RNAi הקרנת עבור גורמים מארח מעורב Vaccinia וירוס זיהום באמצעות תסיסנית תאים

Summary

המארח רומן הגורמים המעורבים זיהום ויראלי ניתן לזהות דרך אובדן גנום רחב מבוססי תאים של ההקרנה RNAi לתפקד. תסיסנית תרבות מודל התא הוא נוח במיוחד גישה זו בשל הקלות והיעילות של RNAi. כאן אנו מדגימים את הטכניקה הזו באמצעות Vaccinia וירוס כדוגמה.

Abstract

פתוגנים ויראליים מהווים איום משמעותי על בריאות הציבור, לא רק וירוסים יכולים לגרום מגיפות טבעי של מחלות אנושיות, אך השימוש הפוטנציאלי שלהם טרור ביולוגי היא גם דאגה. הבנה טובה יותר של הגורמים הסלולר כי השפעת זיהום יקל על פיתוח נחוצה הרפוי. התפתחויות אחרונות בתחום הטכנולוגיה RNA (RNAi) הפרעה יחד עם רצף הגנום המלא של אורגניזמים אחדים הובילה אופטימיזציה של הגנום כולו, מבוססי תאים הפסד של פונקציה המסכים. תאים תסיסנית הנוחות במיוחד הגנום בקנה מידה מסכי בגלל הקלות והיעילות של RNAi במערכת זו ^1. חשוב לציין, מגוון רחב של וירוסים יכולים להדביק תאים תסיסנית, כולל מספר וירוסים יונקים בעלי חשיבות רפואית חקלאי ^2,3,4. הקודם מסכי RNAi ב תסיסנית זיהו גורמים מארח הנדרשים בפעולות שונות על זיהום בנגיף כולל כניסה, תרגום, שכפול רנ"א ^5. יתר על כן, רבים מן הגורמים הסלולר נדרש שכפול נגיפי בתרבות התא תסיסנית גם הגבלת בתאים אנושיים נגועים אלו וירוסים ^{4,6,7,8, 9.} לכן, זיהוי של גורמים מארח לאייש במהלך זיהום ויראלי מציג מטרות הרומן ותרופות אנטי. כאן אנו מציגים פרוטוקול כללית עבור מסך RNAi תפוקה גבוהה לזהות גורמים הסלולר מעורב זיהום ויראלי, באמצעות וירוס vaccinia כדוגמה.

Protocol

חלק 1: RNAi ב 384 צלחות טוב

1. התקינה של חומרים כימיים המשמשים ההקרנה היא חיונית. אנחנו בודקים הרבה הפרט התקשורת של שניידר, בסרום שור העובר, וכן חומרים כימיים מכתים. אז אנחנו aliquot ולהשתמש הרבה באותו המסך כולו.
2. במשך כל assay, עדיף לבדוק כמה שורות תאים שונות כדי לקבוע אילו הוא נוח ביותר לקריאה מתוך הביולוגי שלך. אנו משתמשים בדרך כלל את קו-S2 DRSC.
3. לגדל תאים תסיסנית במהירות של 25 ° C בתקשורת שניידר להשלים.
   1. שניידר התקשורת
   2. חום FBS 10% מומת
   3. 1X-L-גלוטמין
   4. 1X פן / דלקת אנטיביוטיקה
4. תאים תסיסנית הם חצי חסיד והם passaged ללא trypsinization כל ארבעה ימים על ידי pipetting התאים את צלוחיות ו דילול תאים 1:10 לתוך בקבוק טרי. תאים צריכים להיות בשלב יומן לניסויים.
5. פלייט אל הצלחת יום יומית השתנות הן מזעריות באמצעות טיפול הנוזל אוטומטית כל התוספות נוזל רב גם הצלחות. אנו משתמשים WellMate (מטריקס).
6. הכן צינורות WellMate.
   1. תרסיס ברדס WellMate עם אתנול 70%.
   2. הסר צינורות מהאריזה ולרסס עם אתנול 70%.
   3. הכנס קלטת צינורות ב מחלק עמדה על WellMate.
   4. צינור ראש עם 25 מ"ל של אתנול 70%.
   5. לעקר צינורות באתנול במשך 15 דקות, ולאחר מכן עם ראש הממשלה עוד 25 מ"ל של אתנול.
   6. לשטוף בצינור על ידי תחול עם 50 מ"ל של PBS סטרילית.
7. לסלק תאים מן הבקבוק ולספור. תאים גלולה, כך יש לך 25% יותר מאשר הצורך (300xg, 5 דקות). מספר תאים seeded לכל טוב חייב להיות מותאם על פי אורך assay. כאשר עורכים ניתוח התמונה אוטומטית, monolayer יחיד עם תא clumping לא אידיאלי פילוח התמונה.
8. Resuspend תאים pelleted בסרום ללא מדיה של שניידר בבית 1.7x10 ⁶ תאים / מ"ל.
9. אנו מבצעים את המסך ב 384 צלחות היטב מראש aliquoted עם ספרייה זמינים מסחרית של dsRNA בריכוז של 250ng/well. בארות כמה כל צלחת נותרים ריקים עבור פקדים, אשר מתווספים באופן ידני. אנו משתמשים dsRNA כדי בלוציפראז כביקורת שלילית. אנו משתמשים dsRNA נגד אשכול (dIAP) כביקורת על החזקה RNAi. להפיל זה אנטי אפופטוטיים תוצאות גורם מוות של תאים דרמטית היא דרך ויזואלית מהירה להעריך את איכות לדפוק למטה. לבסוף, אנו משתמשים dsRNA נגד הכתב ויראלי, במקרה הזה בטא galacosidase, כביקורת חיובית כדי לאמת כי אנו יכולים למנוע זיהום ויראלי באמצעות assay שלנו לקריאה החוצה. אם אכון dsRNA לתוך צלחת בזמן זריעת תאים, 1 aliquot dsRNA μl לפינה הבאר על מנת לאפשר ראיה קל, אז צנטריפוגות dsRNA אל תחתית הבאר (300xg, 1 דקות) לפני הוספת תאים.
10. השתמש WellMate להוסיף 10 תאים μL מוכן היטב מעל כל אחד.
11. ספין התאים לצלחות ידי centrifuging 300xg, 1 דקות.
12. דגירה של 25 ° C בחממה במשך 45 דקות.
13. הוסף מדיה 20 μL שלם של שניידר צנטריפוגות 300xg, 1 דקות.
14. צלחות מקום humidified מיכלי פלסטיק מלאים מים ספוג מגבות נייר. נפח של 384 גם הוא קטן, ולכן אידוי יכולה להיות השפעה גדולה על הביולוגיה, אשר בתורו יכול להוביל שינויים artifactual ב-outs לקרוא את בארות קצה. כדי להתגבר על זה, צלחות צריך להישמר תחת לחות גבוהה.
15. דגירה במשך שלושה ימים כדי לאפשר מציאה חזקים. אין צורך לשנות את התקשורת או לפתוח מכולות humidified בתקופה זו.

חלק 2: הדבקה עם וירוס Vaccinia

1. לעקר מרובת ערוצים aspirator ב Quatricide במשך 15 דקות, ואז לשטוף באתנול 70%.
2. הכן WellMate כמתואר לעיל.
3. הכן התקשורת של שניידר עם 2% FBS נגוע דילול מלא בתקשורת 01:05 בתקשורת חופשית בסרום.
4. מניות סינון וירוסים גולמי באמצעות מזרק 0.8 אממ לסנן להסיר פסולת הסלולר או להשתמש וירוס מטוהרים.
5. מדולל וירוס vaccinia בתקשורת 2% בסרום של שניידר להשיג ריבוי של זיהום (משרד הפנים) 2.
6. הסר PBS מתוך צינורות WellMate, וראש בווירוס מדולל עד בצינור ללא בועות אוויר.
7. השתמש מעוקרים מרובת ערוצים aspirator ו סעפת ואקום כדי להסיר בעדינות התקשורת מהצלחות של dsRNA שטופלו בתאים תסיסנית.
8. לוותר על 30 לכל וירוס μL גם על הצלחות באמצעות WellMate.
9. צנטריפוגה צלחות 1 דקות ב 300xg.
10. לעקר צינורות WellMate. ראש עם 25 מ"ל של blea 10%ch, להמתין 10 דקות, ממשלה עם אקונומיקה עוד 25 מ"ל 10%.
11. צינור ראש עם 50 מ"ל מים ואחריו 50 מ"ל אתנול 70%. חזור אל צינורות האריזה שלו.
12. חזור צלחות קופסת פלסטיק humidified. דגירה של 25 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות.

חלק 3: פלטות מכתים

1. תקן צלחות בפורמלין 15% μL 4 / PBS למשך 10 דקות. נוזלי מוסר באמצעות aspirator מרובת ערוצים ו סעפת ואקום בכל שלב. לאחר הצלחות תוקנו, ציוד סטרילי ריאגנטים אינם נחוצים עוד.
2. הסר לתקן ולהשתמש WellMate להוסיף 30 PBST μL (PBS + 0.1% Triton-X). דגירה 10 דקות וחזור. Operate WellMate כמתואר לעיל, למעט צינורות לא צריך לעבור עיקור.
3. כדי לזהות זיהום vaccinia נשתמש כתב β-galactosidase מונע על ידי האמרגן vaccinia מוקדם / מאוחר.
4. הסרת תאים נוזלי דגירה בבלוק (PBST עם BSA 2%) במשך 10 דקות.
5. מדולל הנוגדן העיקרי לחסום, להסיר נוזלי להוסיף 15 נוגדן μL כדי pipettor גם שימוש רב ערוצי כל לחזור (מטריקס).
6. ספין למטה צלחות (300xg, 1 דקות), לכסות עם מדבקה ברורה, דגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
7. הסר נוגדן ראשוני, ולהשתמש WellMate לשטוף בארות PBST 3 פעמים, 10 דקות כל אחד.
8. מדולל נוגדנים משני שכותרתו fluorescently (FITC) ו גרעיני כתם בבלוק, ולהוסיף 15 μL לבארות באמצעות Multi-channel לחזור pipettor.
9. צלחות דגירה 1 שעה בטמפרטורת החדר, מוגן מפני אור.
10. לשטוף בארות PBST 3 פעמים, 10 דקות כל אחד באמצעות WellMate.
11. חותם צלחת עם מדבקה לכסות ברור, ולאחסן ב 4 ° C עד שלושה שבועות.

חלק 4: הדמיה וניתוח תמונה

1. שימוש במיקרוסקופ בהגדלה 20X אוטומטית אל צלחות התמונה.
2. צלמו תמונות של גרעינים הכולל (DAPI) לבין תאים נגועים (FITC). מטב את זמן החשיפה לכל ערוץ בנפרד על מנת למקסם טווח דינמי.
3. לכוונן את פונקציית המיקוד האוטומטי על ידי לקיחת Z ערימה של תמונות, 1um ברווח מזה, כי ההיקף המטוסים מעל ומתחת למישור הצפוי של המוקד. ברגע שהמטוס נמצא מוקד אופטימלי, פוקוס אוטומטי להתאים את ההגדרות בהתאם.
4. תמונה את הצלחת כולה, לכידת לפחות שלוש תמונות לכל היטב הן את ערוץ Hoechst (DAPI) ואת ערוץ וירוס (FITC). בחירת האתרים מאזורים שונים בתוך שנה אחת גם כדי ללכוד תמונות שמייצגות את גם כולה.
5. השתמש MetaXpress תוכנה לכתוב יומן לפלח את התמונה והשתמש גרעינים מודולים הרוזן כדי לחשב את המספר הכולל של תאים חיובית מכתים גרעיני (תאים סה"כ) וזיהום (FITC) עבור כל צלחת.
6. חישוב זיהום אחוז (100 תאים * FITC חיובי / סה"כ) והיכנס לשנות.
7. כדי לזהות מועמדים אנו משתמשים ציון חזקים Z מבוסס על טווח חציון interquartile של כל צלחת. שיטה זו היא רגישות חריגים ונתונים nonsymmetric, ולכן מספק כוח גדול יותר בזיהוי אפילו מכה חלשה או בינונית 10. במשך כל צלחת, החציון הוא ונוכו מנתוני log-טרנספורמציה. ואז הערכים שהתקבל מחולקים לפי 0.74 פעמים את טווח interquartile (ההפרש בין הערכים של האחוזון ^ה 75 לבין אחוזון 25 ^ה). גורם 0.74 משמש הפצה משוער נורמלית סטנדרטית.
8. הציון חזקים Z הוא מדד של מרחק סטיות תקן מן הממוצע של הצלחת. לדוגמה, החזקה Z-ציון של 2% מצביע על זיהום של הבאר הוא ~ 2 סטיות תקן מן החציון צלחת או p <0.05.
9. נתח מספר תאים כדי לזהות המועמדים ציטוטוקסיות. חישוב הציון חזקים Z של ספירת גרעיני. מועמדים בעלי החזקה Z <ב -2 מסכי לשכפל נחשבים ציטוטוקסיות.
10. וולס כי יש ציון חזקים Z לזיהום אחוז> 2 או <ב -2 מסכי כפולות (p <0.0025) ללא cytotoxicity נחשבים מועמדים פוטנציאליים מהמסך הראשי.
11. מועמדים חיובית מאומתים באמצעות ריאגנטים עצמאית. dsRNAs נוצרות נגד גנים עניין מאזור אחר של mRNA ונבדק לעיל.
12. גנים אלה עבור שבו שני dsRNAs עצמאית יש פנוטיפ זהה יכול להיחשב למחקר נוסף.

חלק 5: תמונות נציג ופרשנות של בשיעורי הזיהום

באיור 1. בארות נגוע לא מראים מכתים עבור חלבונים vaccinia וירוס, בעוד נציג נגועים גם מכיל תאים מכתים חיובית vaccinia, הביע חלבון (βgal) בטא galactosidase, כפי שנמדד על ידי מיקרוסקופ immunofluorescence.וירוס = ירוק, כחול = גרעיני.

איור 2. תוכנה אוטומטיות ניתוח התמונה מכמת זיהום כל תמונה באמצעות פרמטרים הנקבעים על ידי המשתמש. בתמונה נציג, המספר הכולל של גרעין התא ואת מספר התאים לבטא אנטיגן נגיפי נספרים בהתבסס על גודל ועוצמת מכתים מעל מכתים את הרקע המקומי.

איור 3. מציאה של חוט (dIAP) משמש כביקורת חיובית דלדול RNAi החזקה של גני מטרה. מציאה של גורם אנטי אפופטוטיים זה מוביל מוות של תאים דרמטי. גרעינים = כחול.

איור 4. מציאה של בלוציפראז משמש בקרה שלילית ההשפעה של טיפול RNA פעמיים תקועים על זיהום. דלדול בלוציפראז אין כל השפעה על זיהום ביחס לתאים אינה מטופלת כראוי. וירוס = ירוק, כחול = גרעיני.

איור 5. מציאה של חלבון βgal משמש שליטה חיובית לצמצום הזיהום, שכן assay משתמשת רמות החלבון βgal כמו לקרוא בקול של זיהום. דלדול של תוצאות βgal לירידה באחוז התאים הנגועים. וירוס = ירוק, כחול = גרעיני.

איור 6. מציאה של הסלולר Rab5 תוצאות גורם לירידה באחוז התאים הנגועים. מאז Rab5 ידוע להשתתף אנדוציטוזה, גורם זה עשוי תורם כניסה וירוס vaccinia. זה מייצג outlier דוגמה מן המסך. וירוס = ירוק, כחול = גרעיני.

Discussion

הגנום כולו ההקרנה RNAi ב תסיסנית מספק שיטה חזקה ויעילה לבחינת רכיב הסלולר של זיהום ויראלי. מספר וירוסים להדביק תאים יונקים תסיסנית, אשר ניתן להשתמש בהם כדי לזהות את המרכיבים של התגובה החיסונית המארח מהותי, וחלבון מארח הגורמים הנדרשים שכפול נגיפי זה עשוי לייצג מטרה טיפולית חדשנית. לפני ביצוע מסך, assay חייב להיות מותאם בקפידה את סוג התא, מספר התאים, רמת זיהום, חייבים להיות מבוקרים היטב, כולל חיוביים ושליליים נגיפיים ¹¹ יעדים סלולריים. חשוב להבטיח הפרדה מספקת בין בקרות חיוביות ושליליות לפני ההקרנה על מנת למקסם את הטווח הדינמי של assay. לאחר מסך שבוצעה, המועמדים יכולים להיות מחולקים לקטגוריות תפקודית כדי לקבוע אילו מנגנוני מארח לתרום לזיהום. עבור וירוסים יונקים כגון vaccinia, התרומה של homologs יונקים ידי RNAi צריך להיקבע במסגרת ניתוח משני. יחדיו, אלה שיטות ההקרנה החזקה תאפשר לנו לקבל תובנות לגבי מנגנונים מורכבים על ידי וירוסים אשר אינטראקציה עם תאים המארח שלהם.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell culture
Schneider’s media	GIBCO, by Life Technologies	11720
GlutaMAX 100X	GIBCO, by Life Technologies	35050
Penicillin/streptomycin (pen/strep)	GIBCO, by Life Technologies	15140
Fetal Bovine Serum (FBS)	Sigma-Aldrich	F6178
Screening
Genome-wide dsRNA library	Ambion
384 well plates, black with clear bottom	Corning	3712
Aluminum seals	Corning	6569
Clear seals	Denville Scientific	B1212-4
Well Mate	Matlab	201-10001
24 pin manifold	Drummond Scientific	3-000-101
H–chst 33342	Sigma-Aldrich	B2261
Fluorescently-labeled secondary antibodies	Invitrogen
ImageXpressMicro automated microscope	Molecular Devices
MetaXpress image analysis software	Molecular Devices