JoVE 비디오를 활용하시려면 도서관을 통한 기관 구독이 필요합니다. 전체 비디오를 보시려면 로그인하거나 무료 트라이얼을 시작하세요.
Method Article
Telomeres는 염색체의 안정성을 위해 필수이며 telomere G - 오버행 구조는 telomerase - 중재 telomere의 유지 보수를 위해 필수적입니다. 우리는 최근 telomere G - 오버행 구조의 검출을위한 두 가지 방법을 채택했습니다 Trypanosoma brucei 이는 인 겔 하이브 리다이 제이션 및 설명됩니다 내고 - 중재 뇌관 확장, 기본 있습니다.
telomere G - 오버행 구조는 효모, 척추 동물, 그리고 Trypanosoma brucei 등 많은 eukaryotes에서 발견되었습니다. 그것은 드 노보 telomere DNA 합성에 대한 telomerase를위한 기판 역할 및 telomere 유지 보수에 대한 것이 중요합니다. T는 brucei은 가축의 인간과 nagana에 수면병 일으키는 protozoan 기생충이다. 일단 감염된 포유류의 호스트, T. brucei 세포 정기적으로 숙주의 면역 공격을 회피하기 위해 표면 항원을 전환됩니다. 우리는 최근에 보여준 그 T. brucei telomere 구조 T.에 대한 중요 표면 항원 유전자 발현의 조절에 중요한 역할을 brucei의 pathogenesis. 그러나, T. brucei telomere 구조는 광범위이 전문 구조 분석 방법의 한계로 인해 연구되지 않았습니다. 우리는 이제 성공적으로 하이브리드화 및 telomere G - 오버행 구조의 심사 T.의 뉴클레오 티드 telomere 터미널의 결정을위한 어댑터 내고 방법에 대한 결합 - 중재 뇌관 확장 방법 - 겔의 기본을 채택했습니다 brucei 세포. 여기서는 자세하게 프로토콜을 설명하고 그들의 다양한 장점과 한계를 비교합니다.
1. 검색 T. brucei Telomere 네이티브를 사용하여 G - 오버행 인 겔 하이브 리다이 제이션 3
원리 (그림 1) 기본 조건, 최종 레이블 (CCCTAA) 4 (TELC) oligo 프로브는 단일 좌초 telomere G - 오버행 영역에 잡종 수 있습니다. 하이브리드화 강도는 오버행의 길이에 비례합니다. 변성 및 중화 후, 동일한 프로브는 전체 telomere 지역에 잡종을하실 수 있습니다. 하이브리드화 강도는 총 telomere의 DNA 금액을 나타냅니다하고 읽어 컨트롤로 사용할 수 있습니다. 본 실험의 두 가지 표준 컨트롤 T. 같은 신호를 얻을 수 없습니다 최종 레이블 (TTAGGG) 4 (TELG) oligo 프로브를 사용하여 하이브리드화 아르 brucei 세포는 원시 TELC 하이브 리다이 제이션 신호를 제거해야하는, telomere C - 오버행 구조를하지 않으며, 사전 하이브리드화 이러한 엑소 I 또는 엑소 T와 같은 3' - 특정 단일 좌초 exonucleases와 게놈 DNA를 처리합니다.
1 단계. 펄스 필드 겔 전기 영동 (PFGE)에 대한 DNA 플러그 준비
손상 염색체는 PFGE로 구분됩니다. 따라서, 게놈 DNA는 DNA의 플러그로 준비가되어 있습니다.
2 단계. 별도 그대로 T. 펄스 필드 겔 전기 영동을 사용하여 brucei 염색체
3 단계. 아가로 오스 겔 스테인과 destain
다음 0.5 X TBE의 부드러운 락을 1 시간에 대한 Ethidium의 브로마이드없이 1 시간을위한 RT에서 0.5 X TBE에 1μg / ML Ethidium의 브로마이드로 겔 스테인. 젤의 사진을 가져가라.
4 단계. 아가로 오스 겔 건조
3mm 왓먼 용지의 두 레이어에있는 아가로 오스 겔을 플레이스 및 플라스틱 포장으로 젤 커버. RT (겔이 가열해서는 안됩니다 50 이상 ° C DNA 샘플의 변성을 피하기 위해).에서 젤 건조 각각 건조 2 4 시간 후 마른 사람과 함께 젖은 왓먼 용지를 교체합니다. 젤 완전히 건조 될 때까지 건조 유지. 이것은 건조기에 따라 하루 정도 걸릴 수 있습니다.
단계 5. oligo 프로브를 라벨
10 × 폴리 뉴클레오 타이드 키나제 (PNK) 버퍼, 5 μL 1 μL와 50 μL / NG TELC 또는 TELG oligo 1 μL를 섞어 γ [32P] ATP, ddH 2 O 2 μL, 그리고 T4 PNK 1 μL. 37 ° C 1 시간을위한 부화. 반응 혼합물에 TNES 버퍼 (10 MM Club 호텔 트리스, 산도 8.0, 100 MM NaCl, 10 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 산도 8.0, 1 % SDS) 90 μL를 추가합니다.
oligoes을 라벨 있지만, G - 25 컬럼을 준비 : 3 CC 주사기로 일부 글라스 울을 넣고 피펫 팁로 단단히 내려 것들. Sephadex 잘 G - 25 (autocl로 주사기를 채우3 ML 표시) TE에 aved. 그것이 무게로 정착합시다. 라벨 프로브를 정화하려면 열 위에 프로브를로드합니다. TNES 버퍼 700 μL로 씻어 및 TNES 버퍼 600 μL와 elute. 또는, 미니 빠른 스핀을 사용하여 레이블 프로브 정화 ™ 열 (로체 응용 과학).
6 단계 : 하이브 리다이 제이션
2. 어댑터 내고 6 뉴클레오 티드 Telomere 터미널을 결정
원리 (그림 2A & 2B) : 5 G - 오버행의 끝 '최종 표시된 고유 oligonucleotide는 3 출혈도 잡았입니다. 이것은 구체적인 보완 안내 oligo에 어닐링에 의해 수행됩니다. telomere G - 오버행 터미널 시퀀스와 호환만이 유일 / 가이드 oligo 어댑터 베어링 시퀀스는 출혈도 잡았 것입니다. T.에 대한 brucei, telomeres는 TTAGGG 반복의 여섯 가지 세포핵 중 하나를 종료할 수 있습니다. 따라서 여섯 가지 가이드 oligoes는 (TG1 - TG6, 그림 2A) 사용됩니다. 결합 후, DNA는 제한 endonucleases로 소화하고 아가로 오스 겔에서 해결되었습니다.
3. 결합의 중재 프라이머 확장 6
원리 (그림 2A 및 2C) : 독특한 oligonucleotide는 어댑터 (가이드) oligo에서의 상호 보완적인 시퀀스에 의해 결정, 3 'G - 오버행 특정 터미널 시퀀스에 출혈도 잡았 있습니다. 정화 후, G-overhang/unique oligo에 annealed 남아있는 레이블 가이드 oligo는 스트랜드 변위 및 5' - 3 'exonuclease 활동이 부족 T4의 DNA 중합 효소를 사용하여 SS - DS의 교차점까지 확장 입문서이다. 프라이머 확장 제품은 따라서 G - 오버행의 길이를 제공합니다.
4. 대표 결과 :
검색 T. 기본 인 겔 하이브 리다이 제이션을 사용 brucei telomere G - 오버행 구조
그대로 T. PFGE으로 구분 brucei의 염색체는 그림 3A와 3B (왼쪽 패널)에 표시됩니다. T.는 brucei 세포는 일반적으로 모든 minichromosomes의 ~ 100 사본, 유사한 크기를 (50-150킬로바이트)를 포함하고 젤에 동일한 위치 (MC)로 마이 그 레이션. 이 사실로 인해, TELC oligo 프로브, telomere G - 오버행 신호가 minichromosomes (그림 3A, 중앙 패널)에서 가장 눈에 띄는이다와 하이브리드화 후. TELG oligo 프로브와 하이브리드화 일반적으로 하이브리드화 어떤 신호를 얻을 수 없습니다 (그림 3B, 중앙 패널) 때문에 T. brucei 세포는 telomere C - 오버행 구조가 없습니다. TELC 또는 TELG oligo 프로브 하나와 변성 및 중화, 하이브리드화 모든 염색체 종료 (그림 3A 및 3B, 오른쪽 패널)에 telomere 신호를 공개한다 후에.
어댑터 내고 의해 염기 telomere 터미널 결정
각 차선의 DNA의 동일한 금액을 로딩하면이 분석을 위해 필수적이며, 이것은 젤의 Ethidium의 브로마이드 얼룩으로 표시됩니다. 예를 들어 그림 4A, 왼쪽 패널에 표시됩니다.
이 프로토콜에서 최종 라벨 고유 oligo 및 가이드 oligo 어댑터는 염색체 끝에 출혈도 잡았 때 가이드 oligo와 호환됩니다 시퀀스로 끝나는 telomere G - overhangs. 시 독특한 oligo이 최종 분류는 제정신을, 결합 제품은 방사성하고 강력한 신호를 제공합니다. 그림 4A, 오른쪽 패널에 표시된 차선 1 unique/TG1 어댑터의 대량이 telomere 끝에 출혈도 잡았되었음을 나타내는 강력한 신호를 제공합니다. TG1은 '5'CCCTAA3의 끝 순서가 있습니다. 따라서 telomere G - overhangs는 5'TTAGGG3 '이 어댑터 종료 출혈도 잡았. 결합 제품에 대한 상당한 금액 TTAGGG로 끝나는 telomeres는 T.에 지배되는 나타내는 다른 가이드 oligoes를 사용하지 관찰 brucei 세포.
3 '걸리다 특정 nucleases 아르 엑소 I 또는 엑소 T와 게놈 DNA를 처리, 내고 실제로 telomere에서 이어진 나타내는 내고 제품의 손실 (그림 4A, 오른쪽 패널, 차선 2 & 3) 결과 G - 오버행 구조
결합의 중재 프라이머 확장
내고없이, 최종 레이블 가이드 oligo 22 NT 깁니다. 로딩 종료하면 - 레이블 가이드 oligo는 대조군과 크기의 표식 역할을합니다. (그림 4B, 레인 11, 별표 끝을 나타내는 레이블 가이드 oligo). 우리는 일반적으로 또한 대부분 잔류 이외의 변성 어댑터있는이 대조군 (그림 4B, 레인 11, 오픈 삼각형)에서 ~ 44 NT의 밴드를 관찰합니다. 염색체 끝에 결합 후, 확장 제품의 크기는 G - 오버행 구조의 길이를 나타냅니다. 대부분의 T. 5'TTAGGG3에 brucei telomere G - overhangs 끝 '(그림 4A). 그러나 이러한 G - overhangs이 제품은 더 이상 가이드 oligo 자체 (그림 4B, 레인 10) 이상하지 않는 출혈도 잡았 TG1 가이드 oligo의 연장으로서, (단 ~ 10 NT 길이) 매우 짧은 것으로 나타나지만, 그들은 결합을 허용 TG1 어댑터 (그림 4A, 오른쪽 패널, 레인 1). TG4 어댑터의 단지 소량이 telomere 종료 (그림 4A, 오른쪽 패널, 레인 6) 출혈도 잡았지만, 출혈도 잡았 TG4에서 확장 제품은 긴 제품이 있기 때문에 (그림 4B, 레인 7, 화살표 머리) 훨씬 더 이상 ~ 55 NT. 따라서, 우리는 T.의 telomere 두 가지 유형의 G - 오버행을 관찰 brucei 세포. 하지만 5'TTAGGG3 '의 주된 telomere G - overhangs 엔드 겨우 ~ 10 NT 있습니다. 5'GGGTTA3에 몇 telomere G - overhangs 엔드 '는하지만, 40 NT 길이 최대 개까지하실 수 있습니다. G - 걸리다 두 종류 엑소 T (또는 엑소 I) 치료 (; 그림 4B, 레인 1, 화살표 그림 4A, 오른쪽 패널, 레인 2, 3, 7)에 민감합니다.
그림 1. 기본 인 겔 하이브 리다이 제이션의 원리. 왼쪽, 기본 조건, 최종 분류 TELC oligo 프로브는 단일 좌초 G 풍부한 telomere 오버행과 잡종 수 있습니다. 하이브 리다이 제이션의 강도는 telomere의 G - 오버행의 길이를 나타냅니다. 맞아요, 변성 후, TELC oligo 프로브는 telomere의 DNA와 잡종을 것입니다. 이 하이브 리다이 제이션의 강도는 telomere DNA의 총 금액을 나타냅니다하고 읽어 컨트롤로 사용되며, 최종 G - 오버행 수준은 변성 후 얻은하여 네이티브 하이브리드화 신호를 나누어 계산됩니다.
그림 2. 독특한 여섯 안내 oligoes의 어댑터 내고과 결합의 중재 프라이머 확장의 원리. (A) 시퀀스. (B) 어댑터 내고 의해 염기 telomere 터미널을 확인합니다. 독특한 oligo는 최종 표시된 (빨간색 별표로 표시), 가이드 oligoes에 annealed 및 telomere 끝까지 출혈도 잡았. 독특한 / 가이드 어댑터가 터미널 telomere 순서 어댑터가 출혈도 잡았 수와 호환되는 3 '오버행을지지 때만. (C) 내고 중재 뇌관 확장에서 가이드 oligo는 최종 표시된 (빨간색 별표로 표시)와 염색체 끝을 출혈도 잡았 전에 독특한 oligo에 annealed. 단지 G - 오버행과 호환 3 '오버행을 간직한 독특한 / 가이드 어댑터가 출혈도 잡았 것입니다. ^ 출혈도 잡았 phophordiester 결합을 나타냅니다. unligated oligo의 쌍 제거 후 프라이머 확장 스트랜드 변위와 '5' - 3 exonuclease 활동 부족 T4의 DNA 중합 효소와 함께 진행됩니다. 확장 가이드 oligo의 마지막 길이 따라서 G - 오버행의 길이를 나타냅니다.
그림 3. T. brucei telomere G - 오버행 구조 분석 네이티브로 인 겔 하이브 리다이 제이션. TELC oligo 프로브와 (과)에서 - 겔 하이브 리다이 제이션. TELG oligo 프로브와 (B) 인 겔 하이브 리다이 제이션. 모두에서 (A)와 (B) 왼쪽, Ethedium의 브로마이드 자국 PFG. 중간, 기본 하이브리드화 결과. 맞아, 포스트 변성의 하이브리드화 결과. 야생 형 T. brucei 세포가 사용되었습니다. 전 게놈 DNA를 취급 손상 또는 엑소는 PFGE로 구분했다. 열기 삼각형 megabase 염색체의 약자로, IC, 중간 크기의 염색체, MC, minichromosomes.
"/>
그림 4. T. brucei telomere G - 오버행 구조가 결합 - 중재 뇌관 확장에 의해 분석. (A) 대부분의 T. brucei telomere G - overhangs '는 5'TTAGGG3에 종료할 수 있습니다. 왼쪽 Ethedium 브로마이드 스테인드 DNA 젤. DNA의 약 동일한 금액은 각 레인에로드됩니다. 맞아, 건조 후 동일한 젤의 노출 결과. 그대로, 엑소는 I - 처리 또는 표시와 같은 엑소 T - DNA 처리는 여섯 가지 최종 레이블 가이드 / 독특한 oligo 어댑터 출혈도 잡았습니다. (B) T. brucei의 telomeres 짧은 G - overhangs 있습니다. 손상 또는 엑소 T - 치료를 게놈의 DNA는 T4의 DNA 중합 효소를 사용하여 뇌관 확장 다음 여섯 가지 가이드 / 독특한 oligo 어댑터 출혈도 잡았습니다. 최종 분류 TG4 oligo는 대조군 (레인 11)으로로드되었습니다. oligo 자체는 22 NT (*)를 실행뿐만 아니라 ~ 44 NT (Δ)에 약해요 신호를 주었다. 오직 unique/TG4 어댑터는 상당히 더 이상 가이드 oligo 자체 (화살표 머리, 레인 7) 이상의 확장 제품이 나왔고.
Trypanosoma brucei은 인간의 질병을 자고됩니다. 이 질병은 치료 왼쪽면, 필연적으로 치명적이다. T는 포유류의 호스트에서 brucei 전지는 정기적으로 너무 호스트의 면역 공격 7 피하기 위해 같은 antigenic 변화을 받고있다. 따라서 그것은 T.을 제거하는 것은 매우 어렵습니다 감염되면 brucei 세포가 설정됩니다. 우리는 최근 telomeres가 T.의 표현 규제에 중요...
우리는 과학적인 토론과 통찰력 제안에 대한 박사 캐롤린 가격 감사드립니다. 이 작품은 NIH 부여 AI066095 (비보 리튬 PI)에 의해 지원됩니다.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Name | Company | Catalog Number | Comments | |
SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 | ||
Agarose Type VII (low melting agarose) | Sigma | A4018 | ||
Proteinase K, recombinant, PCR grade | Roche Diagnostic | 03 115801001 | ||
Exo I | NEB | M0293 | ||
Exo T | NEB | M0265 | ||
T7 exonuclease | NEB | M0263 | ||
T4 DNA polymerase | NEB | M0203 | ||
QIAquick nucleotide removal kit | Qiagen | 28304 |
JoVE'article의 텍스트 или 그림을 다시 사용하시려면 허가 살펴보기
허가 살펴보기This article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. 판권 소유