ממברנה פוטנציאלים, התגובות Synaptic, המעגלים הנוירונים, Neuromodulation ו היסטולוגיה שרירים שימוש סרטן הנהרות: מעבדה תרגילים סטודנטים

Summary

הניסויים להפגין גישה נוחה לסטודנטים לצבור ניסיון לבחינת מבנה השריר, תגובות הסינפטי, את ההשפעות של הדרגתיים יונים חדירות על פוטנציאל הממברנה. כמו כן, חושית-CNS-מנוע שריר מעגל מוצג להראות אמצעי לבחון השפעות של חומרים במעגל עצבי.

Abstract

מטרת דו"ח זה היא לעזור לפתח הבנה של ההשפעות שנגרמו הדרגתיים יונים על פני קרום ביולוגי. שני היבטים המשפיעים על פוטנציאל הממברנה של התא שבו אנו כתובת בניסויים אלה: (1) ריכוז של יון ⁺ K בצד החיצוני של הקרום, ו (2) את החדירות של הממברנה ליונים מסוימים. סרטנים שרירי הבטן extensor הם קבוצות עם טוניק קצת להיות (לאט) ואחרים phasic (מהר) ב פנוטיפים ביוכימיים פיזיולוגיים שלהם, כמו גם במבנה שלהם; הנוירונים המנוע innervate השרירים האלה הם שונים בהתאם במאפיינים פונקציונליים. אנו משתמשים בשרירים אלו, כמו גם את השריר השטחי מכופף טוניק, הבטן כדי להדגים נכסים בשידור סינפטי. בנוסף, אנחנו מציגים חושית-CNS-הנוירון המוטורי, השריר המעגל כדי להדגים את ההשפעה של גירויים חושיים cuticular כמו גם את השפעתם של neuromodulators על היבטים מסוימים של המעגל. בעזרת טכניקות השיג בתרגיל זה, אפשר להתחיל לענות על שאלות רבות שנותרו ההכנות ניסיוני אחרים, כמו גם ביישומים פיזיולוגיים הקשורים לרפואה ובריאות. אנחנו הדגימו את התועלת של ההכנות חוליות מודל במטרה לענות על שאלות יסוד הנוגעות לכל בעלי החיים.

Protocol

1. הקדמה

מטרות אלה הן תרגילי מעבדה כדי להבין את המאפיינים של ממברנות להתרגש, הבסיס היוני של פוטנציאל הממברנה במנוחה, שיטות למדוד את פוטנציאל הממברנה. בנוסף, מכתים ו היסטולוגיה של שריר מוצגת, אשר ניתן להשתמש בהם כדי ללמד במבנה השריר. כמו כן, שני סוגים שונים של תכשירים גזור משמשים כדי להדגים תכונות ההולכה הסינפטית בקבוצות שרירים שונות. מערכת שלמה חושית-העצבים המרכזית (CNS), מנוע תא עצב, שריר מעגל בבטן סרטנים משמש גם להציג הכנה לבחינת גירוי חושי את ההשפעה של neromodulators ונוירוטרנסמיטרים על היבטים של מעגל.

החלק הראשון של דו"ח זה מציג את גישות למדידת פוטנציאל הממברנה מנוחה השפעת ⁺ K תאיים על פוטנציאל הממברנה. אנו גם מציגים את מבנה השריר. בחלק השני של התרגיל הזה, אנו מציגים באמצעים שונים למדידת התגובות הסינפטי מסוגים שונים של neuromuscular צמתים (NMJs). התרגיל הראשון משתמשת סרטנים שרירי הבטן extensor והשנייה משתמשת שרירי הבטן מכופף שטחית. בנוסף, אנו מציגים המעגל העצבי (חוט העצב הגחון של סרטנים עם תשומות ותפוקות חושית מוטורית), כי הוא קל לשמור, ואשר יכול לשמש ההוראה, וכן למחקר בהיבטים שונים של חושי-CNS הנוירון המוטורי, שרירים מעגל. לאחר שסיים את ההסבר של התרגילים הראשונים, אנו מציגים את הפיזיולוגיה של NMJs ואת מעגל CNS.

ההדרגתיות של יונים על פני קרום ביולוגי יכול לגרום להבדל פוטנציאליים. עבור התא במנוחה, הבדל זה מטען חשמלי על פני קרום התא נקרא פוטנציאל הממברנה המנוחה של התא. ישנם שני גורמים עיקריים נעסוק המשפיעים על פוטנציאל הממברנה של התא. הראשון הוא ריכוז יונים משני צדי הממברנה. השני הוא חדירות יוניים של הממברנה. חשוב לזכור כי בתא החי יש מספר יונים שונים בריכוזים שונים בתוך ומחוץ לתא. יונים מפתח נעסוק הם נתרן (Na ^+), אשלגן (K ⁺⁾ ו כלוריד (Cl-). כמויות התנועה של אלה יונים דרך הממברנה שריר קובעת את פוטנציאל הממברנה. מתוך בסיס זה, אנו יכולים לטפל פוטנציאלים חשמליים שנצפו במהלך עיכוב עירור חשמלי של קרום מן התגובות הסינפטי ולבחון את ההשפעות של סוכנים תרופתי. אנחנו גם יכולים לבנות מודלים biophysical כדי לייצג את התהליכים האלה למושגים בדיקה ניסיונית (Robinson et al. 2010).

השימוש microelectrodes זכוכית נימי היתרי הקלטה של ​​פוטנציאל הממברנה. אלקטרודה יכול להיות מוכנס דרך קרום התא ללא נזק, מתן טיפ קטן מספיק מדד מדויק של פוטנציאל הטרנסממברני ניתן להשיג. הטכניקה ישימה במיוחד תאים גדולים, נוטים פחות להיפגע על ידי החדרה של האלקטרודה תאיים. זוהי אחת הטכניקות חיוני בפיזיולוגיה.

יתרת Na + ו K + דרך הממברנה נשמר על ידי משאבת Na-K ATPase בתנאים פיזיולוגיים. בתנאים רגילים נע משאבה, בממוצע, שלושה Na + מתוך תא ושני + K לתוך התא. בתור הערה צדדית, חתן פרס נובל בכימיה הוענק בשנת 1997 על גילוי זה עשוי לחזור בסוף 1950 של. יסודות של גילוי נלקחו מתוך מחקר באמצעות אקסונים של סרטן (Skou, 1965, 1998).

משאבה זו נחשבת גם electrogenic שכן יש יכולת גדולה יותר כאשר המשאבה הממברנה הוא depolarized (Skou, 1989a, b). בתאים רבים, המשאבה מזרז כאשר התא מופעל על ידי שלילת קוטביות חשמלית.

אשלגן יכול גם לעבור דרך תעלות אשלגן "דליפה", ואילו תא נמצא במצב מנוחה. בשל הערוצים הללו דליפה אשלגן, קרום התא במנוחה הוא חדיר יותר אשלגן מאשר יונים אחרים. לפיכך, פוטנציאל הממברנה המנוחה של התא קרוב יותר לפוטנציאל שיווי המשקל של אשלגן מזה של נתרן. פוטנציאל הממברנה מנוחה לאחר מכן ניתן לבחון כדי לראות אם זה תלוי פוטנציאל שיווי משקל אשלגן.

1) שרירים שונות

סיבי שריר סרטנאים להראות השתנות גדולה יותר של תכונות מבניות, תכונות הממברנה חשמל נכסים מאשר התכווצות סיבי שריר בעלי חוליות. סיבי שריר Phasic ב סרטנים משתנים עבור עווית מסוג הצירים. הם מאופיינים באורך sarcomere קצר (2-4 מיקרון), רזה, ישר Z-קווים, יחס נמוך של דקה myofilaments עבה, מערכות מפותחת של T-tubules ואת sarcoplasmicreticulum. Phasic סיבים ממברנות השריר עלול ליצור פוטנציאל פעולה מדורגים או הכל או לא כלום. סיבי שריר טוניק, לעומת זאת, משתנים לצורך תחזוקה ממושכת של מתח. הם לעתים קרובות יש sarcomere באורכים של 10 עד 15 מיקרון, עבה, גלי Z-קווים, יחס גבוה של דקה myofilaments עבה, מערכות מפותחות פחות טוב של T-tubules ואת reticulum sarcoplasmic. שריר טוניק ממברנות סיבים הם לעתים קרובות inexcitable חשמלית, או שהם עשויים להפיק התגובות חשמל מדורגים ("קוצים ציון"). מגוון רחב של סוגי סיבים ביניים נמצא השרירים סרטנאים.

2) משוואות

משוואות אשר משמשות כדי לקבוע את פוטנציאל שיווי המשקל של פוטנציאל הממברנה יונים הם נחים משוואת נרנסט ואת גולדמן הודג'קין כץ (GHK) המשוואה בהתאמה. הבחנה חשובה בין שתי המשוואות היא משוואת נרנסט משמש רק יון אחד ספציפי כדי לקבוע את פוטנציאל שיווי המשקל של יון זה, ואילו את המשוואה GHK משמש כדי לקבוע את פוטנציאל המנוחה על ידי בהתחשב חדירות של יונים מספר והדרגות שלהם על פני קרום התא (נרנסט, 1888, 1889; גולדמן, 1943; הודג'קין לבין הקסלי, 1952; הודג'קין et al, 1952;. הודג'קין וכץ, 1949; לראות Hille, 1992).

משוואת נרנסט נחשבת בדרך כלל עבור יונים דרך הממברנה ליצירת כוח electromotive כפי שמוצג בכינויו:

V = (RT / ZF) ln ([X] _את / [X] _ב)

X = יון של עניין
V = מתח שיווי המשקל של יון X על פני קרום
R = קבוע הגז [8.314 J / (mol • K)]
T = הטמפרטורה המוחלטת [קלווין]
Z = הערכיות של יון
F = קבוע פרדיי של [9.649 x 10 ⁴ C / mol]

עבור K ⁺ יון ב 20 ° C ו הטרנספורמציה של Ln התחבר ל ₁₀ יחד עם מילוי קבועים, אחד מגיע:

פוטנציאל = 58 log ([K _ב] / [K _{החוצה]);} לידי ביטוי mV

נניח ⁺ K רק permeant ידי דיפוזיה. [K _ב] הוא ריכוז K ⁺ בתוך התא ו [K _החוצה] הוא K ⁺ ריכוז בצד החיצוני של התא.

כאשר אומדן תרגיל [K _ב]. ______________

נניח לצורך חישוב זה, פוטנציאל הממברנה תלויה רק פוטנציאל ⁺ K שיווי משקל.

בהתחשב [K _החוצה] = עבור מלוחים בשימוש הוא 5.4 מ"מ. כמו כן, להניח פוטנציאל הממברנה הוא-70mV.

פוטנציאל = 58 log ([K _ב] / 5.4).

בניסוי אנו מודדים פוטנציאל הממברנה של התא נחים ולקבוע איך זה השפיע על ידי שינוי [K _החוצה]. השיפוע של קו היפותטי הקשורים פוטנציאל הממברנה [K _החוצה] הוא 58. לאחר איסוף נתונים על פוטנציאל הממברנה מנוחה בבית שונים [K _החוצה] (נע בין 5.4 מ"מ mM 100) ואנו העלילה ערכים נצפתה כדי לקבוע אם יש התאמה עם קו היפותטי. נשתמש פוטנציאל ממוצע קרום מנוחה המתקבל mM 5.4 [K _החוצה] ליזום את הקווים היפותטיות נצפתה להשוואה.

בהתחשב בכך קרום חדיר ניתן יון יותר במנוחה, כמו גם מדינות depolarized שונים, אחד השימושים המשוואה GHK לקחת בחשבון את החדירות (P במשוואה) עבור יונים שונים. המשוואה GHK תפחית למשוואת נרנסט אם קרום חדיר הוא יון אחד בלבד.

הנה המשוואה GHK כללית עבור Na ^+, K ⁺ ו Cl ^- יונים:



מאז Cl ^- יש מטען שלילי, בטווח הריכוז הוא הפוך במשוואה עבור מבפנים וגם מבחוץ. זה מאפשר Z (תשלום יון) להיות הופסק.

3) מטרות התרגיל הזה

בניסוי זה אנו מודדים את פוטנציאל הממברנה של תא השריר סרטנים וליישם את העקרונות שנדונו לעיל לכתובת:

1. כיצד למדוד פוטנציאל קרום התא עם מכשור הטכניקה המתאימה.
2. יון החדירות של קרום התא שריר, ואיך זה תורם לפוטנציאל הממברנה.
   
   בנוסף, אנו נעשה מחקר ראשוני של מבנה השריר:
3. השתמש כתמים כדי להדגיש את האנטומיה של השרירים בהיבט הגבי של הבטן סרטנים, המשמש לביצוע הניסויים האלה אלקטרו.
4. בדוק את היסטולוגיה של סוגי סיבים שונים בשריר.

בתרגיל זה במעבדה, נשתמש סרטנים שרירי הבטן extensor. הכנה זו שימשה בעבר ללמד עקרונות אלה בפיזיולוגיהד אנטומיה (אטווד פרנס, 1968). השתמשנו רבות של הליכים ממקור זה ואחרים שונה כדי להתאים מכשור הנוכחי כדי להשלים את מטרות תקופה מעבדה יחידה 3 שעות סטודנט. תרגילים אלה הם בסיס ניסויים אחרים המשמשים במהלך בעלי חיים פיזיולוגיה במחלקה לביולוגיה באוניברסיטת קנטאקי (מנחה ד"ר RL קופר, 2010).

4) למה זה חיה מודל

ישנן כמה סיבות טובות לשימוש סרטנים שרירי הבטן extensor בניסוי זה:

1. סרטן הנהרות זמינים בדרך כלל הם זולים יחסית קל לשמור בתנאי מעבדה.
2. דיסקציה היא קלה יחסית לסטודנטים ללמוד טכניקות לנתיחה להכנות לחיות.
3. השריר הוא יציב במשך כמה שעות מלוחים נורמלי מינימלי המשמש גם לסטודנטים ללמוד טכניקות אלקטרו. הכנת השרירים חזקים למדי כאשר חיצוניים [K +] משתנה לפרקי זמן קצרים.
4. התגובות סינפטיים שונים ניתן להשיג בקלות על ידי המרצת הנוירונים המנוע.
5. הסידור האנטומי של השרירים פושטי קל להבחין, ובשל גודל גדול שלהם קל יחסית להשיג הקלטות תאיים יציב.
6. השרירים ואת תבנית העצבוב ניתן להבחין בקלות עם מכתים מתילן כחול. בנוסף, במיוחד סיבים סוגי שרירים יכול להיות מעובד בנקל על היסטולוגיה כדי לבחון את מבנה sarcomere.
7. בפרוטוקולים אין חיה יש צורך בשלב זה עבור ההכנות בעלי חיים חסרי חוליות בניסויים במעבדה במוסדות רבים בתוך ארה"ב.

2. שיטות

1) חומרי

• מספריים (1)
• מלקחיים (1)
• חוט חוט כסף עבור הקרקע (1)
• מיקרוסקופ (1)
• אלקטרודה בדיקה (1)
• צלחת פטרי עם Sylgard בתחתית (1)
• הפתרון מלוחים (1)
• פתרונות אשלגן: 5.4mM (מלח רגיל), 10, 20, 40, 80, 100 מ"מ
• Bleach (כמות קטנה, השתמש קצה של חוט כסף לבנות Ag-Cl)
• זכוכית פיפטה (1), להסיר ולהוסיף פתרונות
• מזרק (1)
• מגבר / מערכת רכישה (1)
• פאראדיי קייג' (1)
• Desktop / נייד (1)
• Dissection סיכות (4)
• לנגוסטין

2) שיטות

2.1) ההכנה / Dissection:

1. סרטנים כ 60-10 ס"מ אורך הגוף צריך לקבל (או גודל לניהול). החזק את סרטנים בחלק האחורי של הראש או כ סנטימטר מהחלק האחורי של העיניים. ודא טפרים של סרטנים או הפה שלה לא יכול להגיע אדם בטיפול סרטנים. (סרטנים עשוי להיות ממוקם בתוך קרח כתוש במשך 5 דקות להרדים אותו לפני לחתוך לו את הראש.)
2. השתמש במספריים גדולים כדי להסיר במהירות את הראש. ביצוע חתך נקי ומהיר מאחורי עיניו של סרטנים. השלך את הראש הנספחים.
   
   באיור 1. תמונה מראה מיקום החתך כדי להסיר את ראשו של סרטנים.
3. רגליים וטפרים של סרטנים ניתן להסיר בשלב זה כדי למנוע פציעה. Stylets על זכרים swimmerets משני זכרים ונקבות ניתן גם להסיר (איור 2). בשלב הבא, להפריד את הבטן מהחזה. ביצוע חתך לאורך הממברנה לבטא שמחבר את הבטן ואת בית החזה (איור 3). שמור את החלק של הבטן סרטנים ואת להיפטר של בית החזה.
   
   איור 2. מספריים הם חיתוך stylets. אלה ניתן להסיר סרטנים.
   
   איור 3. תמונה מראה את מיקום החתך כדי להסיר את החזה של הבטן.
   
   איור 4. הסרה של בית החזה של הבטן. לחתוך צריך להיעשות בצורה מעגלית לאורך הקו את הצטרפותו המגזרים.
   
   איור 5. התמונה למעלה מראה את הבטן עם הנספחים swimmeret. התמונה התחתונה מראה את הבטן בלי הנספחים swimmeret.
4. עם הבטן, חתך צריכה להיעשות במעטפת לאורך הגבול התחתון לרוחב של כל צד של הבטן. יש להקפיד לא לחתוך עמוק מדי לתוך סרטנים. כדי לסייע בתהליך של חיתוך הקליפה, לחתוך את צריכה להיעשות עם המספריים מצביעים מזלזלות כלפי מטה בצד הגחוני ואת בזווית. בצע את תבנית מעטפת טבעית של קווי סרטנים כי בטווח האורך של כל קטע (איור 6).
   
   איור 6. מספריים ממוקמות בזווית ופעל יישור הטבעית של הקליפה. לא לחתוך עמוק מדי ולהרוס את ההכנה. חץ ראשי הצבע על הקו הטבעי לאורך כל קטע זה צריך להיות במעקב במשך הקיצוצים.
5. הסר את החלק הגחוני של הקליפה. יש להיזהר שלא להרוס את שרירי הבטן. שימוש במלקחיים כדי להסיר את החלק הגחוני. כאשר החלק הגחוני של הקליפה מוסרת, גוש לבן של רקמה ניתן לראות על גבי השרירים מכופף עמוק. רקמה זו ניתן להסיר בזהירות עם מלקחיים.
   
   איור 7. הסרת החלק הגחוני של הקליפה עם מלקחיים. משוך למעלה ואחורה בחלק הגחוני להסיר. אל תהרוס את שרירי תחת מעטפת הגחון.
   
   איור 8. הסיט בחלק הגחוני של הקליפה אשר הוא להיות מושלך.
   
   איור 9. חותכים את החלק הגחוני של הכנת במספריים וזורקים.
6. במערכת העיכול, צינור קטן רץ לאורך קו האמצע של שרירי מכופף עמוק, ניתן להסיר סרטנים. צבוט את החלק העליון של דרכי עם מלקחיים ו להינתק הבטן. חותכים את החלק התחתון של המעי - בסוף הזנב. שוטפים את דיסקציה עם מלח כדי להבטיח את פסולת הצואה אינה מפריעה ההכנה.
   
   איור 10. תמונה מראה את הסרת העיכול מן ההכנה.
7. השתמש סיכות לנתיחה כדי לאבטח את הכנה כדי בצלחת פטרי. פינות העליון והתחתון של התכשיר אמור להיות מרותקים אל המנה. תמיסת מלח צריכה להיות שפך לתוך צלחת פטרי לכסות את הכנת לחלוטין עד הקלטות תאיים מבוצעות.
   זו מנה לנתיחה צריך ציפוי (Dow Corning) Sylgard בתחתית (1cm עבה), כך סיכות חרק יכול להיות תקועה בו.
   ההכנות גזור שטופים מלוחים סרטנים רגיל, שונה מן הפתרון של ואן Harreveld (1936), אשר הוא עשה עם 205 NaCl; 5.3KCl; 13.5 CaCl _2: 2H ₂ O, 2.45 MgCl _2: 6 שעות ₂ O; 5 HEPES והותאמו pH 7.4 (מ"מ).

2.2) הקלטה תאיים

איור 11. ההתקנה כוללת של ציוד ההקלטה.

8. צלחת פטרי עם הכנה צריך להיות ממוקם מתחת למיקרוסקופ ומאובטחת עם שעווה בתחתית המנה, כדי למנוע תנועה.
   
   איור 12. המיקום של התכשיר מתחת למיקרוסקופ. שימוש בשעווה כדי לאבטח את צלחת פטרי והכנה.
9. שני חוטים כל אחד עם אורך קצר של חוט כסף מחוברת בקצה אחד יש לקבל. חוט כסף צריך להיות טבל כמות קטנה של אקונומיקה למשך כ 20 דקות כדי לקבל ציפוי Ag-Cl. לשטוף את החוט במים לפני השימוש. פיפטה כוס תאיים יש לקבל ו backfilled בזהירות בעזרת מחט ארוכה מצורף מזרק מלא עם פתרון 3M KCl. פיפטה צריך להיות מורד (עם פתיחת מול הרצפה) ומלא פתרון. זה יבטיח כי כל KCl עודף יהיה לטפטף החוצה האחורי של האלקטרודה. הקפד KCl לא המשתרע לאורך פיפטה זכוכית ייכנסו אמבטיה מלוחים. סובבו את פיפטה זקוף כאשר סיים עם מילוי פתרון אשלגן כלורי. חוט כסף לאחר מכן ניתן להציב לתוך פיפטה. בקצה השני מחובר הקוטב + (חיובי) על הבמה ראש מגבר. פיפטה מובטחת אז על בדיקה האלקטרודה. טיפול צריך להיעשות לא לשבור את קצה האלקטרודה. תיל שלישית מחוברת לכלוב פאראדיי צריך להיות ממוקם בתוך המוט הירוק של השלב הראש. לבסוף חוט Ag עופרת הנותרים צריך להיות ממוקם באמבטיה, ואת הקצה השני קשור - מוט (שלילי) המוצגת להלן. החוט צריך להיות ממוקם מהכלוב פאראדיי לחלק את הקרקע של ממיר AD Powerlab. השלב הראש מחובר ל 'קלט בדיקה "על רכישת / מגבר (Powerlab).
   
   איור 13. בשלב תצורה ראש. החוט המחובר קלט הירוק של השלב ראש מעוגנת למגבר או כלוב פאראדיי. החוט המחובר קלט האדום מחובר חוט האלקטרודה. הקלט שחור משמש לחיבור לפתרון ים.
   
   איור 14. "לעבור מבחן" היא בשורה התחתונה לבדוק resistance.The אלקטרודה כפתור "גס" נמצא גםתחת DC לקזז שאמור להיות מופעל שעון נגד חכם. רווח מוגדר 50, אשר מגביר את אותות בפקטור של חמישים. חוט הקרקע משלב ראש ממוקם הפתיחה "GND" שקע פינים.
10. התוכנה LabChart אמור להיפתח על שולחן העבודה או המחשב הנייד. התאם את התרשים כדי להציג רק ערוץ אחד על ידי לחיצה על "הגדרות", ואז "הגדרות ערוץ". בקטע "הגדרות הערוץ," שינוי מספר הערוצים אחד. לחץ על "אישור". בראש פינה, תרשים ביד שמאל, מחזורים בשנייה צריך להיות 2K. הגדר וולט (ציר y) סביב 200mV כדי 500mV. לחץ על "ערוץ 1" על החלק הימני של המסך. לחץ על "מגבר קלט". ודא שהתיבה דיפרנציאלי מסומנת.
    
    תפוקת מגבר צריך להיות ערוץ אחד. ההגדרות הבאות יש להשתמש עם המגבר:
    • גבוהה Pass-DC
    • Notch Filter-OFF
    • Low Pass-20kHz
    • קיבולת Comp .- נגד כיוון השעון
    • DC Offset פיין קורס ידית נגד כיוון השעון
    • DC אופסט (+ OFF-) - OFF
    • רווח הידית-50
    • קלט (הבדל MONO GND) - הבדל
    • MODE (Stim-GATE-REC) - REC
    • ΩTEST-OFF
11. כאמצעי התנגדות האלקטרודה, המתח צריך להיות מחולק הנוכחי, המהווה 2.0 NA (כלומר, R = V / I, או של חוק אוהם). הערך המתקבל הוא ההתנגדות של אלקטרודת זכוכית. ההתנגדות צריכה להיות 20-60 MegaOhms. תחתון (<20) ועמידות גבוהים (> 100) אינם מקובלים. לאחר התנגדות נקבע, הקלטות תאיים יכולים להתחיל. הניחו את קצה של אלקטרודת זכוכית לאמבטיה מלוחים. ודא חוט האדמה הוא גם באמבטיה מלוחים.
    כדי להתחיל את ההקלטה, לחץ להתחיל בחלק התחתון של המסך. ודא רווח מוגדר 5 V / div. השתמש ידית כמובן על המגבר כדי להזיז את הקו על LabChart לאפס לפני החדרת אלקטרודה. חוגת מצבי צריך להיות מופעל ולאחר מכן את מספר פעמים על מנת לבדוק את עמידות אלקטרודה. בשלב הבא, משרעת ערכי וכתוצאה מכך יש למדוד. מקום אחד הסמן על הקו בסיס יציב ואז במקום השני בשיא לקבל את התנגדות האלקטרודה.
12. השתמש בדיקה אלקטרודה מיקרוסקופ להכניס את האלקטרודה לתוך השרירים האורך (DEM או DEL1 או DEL2) של התכשיר (ראה איור 16). האלקטרודה צריכה בקושי להיות מוכנס לתוך השריר. אין דרך לחדור לשריר. שימוש במיקרוסקופ והגדרות בדיקה כדי למצוא את שרירי האורך להכניס את האלקטרודות לתוך השריר. הפנס בעוצמה גבוהה צריך להיות מותאם לראות בבירור את השריר כמו אלקטרודה הוא להיות מוכנס. כאשר מציצים סיבי שריר כהכנה זה ניתן בדרך כלל נתקלים רווחים בתרי בתוך השריר. זו הסיבה מדוע פוטנציאל הממברנה יכול להופיע, ולאחר מכן להיעלם, ואז להופיע שוב.
    
    איור 15. החדרת אלקטרודה לתוך השריר.
13. כדי למדוד את פוטנציאל הממברנה, השתמש ידית גס על המגבר כדי להזיז את הקו על LabChart לאפס לפני החדרת אלקטרודה. נקבו סיב השריר. לאחר מכן, מודדים את משרעת של הערכים שהתקבל. הנח את הסמן על הקו בסיס יציב ולהקליט את הערך.
    ההבדל בסמן לבין הסמן הפעיל מוצג בצד ימין של המסך. ערך הוא נותן את המתח. מתח נרשם ייתכן שיהיה צורך מחולק בסכום של הגברה בשימוש על המגבר (הגברה או 10x 100x כלומר). מתח צריך להיות המרה וולט כדי millivolts (1 V = 1000 mV) אם הערכים הם דיווחו על התוכנה כמו וולט.
14. בזהירות להשתמש מיקרוסקופ ומניפולטורים להסיר את האלקטרודה של השריר. נקבו אחר סיב שריר לב פוטנציאל הממברנה במנוחה. אחד צריך לקחת את הקלטות כמה נוח עם אמצעים כמו גם לכוון את האלקטרודה אינטר לתוך סיבי השריר של עניין.
    אלקטרודה כנראה לא יישאר סיב שריר אחד במהלך המשתנה של כל משתנה אחר [K ^+] פתרונות החוצה. עדיף למשוך את האלקטרודה, ואז לשנות את הפתרון, ואז לחדור שוב כדי למנוע נזק לשריר. עדיף לקבל 3 קריאות לכל פתרון של סיבי שריר נפרד להשתמש בממוצע כדי למנוע קריאות מזויף.
15. השתמש במזרק להסיר למחוק את תמיסת מלח מצלחת פטרי. צלחת פטרי צריך להיות מלא עם ריכוז גבוה הבא של פתרון אשלגן כלורי מלח, מכסים את הכנה לחלוטין. התהליך אותו יש לחזור עם כל פתרון אשלגן השינויים מתח / פוטנציאל יש לציין והקליט. סדרת [K ^+] _את פתרונות סרטנים מלוחים אנו משתמשים הם: 5.4, 20, 40, 60, 80, 100 מ"מ.

2.3) האנטומיה

עכשיו את הפיזיולוגיה הושלמה, אנחנו יכולים לבחון את קשורהאנטומיה של סיבי השריר דפוס העצבוב. העברת הכנה המנה מכתים ולהוסיף הכחול מתילן (1 גרם מתילן כחול מעורבב עם 100 מ"ל של סרטנים מלוחים). בואו מלוחים לרחוץ ההכנה במשך 5 דקות ולאחר מכן להסיר ולהוסיף מלח סרטנים טריים ללא כתם. האנטומיה של השרירים האלה תוארה בפירוט רב לאורך השנים (הקסלי, 1880; פילגרים ו Wiersma, 1963). רק לאחרונה יש לי כמה של השרירים תוארו מבחינה אנטומית, פיזיולוגית ביוכימית (Cooper et al, 1998;. Griffis et al, 2000;. סון et al, 2000)..

הפריסה אנטומי כללי של השרירים מתואר באיור 16 (צד ימין של הדמות למטרה זו). חפש העצב הראשי innervates בעיקר את השרירים בתוך קטע. סקיצה דפוס העצבוב של SEM, DEL2, DEL1 ו DEM השרירים פלח. הבטן צריכה להיות שרוע במלואו על ידי מצמיד ההכנה בצלחת בתוקף. הבא להסיר את מלח ולהוסיף את הפתרון מקבע. הפתרון הוא לתקן את הפתרון של Bouin (הוכן עם חומצה picric רווי, חומצה אצטית פורמאלדהיד; סיגמא אולדריץ ושות').

זהירות. אין לקבל את הפתרון הזה על העור או העיניים. הימנע האדים של הפתרון על ידי עבודה מתחת למכסה המנוע קטר. אם העיניים שלך מתחילות לצרוב לשטוף את העיניים מיד בתחנת לשטוף את העיניים.

תנו פתרון של Bouin להישאר על הכנת למשך כ -10 דקות ולאחר מכן להשתמש פיפטה וחילופי הפתרון מלוחים. חותכים חתיכה דקה של DEL1 החוצה או DEL2 שרירים מקום בשקופית זכוכית. לייבל השקופיות. חזור על התהליך עבור השריר SEM. הצג את דפוס banding sarcomere הן ההכנות רקמות. ניתן להשתמש מיקרוסקופ מתחם ולהתאים את היעדים בהתאם לראות את דפוסי banding. אם אפשר לקחת תמונה דיגיטלית באמצעות חתיכת עין המיקרוסקופ (הערה: כמה מצלמות הטלפון הנייד פועלות היטב עבור הליך זה).

איור 16. שרטוט סכמטי מתצוגה הגחון של החלק הגבי של הבטן סרטנים מראה את השרירים פושטי של כל פלח. קרום שריר הגב והבטן (DMA) ואת השרירים השטחיים extensor ראש אביזר (SEAcc) מופיעים קטעים 1 עד 5 של הבטן עם כיוון שונה לכל מגזר. למעט קטע 1, שרירים אלו האתרים שלהם מצורף בסוף הקדמי שלהם tergite מסויד ובסוף האחורי בקרום במפרק. בקטע 1, הומולוגיים השרירים יש אתרים הקדמי שלהם זיקה בקרום במפרק הנמצא בין בית החזה והבטן. האיור היה מבוסס על montages צילומי ההכנות מתילן כחול מוכתם. בצד שמאל של הדמות כל השרירים extensor עמוק הוסרו כדי להראות את שרירי הגב extensor שטחית. סולם = 2.35 מ"מ. (נלקח מתוך סון et al. 2000).

3. תוצאות

השאלות הבאות ועיבוד נתונים להמחיש את העקרונות העיקריים ואת מטרות עבור הליך זה מעבדה.

1. מגרש האמצעים להשיג את פוטנציאל הממברנה נחים בכל [K ^+] _החוצה בשימוש. ראה אם ​​קווים נצפתה היפותטי מתאימים בשיפוע שלהם. כדי להתוות ערכים השימוש מזימה יומן למחצה עם ציר ה-x של מגוון [K ^+] _בתור יומן ואת ציר y של פוטנציאל הממברנה (כמתואר להלן: איור 17). (הורדה נייר מילימטרי חינם במידת הצורך http://incompetech.com/graphpaper/logarithmic/ )
   
   איור 17. גרף הנייר
   השתמש פוטנציאל ממוצע קרום מנוחה המתקבל 5.4 מ"מ [K ^+] את ליזום את הקווים היפותטיות נצפתה להשוואה.
   אם הקווים אינם תואמים לדון מדוע זה יכול להיות.
2. אם שינו את הרמה החיצונית של יוני Na ^+, היית מצפה את אותו סוג של שינויים כפי שנצפה לשינוי K ⁺ ריכוז?
3. כמה טוב היה מתילן כחול כתם השרירים לעומת העצבים? למה יכול להיות שיש הבדלים? האם כחול מתילן משמשים כיום לזיהוי רקמות או בניגוד בתאים אנושיים לחיות? איזו מערכת יחסים יש עם זיגמונד פרויד וכתמים בשימוש סרטנים?
4. הערה כל ההבדלים בדפוסי sarcomere בין DEL והשרירים SEM. אם כן, מה יכולה להיות הסיבה? האם כל השרירים יש מרחקים אותו sarcomere מנוחה? צייר את תבנית שריר banding אתה שנצפה עם המיקרוסקופ לבין תווית כמו הרבה של הדמות ככל האפשר (ביחס האנטומיה ידוע שריר sarcomere).

4. מדידת Re Synapticsponses

1) מבוא

Extensor שריר הבטן הכנה בשימוש כדי להדגים את הפוטנציאל קרום מנוחה היא גם אידיאלי עבור הוכחת אינדוקציה של תגובות הסינפטי על NMJs מן השרירים השונים. שרירי חלק ב סרטנים מעוצבבים באופן סלקטיבי על ידי אחד phasic או מנוע טוניק נוירון, אם כי כמה סיבים יחיד יכול להיות מעוצבבים על ידי שני נוירונים phasic טוניק מנוע מעוררים, כגון השרירים extensor ב סרטנים ההליכה הרגליים (אטווד, 2008; לראות יופיטר ייצור id # 2319-וו קופר, 2010) ואת רוב שרירי הגפיים אחרים (Wiersma, 1961a). על ידי המרצת הנוירונים המנוע סלקטיבי phasic טוניק, הבדלים פיזיולוגיים EPSPs ניתן למדוד. הנוירונים המנוע Phasic לייצר מהיר עוויתות של סיבי שריר ולעורר EPSPs בסדר גודל של mV 10-40. התגובה phasic יכול לדכא במהירות עם 5-10 הרץ הרכבות של גירוי. הנוירונים המנוע טוניק להצמיח EPSPs קטן שניתן להקל בנוכחות בתדר גבוה יותר (10-50 הרץ) של גירוי. מבחינה מבנית, מסופי phasic טוניק presynaptic ב NMJs הם שונים (אטווד קופר, 1996; Bradacs et al, 1997;.. Cooper et al, 1998).

באופן מפתיע את הפנוטיפ של התגובות הפיזיולוגיות phasic יכול לעבור שינוי למדינת טוניק דמוי ידי נוירונים מיזוג חשמלית phasic למשך כמה שעות מדי יום במשך 7 ימים (Cooper et al, 1998;. מרסייה אטווד, 1989). כמו כן, את הרגישות neuromodulation של NMJs הוא הפך הממשלה לחקירת ויסות ביטוי קולטן (Griffis et al., 2000).

בהכנה זו חזקים יחסית (שרירי הבטן סרטנים), התגובות הן טוניק ו phasic נרשמות בקלות ובחן עבור סיוע ו / או דיכאון התגובות סינפטיים עם פרדיגמות גירוי מגוונות. עם ההכנות הללו, התלמידים יוכלו להכיר בהכללות התגובות הסינפטי phasic טוניק על ידי גירוי עצב צרור.

הכנה נוסף NMJ הציג משמש לניטור פעילות מוטורית פנימי לגירוי חושי המושרה פעילות מוטורית של מערכת העצבים המרכזית. זהו השריר השטחי מכופף בצד הגחוני של הבטן סרטנים. הכנה זו ישמש גם כדי לפקח על חושית-CNS-מנוע שריר מעגל ואת ההשפעות של neuromodulators (Strawn et al., 2000).

בכל אחד קטע הבטן (למעט האחרון) יש שלוש קבוצות פונקציונליות של שרירים: (1) אלה pleopod השליטה (swimmerets) תנועה (2) שלושה שרירים extensor ו (3) שלושה שרירים מכופף. מכופפי ו פושטי הם קבוצות של שרירים אנטגוניסטים אשר להביא כיפוף או הרחבה הבטן או על ידי גרימת סיבוב על צירים intersegmental. השרירים phasic תופסת את רוב נפח של הבטן, תוך שרירי טוניק מהווים יריעות דקות של סיבים כי ההיקף הגבי (פושטי) לבין ההיבט הגחוני (מכופפי) של כל פלח הבטן.

ב סרטנים, השרירים טוניק מכופף בטן של סרטנים מעוצבבים במגזר כל חצי על ידי חמישה motoneurons ועל ידי תא עצב היקפי מעכבות. Motoneurons מעוררים להשתמש גלוטמט כשליח עצבי. גלוטמט depolarizes סיבי השריר על ידי גרם להגברת חדירות בעיקר יוני נתרן. הנוירונים מעכבות שחרור חומצה גאמא אמינו butyric (GABA), אשר בדרך כלל hyperpolarizes סיבי השריר על ידי גרימת עלייה בחדירות עד יוני כלוריד. בחלק השרירים סרטנאים (בעיקר בגפיים), מעכבות את הנוירונים ההיקפיים ליצור קשרים סינפטיים עם מסופי הנוירון המוטורי, כמו גם עם סיבי שריר, להפחית את כמות משדר שפורסמו על ידי תא עצב מוטורי (עיכוב presynaptic) (דוד 'ל ו Kuffler, 1961 ). תופעה זו אינה נוכחת השרירים מכופף טוניק של סרטנים.

חוט של עצב הגחון סרטנים הוא מבנה סימטרי בילטרלי לאורכו של החיה. יש אחד הגנגליון לכל פלח הגוף. בבטן (6 קטעים), גנגליון מכיל כמה מאות נוירונים, וכל אחד שתי connectives מורכב אלף כמה אקסונים. תא עצב טופס גופים שכבה מספר תא גופים עבה על פני השטח הגחון של כל גנגליון. מיד מעל שכבת גוף התא הוא meshwork קנס של תהליכים עצביים, neuropile. כל האינטראקציות הסינפטי להתרחש כאן; הגופים סלולריים הם נטולי סינפסות.

כל גנגליון בטני (למעט האחרון) יש שלושה שורשים בכל צד. השורש הראשון מכיל אקסונים של נוירונים innervating שרירי pleopod ו אקסונים חושית; השורש השני מכיל אקסונים innervating השרירים extensor phasic וטוניק אקסונים חושית;, שורש שלישי, אשר משאיר את מילימטרים חוט העצב מספר הזנב אל הגנגליון, מכיל אקסונים innervating השרירים מכופף phasic טוניק. ישנם שני סניפים של השורש השלישי. הסניף עמוק (IIIa) innervates השרירים מכופף phasic בלבד. הסניף שטחית של השורש השלישי (IIIB) במגזר וחצי כל אחד מכילה שישה אקסונים, אשר innervate השרירים מכופף טוניק.

הנוירונים innervating מכופף טוניק פעילים באופן ספונטני, בניגוד הנוירונים efferent phasic, וכן הכנה טובה, הם ימשיכו לירות במשך שעות רבות לאחר הבטן הוסר החיה. לסקירה של הטבע ההיסטורי של תגליות שנעשו ההכנות האלה הבטן לראות אטווד (2008). גופי התא של הנוירונים ארבעה המנוע של הנוירון מעכבות היקפי innervating השריר מכופף טוניק בכל מגזר וחצי הם ממוקמים הגנגליון של מגזר זה. גוף התא של הנוירון המוטורי הנותרים נמצא הגנגליון הזנב הבא. נוירונים אלה עשויים להיות מכובד ואמין על בסיס רשמה extracelluarly ספייק אמפליטודות אחד מהשני. אם השריר מכופף טוניק מן קטע חצי מוסר יחד עם שני הגרעינים המכילים את הנוירונים innervating זה שריר, חמישה נוירונים בדרך כלל להראות מידה מסוימת של פעילות ספונטנית. נוירונים אלה ממוספרים על בסיס של משרעת יחסית ספייק תאית, בסדר עולה. f1 ל f4 הם motoneurons ו F5, נוירון פעיל באופן ספונטני ביותר, הוא מעכב מכופף היקפי. F6, הנוירון המוטורי הגדול ביותר, הוא הנוירון המוטורי אשר מעוררים לעתים רחוקות פעיל באופן ספונטני.

אופי פעילות ספונטנית של טוניק הנוירון המוטורי יכול להיות מווסתת על ידי יישום אקסוגני של תרכובות או על ידי מתן גירוי חושי לציפורן בתוך קטע אותו כי הוא במעקב על פעילות עצב מוטורי.

2) Dissection

כדי להשיג את ההכנה extensor הבטן באותו אופן כפי שתואר לעיל לבחינת פוטנציאל הממברנה מנוחה ביחס אשלגן תאיים. ההבדל הוא לטפל צרור העצבים סגמנטלי המשתרע לאורך הצד של שריון. עצב זה ימשך לתוך האלקטרודה יניקה אשר תשמש האלקטרודה מגרה. לגרות את הרץ 1 לניטור התגובות phasic. לגרות עם צרורות קצרים של פולסים 10Hz עבור 10-20 גירויים תוך מעקב אחר התגובות טוניק.

ההליכים ניסיוני בטיפול ניסויים על טוניק השרירים סרטנים מכופף הם שונים אחד צריך לעזוב את חבל עצב הגחון ללא פגע. הכנה המורכב מקטעי בטן כמה הוא עשה. זה מתקבל כדלקמן:

1. סרטנים כ 60-10 ס"מ אורך הגוף צריך לקבל (או גודל לניהול). השג את סרטנים על ידי מחזיק אותו מהחלק האחורי של הראש או כ 2 או 3 ס"מ מהחלק האחורי של העיניים. ודא טפרים של סרטנים או הפה לא יכול להגיע הנסיין כאשר הטיפול סרטנים. השלך את הראש הנספחים לאחר הסרתם.
2. השתמש במספריים כדי להסיר במהירות את הראש. ביצוע חתך נקי ומהיר מאחורי עיניו של סרטנים.
   
   איור 18. תמונה מראה מיקום החתך כדי להסיר את ראשו של סרטנים.
   רגליים וטפרים של סרטנים ניתן להסיר בשלב זה כדי למנוע פציעה. Stylets על זכרים swimmerets משני זכרים ונקבות ניתן גם להסיר (איור 19 ו -20). בשלב הבא, להפריד את הבטן מהחזה. ביצוע חתך לאורך הממברנה לבטא שמחבר את הבטן ואת בית החזה (איור 20).
3. שמור את החלק של הבטן סרטנים ואת להיפטר של בית החזה.
   
   איור 19. תמונה מראה את המיקום של stylets כי ניתן להסיר סרטנים.
   
   איור 20. תמונה מראה את מיקום החתך כדי להסיר את בית החזה של הבטן.
   
   איור 21. הסרה של בית החזה של הבטן. לחתוך צריכה להיעשות באופן מעגלי לאורך קו ההצטרפות המגזרים.
   
   איור 22. התמונה למעלה מראה את הבטן עם הנספחים. התמונה התחתונה מראה את הסרת איברים בבטן.
4. מניחים את הזנב הכנה מבודד תמיסת מלח בצלחת פטרי גדולה. להצמיד את החלק העליון של הזנב הכנה כדי בצלחת. ודא הכנה מאובטח. השתמש באזמל כדי להסיר חלק מרובע בצד הגחוני של הכנת בין הצלעות.
   
   איור 23.מראה היכן לחתוך צריך להיעשות כדי להסיר את השיקוי הגחון של התכשיר.
5. חתך קטן צריך להיעשות (יכול להעשות גם עם מספריים). דש יש לחתוך והרים כלפי מעלה. דש לאחר מכן ניתן להסיר במספריים, לחשוף את השרירים מכופף עמוק. מיקרוסקופ יש להשתמש בתהליך זה כדי להבטיח דיוק להסיר את החלק הגחוני של התכשיר.
   
   איור 24. הכנה חיתוך במספריים כדי לחשוף את השרירים.
   
   איור 25. התמונה למעלה מראה את האחיזה של דש עם מלקחיים. התמונה התחתונה מראה את הסרת דש מן ההכנה באמצעות מיקרוסקופ.
   
   איור 26. חשיפה של שרירי מכופף שטחית.

3) תאיים הקלטה:

איור 27. ההתקנה כוללת של ציוד ההקלטה.

1. צלחת פטרי עם הכנה צריך להיות ממוקם מתחת למיקרוסקופ ומאובטחת עם שעווה בתחתית המנה, כדי למנוע תנועה.
   
   איור 28. מציג את המיקום של התכשיר מתחת למיקרוסקופ. שימוש בשעווה כדי לאבטח את צלחת פטרי והכנה.
2. שני חוטים עם אורך קצר של חוט כסף מחוברת בקצה אחד יש לקבל. חוט כסף צריך להיות טבל כמות קטנה של אקונומיקה למשך כ 20 דקות כדי לקבל ציפוי Ag-Cl. לשטוף את החוט במים לפני השימוש. פיפטה כוס תאיים יש לקבל ומילא בזהירות עם פתרון KCl (3 ז). פיפטה צריך להיות מורד (עם פתיחת מול הרצפה) ומלא פתרון. האחרון יבטיח כי כל KCl עודף יהיה לטפטף החוצה האחורי של האלקטרודה. הקפד KCl לא המשתרע לאורך פיפטה זכוכית ייכנס לאמבטיה מלוחים. סובבו את פיפטה זקוף כאשר סיים עם מילוי פתרון אשלגן כלורי. חוט כסף לאחר מכן ניתן להציב לתוך פיפטה. בקצה השני מחובר הקוטב + (חיובי) על הבמה את הראש. פיפטה מובטחת אז על בדיקה האלקטרודה. טיפול צריך להיעשות לא לשבור את פיפטה אלקטרודה. תיל שלישית מחוברת לכלוב פאראדיי צריך להיות ממוקם בתוך המוט הירוק של השלב הראש. לבסוף חוט Ag עופרת הנותרים צריך להיות ממוקם באמבטיה, ואת הקצה השני קשור - מוט (שלילי) המוצגת להלן. החוט צריך להיות ממוקם מהכלוב פאראדיי לחלק את הקרקע של ממיר AD Powerlab. בשלב ראש מחובר אל "קלט בדיקה" על רכישת / מגבר (Powerlab).
   
   איור 29. בשלב תצורה ראש. החוט קשור החלק הירוק של השלב ראש מעוגנת למגבר או כלוב פאראדיי. החוט המחובר לחלק אדומים מחובר חוט האלקטרודה. החלק השחור משמש לחיבור לפתרון ים.
   
   איור 30. "לעבור מבחן" היא בשורה התחתונה במבחן התנגדות האלקטרודה. כפתור "גס" נמצא גם תחת DC לקזז שאמור להיות מופעל שעון נגד חכם. רווח מוגדר 50, אשר מגביר את אותות בפקטור של חמישים. חוט הקרקע משלב ראש ממוקם הפתיחה "GND" שקע פינים.
3. התוכנה LabChart אמור להיפתח על שולחן העבודה או המחשב הנייד. התאם את התרשים כדי להציג רק ערוץ אחד על ידי "הגדרת" לחץ, ואז "הגדרות ערוץ". בקטע "הגדרות הערוץ," שינוי מספר הערוצים אחד. לחץ על "אישור". בראש פינה, תרשים ביד שמאל, מחזורים בשנייה צריך להיות 2K. הגדר וולט (ציר y) סביב 200mV כדי 500mV. לחץ על "ערוץ 1" על החלק הימני של המסך. לחץ על "מגבר קלט". ודא שהתיבה דיפרנציאלי מסומנת.
   
   תפוקת מגבר צריך להיות ערוץ אחד. ההגדרות הבאות יש להשתמש עם המגבר:
   
   • גבוהה Pass-DC
   • Notch Filter-OFF
   • Low Pass-20kHz
   • קיבולת Comp .- נגד כיוון השעון
   • DC Offset פיין קורס ידית נגד כיוון השעון
   • DC אופסט (+ OFF-) - OFF
   • רווח הידית-50
   • קלט (הבדל MONO GND) - הבדל
   • MODE (Stim-GATE-REC) - REC
   • ΩTEST-OFF
4. כדי למדוד את התנגדות האלקטרודה, המתח צריך להיות מחולק הנוכחי, המהווה 2.0 NA. הערך המתקבל הוא ההתנגדות של אלקטרודת זכוכית. ההתנגדות צריכה להיות 20-60 MegaOhms. לאחר התנגדות נקבע, הקלטות תאיים יכולים להתחיל. הניחו את קצה של אלקטרודת זכוכית לאמבטיה מלוחים. ודא חוט האדמה הוא גם באמבטיה מלוחים.
   כדי להתחיל את ההקלטה, לחץ "התחל" בתחתית המסך. ודא רווח מוגדר 5 V / div. השתמש ידית כמובן על המגבר כדי להזיז את הקו על LabChart לאפס לפני החדרת אלקטרודה. חוגת מצבי צריך להיות מופעל ולאחר מכן את מספר פעמים על מנת לבדוק את עמידות אלקטרודה. בשלב הבא, משרעת ערכי וכתוצאה מכך יש למדוד. מקום אחד יוצר קו בסיס יציב ואז במקום השני בשיא לקבל את התנגדות האלקטרודה.
5. השתמש בדיקה אלקטרודה מיקרוסקופ להכניס את האלקטרודה לתוך השריר. אין דרך לחדור לשריר. שימוש במיקרוסקופ והגדרות בדיקה כדי למצוא את שכבה דקה של סיבים שרירים להכניס את האלקטרודות לתוך הסיבים. הפנס בעוצמה גבוהה יכול לשמש מקור אור כאשר חודר את השריר.
   
   איור 31. החדרת אלקטרודה לתוך השריר.
6. יש להקפיד כדי למנוע נזק שורשי העצבים אל השרירים השטחיים.
   מומלץ לשמור את הרחצה מלוחים ההכנות קריר (10-15 מעלות צלזיוס) ו מחומצן היטב בעת ביצוע הפרוצדורות. אם יחידות הקירור אינם זמינים להחליף את מלוחים עם טרי, מקורר מלוחים על בסיס קבוע. גז חמצן, או לפחות באוויר, צריך בועות דרך מלוחים.
7. הקלט את הפעילות הספונטנית של EPSPs. שים לב בגדלים שונים EPSPs, ואם IPSPs נוכחים.
8. בזהירות רבה לקחת צבע שיח קטן ביד לעורר בשולי לציפורן בתוך קטע אותו אחד הוא לפקח על פעילות ספונטנית. הערה שינוי תדירות התגובות ואם EPSPs בגדלים שונים נראה כי לא היו שם לפני גירוי לציפורן.
   
   איור 32. הכנה עם גירוי שורשי העצבים מברשת. (שונה מ Strawn et al., 2000)
9. גירוי ניתן לחזור לאחר בקפידה החלפת אמבטיה מלוחים עם אחד המכיל neuromodulator כגון סרוטונין (1 microM) או מלוחים מבעבע עם CO _2. הערה ההשפעה על פרופיל הפעילות של גירוי נתון. כמו כן שים לב שאם מחליפים חזרה מלוחים חוזר מלוחים טריים הפעילות למצבו הראשוני.
10. לאחר מכן, ניתן לעקוב אחר פעילות עצבית בתוך המעגל נוירון חושי-CNS-Motor בדרכים שונות. אנו יכולים להשתמש אלקטרודה יניקה במקום אלקטרודה תאיים (איור 33) כדי לנטר פעילות הנוירון המוטורי. בקצה האלקטרודה יניקה זכוכית, צינורות פלסטיק ממוקם אשר פתח בגודל הנכון כדי למשוך את העצב אל קצה. הפתיחה לא צריך להיות גדול מדי, כמו עצב ייפול החוצה, או קטן מדי, כי יהיה עצב שנפגעו הלחץ של האלקטרודה. צינורות הפלסטיק הוא משך מעל להבה וגזוז בחזרה לגודל הדרוש.
    
    איור 33. הגדרת הסדר עם אלקטרודה יניקה ההקלטה.
    מקם את micromanipulator במצב שבו את האלקטרודה יניקה יש גישה קלה באמבטיה מלוחים. יניקה מלח עד שהוא נמצא בקשר עם חוט כסף בתוך האלקטרודה יניקה. מסדרים את חוט השני בצד לחתוך את האלקטרודה יניקה סמוך לקצה האלקטרודה, כך חוטים הן יהיו במגע עם אמבט מלחים.
    באשר ניטור החשמל לחבר את מגבר AC / DC דיפרנציאלי (מגבר) אל 26T מעבדת חשמל. לעשות זאת על ידי חיבור כבל מתאים מתוך קלט 1 על 26T PowerLab את הפלט על המגבר.
    • מכשיר שולט מגבר יש להגדיר את ההגדרות הבאות:
      • גבוהה Pass-DC
      • Notch Filter-OFF
      • Low Pass-20kHz
      • קיבולת Comp .- נגד כיוון השעון
      • DC Offset פיין קורס ידית נגד כיוון השעון
      • DC אופסט (+ OFF-) - OFF
      • רווח הידית-50
      • קלט (הבדל MONO GND) - הבדל
      • MODE (Stim-GATE-REC) - REC
      • ΩTEST-OFF
    חבר את השלב הראש של קלט בדיקה "על המגבר.
    חבר את חוטי חשמל מן האלקטרודה יניקה לשלב את הראש. החוטים צריכים להיות קשורים עם אדום (חיובי) בפינה השמאלית העליונה, ירוק (הקרקע) באמצע, שחור (שלילי בתחתית. זה מופיע באיור 34. תיל הקרקע יכול פשוט לשים באמבטיה מלוחים.
    
    איור 34. Head הבמה תצורה
11. עכשיו לחבר את כבל ה-USB 26T PowerLab אל המחשב הנייד. ודא כי הן את למגבר ו PowerLab26T מחוברים ומופעל לפני פתיחת LabChart7 במחשב.
12. פתח LabChart7.
    • תיבת ברוך LabChart מרכז יופיע פתוח. סגור אותו.
    • לחץ על הגדרת
    • לחץ על הגדרות הערוץ. שינוי מספר ערוצים 1 (השמאלית התחתונה של תיבת) לדחוף אישור.
    • בפינה השמאלית העליונה של התרשים להגדיר את מחזורים בשנייה כ 2k. הגדר את וולט (ציר y) כ 500 או 200mv.
    • לחץ על ערוץ 1 בצד ימין של התרשים. לחץ על מגבר קלט. ודא שהגדרות: single-ended, ac יחד, וגם להפוך (הופך את האות אם יש צורך), אנטי כינוי, נבדקות.
    • כדי להתחיל לחץ להתחיל בהקלטה.
    אנחנו יכולים להקליט מסניף של שורש 3 ^rd כי innervates השריר מכופף שטחית (סניף IIIB) כדי לפקח על הגודל של הפוטנציאל פעולה עם הקלטה תאיים. דחפים תאי העצב מכונים "קוצים". נזכיר כי ישנם חמישה מנוע מעורר נוירונים אחד מעכב מנוע נוירון שורש זה (קנדי טאקדה, 1965; ולז ו ווימן, 1978). גירוי של לציפורן עם מברשת או חשיפת neuromodulators יכול להיות מנוצל (איור 35). מכחול ניתן להשתמש ביד או לגירוי בקנה אחד זה יכול להיות מותקן על micromanipulator לשלוט בכמות של לחץ ותנועה.
    
    איור 35. פעילות של שורש 3 ^rd לפני ובמהלך הגירוי cuticular ב מלוחים (למעלה) ו nM 100 5-HT (התחתון). השעה במהלך גירוי לציפורן הוא הצביע על ידי הבר. הערה פעילות מוגברת לפני ואחרי גירוי כאשר הכנה טובל 5-HT (שונה מן Strawn et al., 2000).
    אנחנו יכולים להקליט מ ^-1 או 2 ^nd שורשים ידי ביצוע הקלטה passant en של עצב, או שאנחנו יכולים transect שורש הרחק VNC ולהקליט קלט חושי טהורה הנובעת מהפריפריה אשר ישלח אותות לתוך VNC. כך, היית שיא מהשורש transected המוביל הפריפריה לפעילות חושית.
    שורש 2 ^nd מכיל גדול מאוד אקסונים מביא העיקרי של הקולטן איברים שריר (MRO) ו קטן יותר של אקסונים לנוירונים efferents extensor המנוע (שדות קנדי, 1965). ישנם אקסונים חושית רבים ^רח' 1 ו 2 ^nd שורשים.
    הנוירונים mechanosensory יש קשר ישיר, על ידי סינפסות חשמלי עם אקסונים ענק לרוחב (LG) (לקרסנה 1969; צוקר 1972). כמו כן, הנוירונים mechanosensory ידועים לרגש interneurons דרך סינפסות כימיות.
    כדי לבחון כיצד קלט חושי יכולים להשפיע על פעילות מוטורית נוירון, באמצעות חושי-CNS-הנוירון המוטורי מעגל, אנחנו יכולים להקליט את התגובות סינפטי בשריר. היבטים שונים של מעגל נשתמש ניתן לבדוק. לדוגמה, אנו יכולים להקליט מהשורש עצב תחושתי לבד או שורש מנוע עם או ללא קלט חושי שלם לתוך VNC כדי לנתח את ההקלטות תדירות ספייק, אפשר לסמוך לאורך זמן תקופה בתנאים שונים. הצעדים יכולים להתבצע לפני מברשת גירויים במהלך גירוי את המברשת עבור כמות נתונה של זמן (איור 35). אפשר לחזור על תנאי 5 פעמים להשיג את אחוז השינוי הממוצע תדירות כאמצעי לערוך השוואות.
    אפשר גם ליישם חומרים אקסוגניים כגון סרוטונין (Strawn et al., 2000) או אצטילכולין (אח), ניקוטין או גלוטמט. פעולות התנהגותיים שונים תוארו עבור הניקוטין חסרי חוליות. זה מראה נוכחות של רצפטורים ניקוטינית (Tsunoyama ו Gojobori, 1998). גלוטמט הינו נוירוטרנסמיטר מעוררים הגדולות ביותר חסרי חוליות בבית NMJ ואת אח הוא הנוירוטרנסמיטר מעוררים מרכזי בתוך מערכת העצבים המרכזית (Monoghan et al, 1989;. ווטקינס, et al, 1990).
    אפשר לנסות heptanol או CO ₂ מבעבע מלוחים מאז זה יהיה להפריד בין סרטנים septate (או פער) צמתים בתוך המעגל כמו ד"ר סוניה מ Bierbower (אוניברסיטת קנטאקי) הראו במחקר הדוקטורט שלה. פעולה זו עשויה להסביר את התנהגות החיה משתנה כל כאשר הם נחשפים CO ₂ גבוה בסביבה (Bierbower ואת קופר, 2010). כאשר אתה לגרות את העור המת עם מברשת קלט חושי כונן ולהקליט תגובה של הנוירונים המנוע, שים לב אם יש הבדל בפעילות לפני ובמהלך heptanol או חשיפה CO _2. זה יכול או לא יכול להציע צמתים הפער יש תפקיד החושי-CNS-הנוירון המוטורי מעגל.

Discussion

פוטנציאל ממברנה

כבר ב 1902, היה ברנשטיין להתמודד עם סוגיות של פוטנציאל מנוחה האקסון של דיונון. זה מרתק לבחון כיצד רעיונות אלו מוקדם תצפיות ברשטיין (1902) ו נרנסט (1888) השפיע מאוחר יותר מחקר בפיזיולוגיה הממברנה. (ראה סקירה על ידי Malmivuo ו Plonsey, 1995; זמין גם על www http://www.bem.fi/book/ ). יש עדיין, עד עצם היום הזה, פריצות דרך נעשים על פונקציה ערוץ יון ותכונות של ממברנות ביולוגיות, כי הם מאוד משמעותי בהבנת הפיזיולוגיה הסלולר המתייחס לתפקוד של רקמות, איברים ומערכות.

השוואה של השפעות הנגזר ניסיוניים תיאורטית של חיצוני [K ^+] על פוטנציאל הממברנה מנוחה מציין את ההשפעה של יונים על פוטנציאל הממברנה. ניסויים נוספים באמצעות הכנת אותו להישאר להתבצע במטרה לענות על שאלות הפיזיולוגיים הבסיסיים. חלקם היו מודגשים בחזרה בשנת 1968 על ידי אטווד פרנס ו טרם התמודד באופן מלא. בעזרת טכניקות השיג בתרגיל זה, אפשר להמשיך לענות על שאלות רבות שנותרו ההכנות ניסיוני אחרים, כמו גם ביישומים פיזיולוגיים הקשורים לרפואה ובריאות. אנחנו הדגימו את התועלת של הכנת מודל חוליות במטרה לענות על שאלות יסוד הנוגעות לכל בעלי החיים.

עם הידע שנצבר על הדרגתיים אלקטרוכימי של יוני בתרגיל זה לעיל, עכשיו אתה יכול להתקדם רגישות של ממברנות ידי בדיקת הולכה סינפטית על ההכנות neuromuscular ב סרטנים.

מדידת התגובות Synaptic

הפרטים שנקבעו בחלק הראשון של המעבדה הזו, הסרט קשור, סיפקו שלבים עיקריים הקלטה פוטנציאל הממברנה חוקרת מבנה השריר. בחלק השני של המעבדה זה, הפגנה של דיסקציה שידור הקלטה הסינפטי על NMJs של יחידות מוטוריות phasic טוניק סיפק חשיפה מושגי יסוד בפיזיולוגיה. החשיפה במעגל העצבי, אשר יכול בחלק ניתן להסביר התנהגויות הקשורות, בתוך החיה שלם יש פוטנציאל לא רק לתלמידים לחקור שונים שאלות פתוחות בתוך תרגיל מעבדה שלהם אלא גם למחקר עתידי על מעגלים עצביים ב היטב חוליות הכנה הוקמה (קנדי et al, 1969;. Antonsen ואדוארדס, 2003)

תכשירים אלה יכולים לשמש גם כדי לחקור סיוע דיכאון הסינפטי, לטווח ארוך פלסטיות (לא נחקרו במחקר זה במעבדה). אפילו בתוך כמה מינים של סרטנים, הפלסטיות העצבית תלוי בתנאי הגירוי הניסיוני (מרסייה אטווד, 1989;. Cooper et al, 1998), כמו גם בסביבתם הטבעית. במידה מה את היכולת לשנות היעילות הסינפטית ודינמיקה השריר משמש החיה נשארת להיחקר. מאז סרטנים משנים את התנהגותם ביחס וריאציה עונתיים מחזור הנשירה, יש יחסית לטווח ארוך הבדלים בפעילות מערכות neuromuscular שלהם. הוכח כי העצב phasic מנוע מסופים של השרירים טופר קרוב התערוכה מורפולוגיה phasic קלאסי במהלך החורף, אבל להתנפח ולהפוך דליות יותר לאורך הטרמינל במהלך חודשי הקיץ (Lnenicka 1993; Lnenicka ו זאו, 1991).

כמה מחקרים מוקדמים שנערכו סרטנים (LG) interneurons לרוחב ענק בתוך העצב בחוט הגחון הפגינו נוכחות הפער צמתים (Johnson, 1924; ווטנבה Grundfest, 1961). עובדה ידועה היא כי ה-CO ₂ יש השפעה על התקשורת חשמל על ידי שיחררה את סוגר פער צמתים (Arellano et al, 1990). זה היה הראו לאחרונה כי העצב ותקשורת בתוך מעגל חושית-CNS-מנוע השריר, כפי שמתואר בדו"ח זה, הוא גם רגיש CO ₂ חשיפה, המעידים על נוכחות של פער צמתים (Bierbower, 2010; Bierbower וקופר, 2010)

הפעילות הספונטנית של שורש 3 ^rd המנוע כבר נושא מאז 1960 של מתי אקרט (1961) בדקו אם טוניק ירי שרירים סטטי קולטן איבר (MRO) בתוך קטע זהה או השכנה יכול להסביר את הכונן מנוע ספונטנית. אלה מחקרים קודמים התברר כי הפעילות היה מונע את העצב בתוך חוט הגחוני (VNC) ואולי גם ממרכזי גבוה יותר (אקרט, 1961; קנדי טאקדה, 1965a, b;. Strawn et al, 2000). מאז נוכחות של CO ₂ עצר את פעילות ספונטנית, אפשר להניח במקום כלשהו בכונן לתאי העצב המוטורי שאולי יש צמתים הפער או כונן מעוררים glutamatergic. NMJs חסומים או להציג ירידה ברגישות גלוטמט בנוכחות _של CO2, והם עשויים להיות גושked גם בתוך מערכת העצבים המרכזית (Bierbower, 2010; Bierbower וקופר, 2010: ראה גם Badre et al, 2005)..

הפעולה של neuromodulators שונים הוא גם למד בקלות על סוגים שונים של NMJs (קופר קופר, 2009; Griffis et al, 2000;. סאוט et al, 2000;.. Strawn et al, 2000). בנוסף, השפעות שונות המופעל על ידי neuromodulators על המעגלים מערכת העצבים המרכזית. הוצע כי 5-HT ונוירונים octopaminergic יכול לתפקד "להרוויח-קובעי" בשינוי התפוקה של מעגלים עצביים (מא et al, 1992;. שניידר et al, 1996;. הורנר et al, 1997;. אדוארדס et al., 2002). עבודה רבה המלאכה לפני שנוכל להבין את ההשפעות של neuromodulators על התאים היעד בודדים. בהתחשב בכך neuromodulators שונים יפעלו בתיאום אחד עם השני, ניתוח של הפעולה שלהם מעורב הוא אזור למחקר עתידי (Djokaj et al., 2001). בנוסף, מחקרים מעטים, בעיקר בעלי חוליות, כתובת ההשפעות של neuromodulators על כל המסלולים אשר יכולים לווסת התנהגות ספציפיים. לקראת חושית-CNS-מנוע יחידה זו ניתן לבחון את ההשפעה של הקלט החושי והן neuromodulators על הפעילות של הנוירונים המנוע (Kennedy et al., 1969).

מאז זה כבר הניחו כי 5-HT משחק תפקיד בוויסות מצב התנהגותי של סרטנים, לובסטרים, סרטנים ו (ליווינגסטון et al, 1980;.. Sneddon et al, 2000), מספר ניסיונות נעשו כדי לקבוע את ריכוזו VNC, hemolymph ו בגרעיני מבודד של לובסטרים (ליווינגסטון et al, 1980;. האריס ו-Warrick קרביץ 1984;. Fadool et al, 1988). עם זאת, חלה וריאציה ניכרת את המדידות נרשמו, לא ניתן ספציפי מנה תגובה קשרים אשר יכול להסביר את פעולות התנהגותיות.

סרטנים עם צבתות החזיק בעמדה גדל עם הזנב תחובה מתחת לבטן שלה כבר חשבתי להציג תנוחה לשלוט (ליווינגסטון et al. 1980). מדינת כיפוף בטן סרטנים אינו מופיע להיות יציבה כי סרטנים דומיננטיים, בתוך זוג, התערוכה במהלך אינטראקציות חברתיות או תוך שמירה על מעמדו ההיררכי דומיננטי (Listerman et al., 2000). סרטנים כנוע אפילו טאק הבטן שלהם תחת עצמם כפי שהם לסגת יריב. תוחב זנב כזה נראה גם הגנה יציבה (Listerman et al., 2000). התנהגויות אלו נצפו בקלות בתחום ובמסגרות מעבדה (Bovbjerg, 1953, 1956; ברוסקי ו Dunham, 1987; Li et al, 2000;.. Listerman et al, 2000). מעניין, תנוחות התנהגותיים ציין לובסטרים (ליווינגסטון et al. 1980) מתהפכים עבור 5-HT וזריקות octopamine ב סרטנים האוסטרלי, הורס Cherax (מקריי, 1996). ייתכן, תגובות שונות לחלוטין יהיה לצפות בהכנת מכופף שטחית סרטנים האוסטרלי. בנוסף, מאז הדומיננטיות היא בדרך כלל בגודל הקשורים בין סרטנים, ניתן לצפות במערכת התגובה פלסטיק מאוד התנאים החברתיים להשתנות במהירות (Strawn et al., 2000). הפלסטיות של היענות neuromodulators ב חסרי חוליות הוא שטח פתוח החקירה.

Wyttenbach, ג'ונסון, הוי (1999) יצרו מדיה דיגיטלית מדריך מעבדה experimentations סרטנים שונים מעורבים שרירים זהה המוצג בדוח זה בנוסף להכנות סרטנים אחרים. זהו משאב מצוין עבור תרגילים סטודנט.

Materials