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Method Article
Os telômeros são essenciais para a estabilidade cromossômica ea estrutura G-saliência dos telômeros é essencial para a telomerase mediada manutenção dos telômeros. Recentemente, aprovou dois métodos para detectar a estrutura G-saliência dos telômeros em Trypanosoma brucei, Que são nativas em gel-hibridação e ligadura mediada por extensão de primer, que serão descritas.
O telômero estrutura G-saliência tem sido identificada em eucariotos, incluindo muitos fungos, vertebrados, e Trypanosoma brucei. Serve como substrato para telomerase para a síntese de DNA de novo do telômero e, portanto, importante para a manutenção dos telômeros. T. brucei é um parasita protozoário que causa a doença do sono em humanos e nagana em bovinos. Uma vez infectado hospedeiro mamífero, T. célula brucei regularmente alterna a sua antígeno de superfície para escapar ataque do sistema imunológico do hospedeiro. Temos recentemente demonstraram que o T. brucei estrutura dos telômeros desempenha um papel essencial na regulação da expressão gênica do antígeno de superfície, que é crítico para T. patogênese brucei. No entanto, T. brucei estrutura dos telômeros não tem sido extensivamente estudada devido à limitação de métodos de análise dessa estrutura especializada. Temos agora adotada com sucesso o nativo em gel hibridação e mediada por ligadura métodos cartilha de extensão para exame da estrutura G-saliência dos telômeros e um método de ligadura adaptador para determinação do terminal de nucleotídeos dos telômeros em T. células brucei. Aqui, vamos descrever os protocolos em detalhe e comparar suas vantagens e limitações.
1. Detectar T. brucei Telomere G saliência usando Native Hibridização In-gel 3
Princípio (Figura 1): Em condições nativas, um fim-rotulados (CCCTAA) 4 (TELC) oligo sonda só pode hibridizar o telômero single-stranded G-saliência região. A intensidade de hibridização é proporcional ao comprimento do balanço. Após desnaturação e neutralização, a mesma sonda será capaz de hibridizar para a região dos telômeros todo. A intensidade de hibridização representa a quantidade total de DNA do telômero e pode ser usado como um controle de carga. Dois controles padrão para este experimento são hibridação com final marcado (TTAGGG) 4 (TELG) oligo sonda, que não deve produzir qualquer sinal como T. célula brucei não tem estrutura C-saliência dos telômeros, e para o tratamento do DNA genômico com 3'-específicas single-stranded exonucleases como Exo I ou T Exo antes da hibridação, que deve eliminar o sinal de hibridização nativa TELC.
Etapa 1. Prepare fichas de DNA Eletroforese em campo pulsado Gel (PFGE)
Cromossomos intactos serão separados por PFGE. Portanto, o DNA genômico é preparado como plugs DNA.
Etapa 2. Separe T. intacta cromossomos brucei usando Eletroforese em Gel de Campo Pulsado
Etapa 3. Mancha e destain o gel agarose
Manchar o gel com 1μg / mL de brometo de etídio em 0,5 x TBE na RT para 1 hr depois em 0,5 x TBE sem Brometo de etídio por 1 h com balanço delicado. Tire uma foto do gel.
Etapa 4. Secar o gel agarose
Coloque o gel agarose em duas camadas de 3 milímetros de papel Whatman e cobrir o gel com filme plástico. Secar o gel em temperatura ambiente (o gel não deve ser aquecida mais de 50 ° C para evitar a desnaturação das amostras de DNA). Substituir os papéis molhados Whatman com os secar depois de 2 e 4 horas de secagem, respectivamente. Mantenha a secagem até que o gel é completamente seco. Isso pode levar a noite dependendo do secador.
O passo 5. Rótulo as sondas oligo
Misture 1 mL de 50 TELC ng / mL ou oligo TELG com 1 mL de 10 Polinucleotídeo tampão quinase x (PNK), 5 mL de γ [32P] ATP, 2 mL de DDH 2 O, e 1 mL de PNK T4. Incubar a 37 ° C por 1 hora. Adicionar 90 mL de ETNs buffer (10 mM Tris Cl, pH 8,0, 100 mM NaCl, 10 mM EDTA, pH 8,0, 1% SDS) para a mistura de reação.
Enquanto a rotulagem oligoes, prepare um G-25 coluna: colocar um pouco de lã de vidro para uma seringa cc 3 e enchê-lo para baixo firmemente com uma ponteira. Encha a seringa com Sephadex G-25 fine (autoclAVED em TE) para a 3 mL marca. Deixe repousar por peso. Para purificar a sonda marcada: carga a sonda em cima da coluna. Lavar com 700 mL de tampão ETNs, e eluir com 600 mL de tampão ETNs. Alternativamente, purificar a sonda marcada usando um mini-rotação rápida ™ coluna (Roche Applied Science).
Passo 6: Hibridização
2. Determinar o Terminal Telomere Nucleotide por Ligadura Adaptor 6
Princípio (Figura 2A e 2B): A 5 'end-rotulados oligonucleotídeo única é ligada à extremidade 3' do G-beiral. Isto é conseguido através de recozimento para oligo guia específico complementares. Apenas os únicos / guia oligo seqüências adaptador tendo compatível com o telômero seqüências G saliência-terminal vai ser ligada. Para T. brucei, os telômeros pode terminar em uma das seis nucleotídeos diferentes do TTAGGG repete. Daí seis oligoes guia diferentes são usados (TG1-TG6, Figura 2A). Após a ligadura, o DNA é digerido com endonucleases de restrição e resolvidos em gel de agarose.
3. Ligadura Extensão Primer Mediated 6
Princípio (Figura 2A e 2C): A única oligonucleotídeo é ligada aos 3 'G-saliência com seqüência de terminal específico, determinado por suas seqüências complementares no adaptador (guia) oligo. Após purificação, o oligo guia rotulada que permanece recozido para a oligo G-overhang/unique cartilha é estendido para a junção ss-ds usando DNA polimerase T4, que carece de deslocamento vertente e atividades 5'-3 'exonuclease. Os produtos de extensão de primer, portanto, dar o comprimento do G-beiral.
4. Resultados representativos:
Detectar T. brucei estrutura dos telômeros G saliência usando nativa em gel de hibridação
T. intacta cromossomos brucei separados por PFGE são mostrados na Figura 3A e 3B (painéis à esquerda). T. células brucei normalmente contêm ~ 100 cópias de minichromosomes, todos com tamanho similar (50-150 kb) e migram para a mesma posição no gel (MC). Devido a este fato, após hibridização com sonda oligo TELC, o telômero sinal G saliência é mais proeminente em minichromosomes (Figura 3A, painel do meio). Hibridação com sonda oligo TELG normalmente não deu qualquer sinal de hibridização (Figura 3B, painel do meio), pois T. células brucei não têm estrutura de C-saliência dos telômeros. Após desnaturação e hibridização de neutralização, com qualquer TELC ou oligo TELG sonda deve revelar sinais dos telômeros em todas as extremidades dos cromossomas (Figura 3A e 3B, painéis à direita).
Determinar o terminal de nucleotídeos dos telômeros pela ligadura adaptador
Carregando igual quantidade de DNA em cada lane é essencial para este ensaio, e isso é mostrado pela coloração com brometo de etídio do gel. Um exemplo é mostrado na figura 4A, painel da esquerda.
Neste protocolo, o fim marcado única adaptadores oligo e oligo guia só são ligados ao fim quando o cromossomo telomere G-saliências que terminam com seqüências que são compatíveis com o oligo guia. Si nce a oligo-end único é rotulado, o produto será ligadura radioativos e dar sinal forte. Conforme mostrado na Figura 4A, painel da direita, pista 1 dá um forte sinal, indicando que uma grande quantidade de unique/TG1 adaptador tem sido ligada ao fim dos telômeros. TG1 tem uma seqüência final de 5'CCCTAA3 '. Daí o telômero G-overhangs ligada a este adaptador no final 5'TTAGGG3 '. Nenhuma quantidade significativa de produtos ligadura é observado usando oligoes outro guia, indicando que os telômeros terminando em TTAGGG são predominantes em T. células brucei.
Tratamento do DNA genômico com Exo I ou T Exo, que são nucleases 3 'saliência específicos, resultou na perda dos produtos ligadura (Figura 4A, painel da direita, faixas 2 e 3), indicando que a ligadura de fato resultou do telômero G- estrutura de balanço
Ligadura Extensão Primer Mediated
Sem ligadura, o fim marcado oligo guia é de 22 nt de comprimento. Carregando final marcado guia oligo serviria como um controle negativo e um marcador de tamanho. (Figura 4B, pista 11, asterisco indica o fim marcado guia oligo). Que normalmente também observar uma banda de ~ 44 nt neste controle negativo (Figura 4B, pista 11, triângulo aberto), que são mais provável resíduo não-desnaturado adaptadores. Após a ligadura para o fim de cromossomos, o tamanho do produto estendida reflete o comprimento do balanço G-estrutura. A maioria T. brucei telomere fim G-saliências em 5'TTAGGG3 '(Figura 4A). No entanto, estes G-overhangs parecem ser muito curto (apenas ~ 10 nt de comprimento), como os produtos se estendia desde o ligada TG1 oligo guia não são muito mais do que o oligo guia própria (Figura 4B, pista 10), mas eles permitem que a ligadura do TG1 adaptador (Figura 4A, painel da direita, pista 1). Embora apenas uma pequena quantidade de TG4 adaptador era ligada às extremidades dos telômeros (Figura 4A, painel da direita, pista 6), os produtos se estendia desde TG4 ligados são muito mais longos (Figura 4B, pista 7, cabeças de seta), com o maior produto que está sendo ~ 55 nt. Assim, observamos dois tipos de saliência dos telômeros G-in T. células brucei. Predominante dos telômeros fim G-saliências em 5'TTAGGG3 ", mas são apenas ~ 10 nt de comprimento. Alguns dos telômeros fim G-saliências em 5'GGGTTA3 ", mas pode ser até 40 nt de comprimento. Ambos os tipos de saliência G-são sensíveis a Exo T (ou Exo I) tratamento (Figura 4A, painel da direita, pista 2, 3, e 7, Figura 4B, pista 1, setas).
Figura 1. Princípio da hibridização em gel nativo. Esquerda, sob a condição de natal, o fim marcado TELC oligo sonda só pode hibridizar com o single-stranded saliência G-ricos dos telômeros. A intensidade da hibridação reflete o comprimento do balanço G-telômero. Direito, após a desnaturação, o TELC oligo sonda irá hibridizar com todo o DNA do telômero. A intensidade desta hibridação representa a quantidade total de DNA do telômero e é usado como um controle de carga, eo nível G saliência-final é calculado dividindo o sinal de hibridização nativa por que a obtida após a desnaturação.
Figura 2. Princípio da ligadura Adaptor e extensão ligadura cartilha mediada. (A) Seqüências do oligoes guia única e seis. (B) Determine o terminal de nucleotídeos dos telômeros pela ligadura adaptador. O único é oligo-end rotulados (marcados com um asterisco vermelho), recozidas ao oligoes guia e ligada ao fim dos telômeros. Apenas quando o adaptador exclusivo / guia traz uma saliência 3 'que é compatível com a seqüência do telômero terminal vai ser ligada ao adaptador. (C) Em ligadura de extensão de primer mediada, o guia é oligo-end rotulados (marcados com um asterisco vermelho) e recozida ao oligo exclusivo antes ligados às extremidades do cromossomo. Somente o adaptador exclusivo / guia tendo saliência compatível com o G-a saliência 3 'vai ser ligada. ^ Indica o vínculo phophordiester ligada. Após a remoção dos pares oligo sem ligadura, extensão cartilha será realizado com T4 DNA polimerase, que carece de deslocamento vertente e atividades 5'-3 'exonuclease. O comprimento final da estendido guia oligo, portanto, reflete o comprimento do G-saliência.
Figura 3. T. brucei estrutura dos telômeros G-saliência analisados por nativa em gel de hibridização. (A) hibridação Em gel com TELC oligo sonda. (B) de hibridização em gel com TELG oligo sonda. Em ambos (A) e (B) Esquerda, Ethedium PFG manchada Brometo. Meio, resultado de hibridização nativa. Direito, resultado de hibridização pós-desnaturação. Do tipo selvagem T. células brucei foram utilizados. Intacto ou Exo tratei DNA genômico foram separados por PFGE. Triângulo aberto representa os cromossomos megabase; IC, intermediário cromossomos empresas; MC, minichromosomes.
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Figura 4. T. brucei estrutura dos telômeros G-saliência analisados por ligadura mediada extensão primer. (A) A maioria T. brucei telomere G-saliências terminam em 5'TTAGGG3 '. Esquerda, Ethedium brometo de gel DNA manchado. Quantidade aproximadamente igual de DNA é carregado em cada pista. Direito, resultado da exposição do mesmo gel após a secagem. Intacto, Exo I-tratada, ou Exo DNA T-tratados foi ligada a seis diferentes finais rotulados adaptadores únicos / guia oligo conforme indicado. (B) T. telômeros brucei têm curto G-overhangs. DNA genômico intacto ou Exo T-tratados foi ligada a seis diferentes adaptadores únicos / guia oligo seguido por extensão de primer usando DNA polimerase T4. Fim-rotulados TG4 oligo foi carregado como um controle negativo (faixa 11). Os oligo-se corre a 22 nt (*), mas também deu um sinal mais fraco em ~ 44 nt (Δ). Apenas unique/TG4 adaptador rendeu produtos de extensão significativamente maior que o oligo guia própria (seta cabeças, pista 7).
Trypanosoma brucei causa a doença do sono em humanos. Esta doença, se não tratada, é inevitavelmente fatal. T. células brucei em hospedeiros mamíferos sofrer variação antigênica regularmente, de modo a evitar o ataque imune do hospedeiro 7. Por isso, é muito difícil eliminar a T. células brucei uma vez que uma infecção é estabelecida. Recentemente, demonstrou que os telômeros desempenhar um papel importante na regulação da expressão de T. bru...
Gostaríamos de agradecer ao Dr. Carolyn Preço para discussões científicas e sugestões perspicaz. Este trabalho é suportado pelo NIH conceder AI066095 (PI: Bibo Li).
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Name | Company | Catalog Number | Comments | |
SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 | ||
Agarose Type VII (low melting agarose) | Sigma | A4018 | ||
Proteinase K, recombinant, PCR grade | Roche Diagnostic | 03 115801001 | ||
Exo I | NEB | M0293 | ||
Exo T | NEB | M0265 | ||
T7 exonuclease | NEB | M0263 | ||
T4 DNA polymerase | NEB | M0203 | ||
QIAquick nucleotide removal kit | Qiagen | 28304 |
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