. הכתם destain הג'ל agarose
הכתם ג'ל עם ברומיד Ethidium 1μg / מ"ל ב 0.5 x TBE ב RT עבור שעה 1 אז 0.5 x TBE ללא ברומיד Ethidium עבור שעה 1 עם נדנדה עדין. קח תמונה של הג'ל.
שלב 4. יבש את הג'ל agarose
מניחים את הג'ל agarose על שתי שכבות של נייר 3 מ"מ Whatman ולכסות את הג'ל בניילון נצמד. יבש את הג'ל ב RT (הג'ל לא אמור להיות סוער יותר מ -50 ° C כדי למנוע denaturation של דגימות DNA). החלף את ניירות רטוב Whatman עם אלה יבש לאחר 2 ו - 4 שעות של ייבוש, בהתאמה. שמור ייבוש עד הג'ל יבשה לחלוטין. זה עלול לקחת בין לילה תלוי המייבש.
שלב 5. לייבל בדיקות אוליגו
מערבבים 1 μL של TELC ng / μL 50 או TELG אוליגו עם μL 1 מתוך 10 x חיץ Polynucleotide קינאז (PNK), 5 μL של γ [32P] ATP, 2 μL של DDH 2 O, ו - 1 μL של PNK T4. לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. הוסף 90 μL של TNES חיץ (10 mM טריס Cl, pH 8.0, 100 mM NaCl, 10 mM EDTA, pH 8.0, 1% SDS) לתערובת התגובה.
בעוד תיוג oligoes, להכין עמודה G-25: לשים קצת צמר זכוכית לתוך מזרק 3 סמ"ק וכאלה אותו בחוזקה עם קצה פיפטה. מלאו את המזרק עם Sephadex G-25 דק (autoclaved ב TE) ועד 3 מ"ל סימן. תן לו להתיישב לפי משקל. כדי לטהר את החללית שכותרתו: לטעון את החללית על גבי העמוד. לשטוף עם μL 700 של חיץ TNES ו elute עם μL 600 של חיץ TNES. לחלופין, לטהר את תווית בדיקה באמצעות ספין מהירים מיני ™ עמודה (Roche Applied Science).
שלב 6: הכלאה
2. קבע את מסוף הטלומרים נוקלאוטיד ידי קשירת מתאם 6
עקרון (איור 2A & 2B): 5 "סוף שכותרתו oligonucleotide ייחודי ligated ל 3" סוף הסככה-G. מטרה זו מושגת על ידי חישול אוליגו ספציפיים מדריך משלימים. רק נושאי ייחודי / המדריך אוליגו מתאם רצפים תואם ה-G-הסככה רצפים הטלומרים מסוף יהיה ligated. עבור T. brucei, הטלומרים רשאית להפסיק בכל אחד מששת נוקלאוטידים שונים של חוזר TTAGGG. לפיכך six oligoes מדריך שונים משמשים (TG1-TG6, איור 2 א). לאחר קשירת, ה-DNA הוא מתעכל עם endonucleases הגבלה והחליט על ג'ל agarose.
3. מתווכת קשירת פריימר הרחבה 6
עקרון (איור 2A & 2C): oligonucleotide ייחודי ligated ל 3 'G-הסככה עם רצף מסוף מסוים, שנקבע על ידי רצפי משלים שלה מתאם (מדריך) אוליגו. לאחר הטיהור, אוליגו מדריך שכותרתו שנשאר annealed את אוליגו G-overhang/unique היא תחל המורחבת לצומת SS-DS באמצעות DNA פולימרז T4, שאין עקירה גדיל ופעילויות exonuclease "5'-3. הארכת מוצרי פריימר ולכן לתת את אורך הסככה-G.
4. נציג תוצאות:
זיהוי ט brucei הטלומרים G-הסככה מבנה באמצעות ילידים ג'ל הכלאה
אינטקט ט הכרומוזומים brucei מופרדות PFGE מוצגים איור 3A ו - 3B (פאנלים משמאל). ט תאים brucei בדרך כלל מכילים ~ 100 עותקים של minichromosomes, עם כל גודל דומה (50-150 kb) ולהעביר לאותו המיקום על הג'ל (MC). בשל עובדה זו, לאחר הכלאה עם TELC אוליגו החללית, האות G-הסככה הטלומרים הוא הבולט ביותר על minichromosomes (איור 3A, פאנל באמצע). הכלאה עם TELG אוליגו בדיקה בדרך כלל לא תשואה כל אות הכלאה (איור 3B, פאנל באמצע) כי טי תאים brucei אין מבנה הטלומרים C-הסככה. לאחר denaturation ו נטרול, הכלאה עם או TELC או TELG אוליגו בדיקה צריך לחשוף אותות הטלומרים בכל קצות הכרומוזומים (איור 3A & 3B, לוחות מימין).
קבע את מסוף הטלומרים נוקלאוטיד ידי קשירת מתאם
טוען כמות שווה של דנ"א בנתיב זה חיוני assay זה, זה מוצג על ידי מכתים ברומיד Ethidium של הג'ל. דוגמה לכך היא שמוצג באיור 4 א, הפאנל השמאלי.
בפרוטוקול זה, סוף שכותרתו הייחודי אוליגו ומדריך מתאמי אוליגו ligated הם רק קצה הכרומוזום כאשר הטלומרים G-המסוכך וכלה רצפים התואמים אוליגו מדריך. סי nce אוליגו ייחודי מקצה תווית, המוצר קשירת יהיה רדיואקטיבי ולתת אות חזק. כפי שניתן לראות בתרשים 4A, הפאנל הימני, נתיב 1 נותן איתות חזק, המציין כמות גדולה של מתאם unique/TG1 כבר ligated לסיים את הטלומרים. TG1 יש רצף סיום 5'CCCTAA3 ". מכאן הטלומרים G-המסוכך ligated לסיים את המתאם 5'TTAGGG3 ". אין כמות משמעותית של מוצרי קשירת הוא ציין באמצעות oligoes מדריך אחר, המציין כי הטלומרים שהסתיימו TTAGGG יש להן משקל מכריע ט brucei תאים.
טיפול הדנ"א הגנומי עם EXO EXO אני או T, אשר nucleases הסככה ספציפי "3, הביא להפסד של המוצרים קשירת (איור 4A, פאנל הנכון, נתיבי 2 ו -3), המציין כי קשירת אכן נבע הטלומרים-G מבנה הסככה
מתווכת קשירת פריימר Extension
ללא קשירת, סוף שכותרתו מדריך אוליגו הוא 22 NT ארוך. טוען הקצה שכותרתו מדריך אוליגו ישמש שליטה שלילי סמן גודל. (איור 4B, מסלול 11, כוכבית מציינת את סוף שכותרתו מדריך אוליגו). בדרך כלל אנחנו גם רואים להקה של ~ 44 NT בשליטה זו שלילית (איור 4 ב ', מסלול 11, משולש פתוח), אשר קרוב לוודאי לא מפוגל מתאמי שאריות. לאחר קשירת לסוף הכרומוזום, בגודל של מוצר המורחבת משקף את אורכו של מבנה ה-G-הסככה. רוב ט brucei הטלומרים G-המסוכך להסתיים 5'TTAGGG3 "(איור 4 א). עם זאת, אלה G-המסוכך להיראות קצר מאוד (רק ~ 10 nt ארוך), כמו מוצרי המורחבת מן ligated TG1 מדריך אוליגו אינם הרבה יותר מאשר אוליגו המדריך עצמו (איור 4 ב ', מסלול 10), אבל הם מאפשרים קשירת של TG1 מתאם (איור 4A, הפאנל הימני, במסלול 1). אמנם רק כמות קטנה של מתאם TG4 היה ligated עד קצה הטלומרים (איור 4A, הפאנל הימני, נתיב 6), מוצרי המורחבת TG4 ligated הם הרבה יותר (איור 4 ב ', נתיב 7, ראשי חץ), עם המוצר הכי הרבה זמן להיות ~ 55 NT. לפיכך, ראינו שני סוגים של הטלומרים G-הסככה ב ט brucei תאים. השולט הטלומרים G-המסוכך על הקצה "5'TTAGGG3 אבל הם רק ~ 10 nt ארוך. מעטים הטלומרים G-המסוכך להסתיים 5'GGGTTA3 "אבל יכול להיות upto 40 nt ארוך. שני סוגים של הסככה-G רגישים EXO T (או EXO אני) טיפול (איור 4A, פאנל הנכון, מסלול 2, 3 ו 7; איור 4B, מסלול 1, חיצים).
באיור 1. עקרון הכלאה של ג'ל הילידים. שמאלי, בתנאי הילידים, הקצה שכותרתו TELC אוליגו בדיקה רק יכול להכליא עם הסככה ה-G-עשיר חד גדילי הטלומרים. עוצמת הכלאה משקף את אורך הסככה G-הטלומרים. נכון, אחרי denaturation, אוליגו TELC בדיקה יהיה להכליא עם ה-DNA כל הטלומרים. עוצמת הכלאה זה מייצג את הסכום הכולל של ה-DNA הטלומרים והוא משמש כביקורת טוען, ורמת הסופי G-הסככה מחושב על ידי חלוקת האות על ידי הכלאה מקורית כי המתקבל לאחר denaturation.
איור 2. עקרון קשירת מתאם ו בתיווך קשירת הרחבה פריימר. (א) רצפים של oligoes מדריך ייחודי שש. (ב) קבע את מסוף הטלומרים נוקלאוטיד ידי קשירת מתאם. אוליגו ייחודי מקצה שכותרתו (המסומנים בכוכבית אדומה), annealed את oligoes מדריך ligated לסיים את הטלומרים. רק כאשר מתאם ייחודי / מדריך דובים הסככה '3 התואם את רצף הטלומרים מסוף יהיה מתאם להיות ligated. (ג) הארכת תחל בתיווך קשירת, אוליגו המדריך הוא הקצה שכותרתו (המסומנים בכוכבית אדומה) ו annealed כדי אוליגו הייחודי לפני ligated עד קצה הכרומוזום. רק מתאם / מדריך ייחודי הנושא הסככה תואמת הסככה-G '3 יהיה ligated. ^ מציין את הקשר phophordiester ligated. לאחר הסרת זוגות אוליגו unligated, הארכת תחל יבוצע עם DNA פולימראז T4, שאין עקירה גדיל ופעילויות exonuclease "5'-3. אורכו הסופי של המורחבת מדריך אוליגו ולכן משקף את אורך הסככה-G.
איור 3. ט brucei הטלומרים G-הסככה מבנה ונותחו על ידי ילידים ג'ל הכלאה. (א) ג'ל הכלאה עם TELC אוליגו בדיקה. (ב) ג'ל הכלאה עם TELG אוליגו בדיקה. בשני (א) ו - (ב) מוכתם שמאל, Ethedium PFG ברומיד. התיכון, בעקבות הכלאה מקורית. נכון, שלאחר denaturation תוצאה הכלאה. Wild מסוג T. תאים brucei היו בשימוש. שלם או EXO טיפלתי הדנ"א הגנומי הופרדו על ידי PFGE. משולש פתח מייצג את הכרומוזומים megabase; IC, כרומוזומים בגודל ביניים; MC, minichromosomes.
"/>
איור 4. ט brucei הטלומרים G-הסככה מבנה ונותחו על ידי הרחבה, קשירת בתיווך פריימר. (א) רוב ט brucei הטלומרים G-המסוכך לסיים ב 5'TTAGGG3 ". השמאל, ברומיד Ethedium מוכתם DNA ג'ל. סכום השווה בערך של ה-DNA טעון בנתיב אחד. נכון, בעקבות החשיפה של ג'ל אותו לאחר הייבוש. תמים, אני EXO שטופלו או EXO T-DNA היה מטופל ligated עד שישה שונה מקצה תווית ייחודית / מדריך מתאמי אוליגו כמצוין. (ב) ט הטלומרים brucei יש קצר G-הסככות. שלם או EXO T-שטופלו הדנ"א הגנומי היה ligated עד שישה ייחודי / מדריך מתאמים שונים אוליגו ואחריו סיומת פריימר באמצעות DNA פולימרז T4. קצה שכותרתו TG4 אוליגו נטען כביקורת שלילית (מסלול 11). אוליגו עצמו פועל ב 22 NT (*) אלא גם נתן את האות נחלש ב ~ 44 NT (Δ). רק unique/TG4 מתאם הניבו המוצרים הרחבה משמעותית יותר אוליגו המדריך עצמו (ראשי החץ, במסלול 7).
Trypanosoma brucei גורם מחלת השינה אצל בני אדם. מחלה זו, אם אינו מטופל, הוא קטלני באופן בלתי נמנע. ט תאים brucei ב המארחים יונקים לעבור וריאציה antigenic בקביעות כדי להתחמק ההתקפה החיסונית של המארח 7. לכן קשה מאוד לחסל ט תאים brucei פעם דלקת היא הוקמה. אנחנו ה?...
ברצוננו להודות מחיר ד"ר קרולין לדיונים מדעיים הצעות תובנה. עבודה זו נתמכת על ידי NIH מענק AI066095 (PI: Bibo Li).
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Name | Company | Catalog Number | Comments | |
SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 | ||
Agarose Type VII (low melting agarose) | Sigma | A4018 | ||
Proteinase K, recombinant, PCR grade | Roche Diagnostic | 03 115801001 | ||
Exo I | NEB | M0293 | ||
Exo T | NEB | M0265 | ||
T7 exonuclease | NEB | M0263 | ||
T4 DNA polymerase | NEB | M0203 | ||
QIAquick nucleotide removal kit | Qiagen | 28304 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved