Membran Potansiyelleri, Synaptic Yanıtları, Sinir Devresi, Nöromodülasyon ve Kerevit kullanarak kas Histoloji: Öğrenci Laboratuvarı Egzersizler

Özet

Deneyleri, kas yapısı, sinaptik tepkiler, iyon gradyanlar ve membran potansiyelleri üzerine geçirgenlik etkilerini inceleyerek deneyim kazanmak için öğrenciler için kolay bir yaklaşım göstermektedir. Ayrıca, duyu-MSS-motor-kas devre nöronal devre bileşiklerin etkilerini test etmek için bir araç göstermek için sunulmuştur.

Özet

Bu raporun amacı, biyolojik zarından iyon gradyanlar neden etkileri bir anlayış geliştirmelerine yardımcı olmaktır. Bu deneylerin bir hücrenin membran potansiyelini etkileyen ve biz adresi iki yönü vardır: (1) zarının dışında K ⁺ iyon konsantrasyonu, (2) ve belirli iyonlarını zarının geçirgenliğini. Kerevit karın ekstansör kasları olan bazı tonik (yavaş) ve diğerleri fazik (hızlı), biyokimyasal ve fizyolojik fenotiplerin yanı sıra kendi yapısı içinde gruplaşmalar vardır; bu kasları innerve motor nöronların fonksiyonel özellikleri buna uygun olarak farklıdır. Biz hem yüzeysel, tonik karın fleksör kas olarak sinaptik iletim özelliklerini göstermek için bu kasların kullanmayı. Buna ek olarak, devrenin bazı yönlerini cuticular duyusal stimülasyon etkisi yanı sıra nöromodülatör etkisini göstermek için bir duyu-MSS-motor nöron-kas devre tanıtmak. Bu egzersizi elde teknikleri ile, bir diğer deneysel hazırlıkların yanı sıra, tıp ve sağlık ile ilgili fizyolojik uygulamaları kalan birçok sorulara cevap vermeye başlayabilirsiniz. Biz, tüm hayvanlar ile ilgili temel soruları yanıtlamak için model omurgasız hazırlıkları yararlılığını göstermiştir.

Protokol

1. Giriş

Bu laboratuvar çalışmaları hedefleri membran potansiyeli ölçmek için Uyarılabilir membranların özellikleri, istirahat membran potansiyeli iyonik temeli, ve yöntemleri anlamak için. Buna ek olarak, kas boyama ve histoloji kas yapısını öğretmek için kullanılabilecek sunuldu. Ayrıca, iki farklı tipte disseke hazırlıkları sinaptik iletim özellikleri çeşitli kas gruplarını göstermek için kullanılır. Tam bir duyusal-merkezi sinir sistemi (MSS)-motor nöron-kas devre kerevit karın duyusal stimülasyon ve bir devre yönlerini neromodulators ve nörotransmitterlerin etkisini incelemek için de bir hazırlık sunmak için kullanılır.

Bu raporun ilk bölümünde, istirahat membran potansiyeli ve membran potansiyeli ekstrasellüler ^K + etkisini ölçmek için kullanılan yaklaşımlar sunar . Ayrıca kas yapısı tanıtacak. Bu alıştırmanın ikinci bölümünde ise, nöromüsküler kavşaklar (NMJs) farklı türde sinaptik tepkileri ölçmek için çeşitli araçlar sunar. Ilk egzersiz kerevit karın ekstansör kaslar kullanır ve ikinci karın yüzeyel fleksör kaslar kullanır. Buna ek olarak, bakımı kolay bir sinir devresi (duyusal giriş ve motorlu çıkışları ile kerevit ventral sinir kablosu) mevcut ve duyusal-MSS çeşitli yönleriyle öğretim yanı sıra araştırma için kullanılmak üzere -motor nöron-kas devre. Ilk egzersizleri açıklama tamamladıktan sonra, biz NMJs fizyolojisi ve merkezi sinir sistemi devre mevcut.

Biyolojik zarından iyon degrade bir potansiyel farkı neden olabilir. Dinlenme sırasında bir hücre için, hücre zarından elektrik yükü, bu fark, hücre istirahat membran potansiyeli olarak bilinir . Etkileyen bir hücrenin membran potansiyeli hitap edecek iki ana faktör vardır. Zarının her iki tarafında ilk iyon konsantrasyonu. Ikinci membran iyon geçirgenliğini. Canlı bir hücre, hücre içinde ve dışında değişen konsantrasyonları ile farklı iyonları bir dizi olduğunu akılda tutmak önemlidir. Biz adresi anahtar iyonlar sodyum (Na ^+), potasyum (K ⁺⁾ ve klorür (Cl-). Kas zarından bu iyonların miktarı ve hareket membran potansiyeli belirler. Bu vakıf, sinaptik yanıtlardan bir membran elektriksel uyarım ve baskılama sırasında gözlenen elektriksel potansiyelleri adresi ve farmakolojik ajanların etkilerini incelemek. Biz aynı zamanda bu süreçlerin deneysel testi kavramlar (Robinson ve ark, 2010) temsil biyofiziksel modelleri inşa edebilirsiniz.

Cam kapiller Mikroelektronlar membran potansiyelleri kayıt izin verir. Elektrot ucu kadar küçük ve transmembran potansiyelinin doğru bir önlem alınabilir, zarar vermeden hücre zarından eklenebilir. Bu teknik, özellikle hücre içi elektrot ekleme zarar daha az muhtemel büyük hücreler, uygulanabilir. Bu fizyoloji temel teknikleri biridir.

Na + ve K dengesi + zarından fizyolojik koşullar altında Na-K ATPaz pompası tarafından yapılmaktadır. Normal koşullar altında, ortalama pompa hareket, üç Na + hücre ve iki K + hücre içine. Bir yan not olarak, kimya alanında Nobel Ödülü, 1950 sonlarında yapılan bu keşfi için 1997 yılında verildi. Keşif temelleri araştırma aksonlar bir yengeç (Skou, 1965, 1998) elde edilmiştir.

Membran depolarize olduğunda pompalamak için daha büyük bir yeteneği (Skou, 1989a, b) Bu pompa da electrogenic olarak kabul edilir. Birçok hücre, pompa bir hücrenin elektriksel depolarizasyon aktif olduğunda hızlandırır.

Bir hücrenin bir dinlenme durumunda iken Potasyum, potasyum, "kaçak" kanallar da taşıyabilirsiniz. Bu potasyum kaçak kanalları nedeniyle, dinlenme sırasında hücre zarı diğer iyonlarını daha fazla potasyum için daha geçirgen. Böylece, hücrenin istirahat membran potansiyeli daha sodyum, potasyum denge potansiyeli yakındır. Istirahat membran potansiyeli sonra potasyum denge potansiyeli bağlı olmadığını görmek için kontrol edilebilir.

1) Kas değişkenlik

Kabuklu kas liflerinin yapısal özellikleri, membran elektriksel özellikleri ve omurgalı kas lifleri daha kontraktil özellikleri daha fazla değişkenlik göstermektedir. Kabuklularda Fazik kas lifleri seğirme-tipi kasılmaları için modifiye edilmiştir. Bunlar kısa sarkomer uzunluklarda ince (2-4 mikron), düz Z hatları, ince ve kalın myofilaments düşük bir oran ve T-tübüller ve sarkoplazmik iyi gelişmiş sistemleri ile karakterizedirretikulum. Fazik kas lifi membranları kademeli ya hep ya da hiçbiri aksiyon potansiyeli oluşturabilir. Tonik kas lifleri, diğer taraftan, uzun süreli bakım için gerginlik güncellenmiştir. Bunlar genellikle sarkomer uzunluğu 10 ila 15 mikron kalın, dalgalı Z hatları, ince ve kalın myofilaments yüksek bir oranı, az gelişmiş ve T-tübüller ve sarkoplazmik retikulum sistemleri var. Tonik kas lifi membranları genellikle elektrikle inexcitable, ya da ("kademeli sivri") derecelendirildi elektriksel yanıtlar üretmek. Ara fiber türleri geniş bir yelpazede, kabuklu kaslar bulunur.

2) Denklemler

Yaygın bir iyon ve istirahat membran potansiyeli denge potansiyeli belirlemek için kullanılır Denklemler sırasıyla Nernst denklemi ve Goldman-Hodgkin-Katz (GHK) denklemi. GHK denklemi üzerinden birden fazla iyonları ve gradyanlar geçirgenliğini dikkate alınarak dinlenme potansiyeli belirlemek için kullanılır, oysa iki denklemler arasında önemli bir ayrım, Nernst denklemi bu iyon denge potansiyelini belirlemek için belirli bir iyon için kullanılır olduğunu. bir hücre zarı (Nernst, 1888, 1889; Goldman, 1943; Hodgkin ve Huxley, 1952; Hodgkin ve ark, 1952; Hodgkin ve Katz, 1949; Hille, 1992).

Nernst denklemi genel olarak yaygın olarak gösterilen bir elektromotor kuvveti üreten bir zarından iyonların için kabul edilir:

V = (RT / ZF) ln ([X] / _çıkış [X])

X = iyon ilgi
X zarından iyon V = denge gerilimi
R = gaz sabiti [8.314 J / (mol • K)]
T = mutlak sıcaklık [Kelvin]
Iyon Z = değerlik
F = Faraday sabiti [9,649 x 10 ⁴ C / mol]

K ⁺ iyonu 20 ° C ve ₁₀ sabitleri doldurma ile birlikte oturum Ln dönüşümü, bir vardığı için:

Potansiyel = 58 log _([Çıkış K] / [K]); mV olarak ifade

Sadece K ⁺ difüzyonla permeant olduğunu varsayalım. _[K] K ⁺ konsantrasyonu _[Çıkış K] hücre ve iç hücre dışında K ⁺ konsantrasyonu.

_[K] bir egzersiz tahmin. ______________

Bu hesaplama için varsayalım, membran potansiyeli sadece K ⁺ denge potansiyeline bağlıdır.

Verilen [K _çıkış] = 5.4 mM, kullanılan tuzlu su için . Ayrıca, membran potansiyeli IS-70mV varsayalım.

Potansiyel = 58 log (/ 5.4 [K]).

Deneyde, bir hücrenin istirahat membran potansiyeli ölçmek ve [K] değiştirerek nasıl etkilediğini belirlemek . _[Çıkış K] membran potansiyeli ve ilgili varsayımsal çizgi eğimi 58. Çeşitli az istirahat membran potansiyeli [K _Çıkış] (5.4 mM 100 mM aralığında) veri toplama sonra varsayımsal çizgi ile bir maç var olup olmadığını belirlemek için gözlenen değerler arsa. _[Dışarı K] 5.4 mM elde edilen ortalama istirahat membran potansiyeli kullanacağız karşılaştırma için varsayımsal ve gözlenen çizgiler başlatmak için.

Bir zar çeşitli depolarize devletlerin yanı sıra, dinlenme sırasında birden fazla iyon geçirgen edilebilir olduğu göz önüne alındığında, bir hesaba çeşitli iyonları geçirgenliği (P denklemi) almak için GHK denklemi kullanır. Sadece bir iyon geçirgen bir zar ise GHK denklemi Nernst denklemi azaltacaktır.

Burada Na ^+, K ⁺ ve Cl için genelleştirilmiş bir GHK denklemi iyonları:



Cl bu ^yana negatif yük vardır, konsantrasyon süresi içinde ve dışında bu denklemi tersine çevrilir. Bu Z (iyon şarj) devre dışı bırakılamayacak sağlar.

3) Bu egzersiz Amaçları

Bu deneyde bir kerevit kas hücre membran potansiyeli ölçmek ve adrese yukarıda açıklanan esaslar geçerli olacak:

1. Uygun enstrümantasyon ve tekniği ile bir hücre zarı potansiyeli ölçmek için.
2. İyon kas hücre zarının geçirgenliği ve membran potansiyeline katkıda bulunmaktadır.
   
   Buna ek olarak, kas yapısı bir ön çalışma yapar:
3. Lekeleri bu elektrofizyolojik deneyler yürütmek için kullanılan kerevit karın, dorsal kasların anatomisi vurgulamak için kullanın.
4. Farklı kas lifi tiplerinin histoloji inceleyin.

Bu laboratuvar egzersiz, kerevit karın ekstansör kasları kullanabilirsiniz. Bu hazırlık bir fizyoloji bu ilkeleri öğretmek, geçmişte kullanılmış oland anatomi (Atwood ve Parnas, 1968). Biz mevcut enstrümantasyon karşılamak ve bu kaynak ve modifiye diğerleri işlemleri tek bir 3 saat öğrenci laboratuvar dönemde hedefleri tamamlamak için birçok kullandık. Bu egzersizler, Kentucky Üniversitesi (Öğretim Görevlisi Dr. RL Cooper, 2010), Biyoloji Bölümü Hayvan Fizyolojisi içerisinde kullanılan diğer deneyler için bir vakıf.

4) Neden bu model hayvan

Bu deneyde, kerevit karın ekstansör kasları kullanmak için birçok iyi nedeni vardır:

1. Kerevit yaygın olarak bulunan ve laboratuar koşullarında korumak için nispeten ucuz ve kolaydır.
2. Diseksiyonu canlı hazırlıkları için diseksiyon teknikleri öğrenen öğrenciler için nispeten kolaydır.
3. Kas elektrofizyolojik yöntemler öğrenen öğrenciler için iyi hizmet veren bir minimal normal salin birkaç saat boyunca stabildir. Kas hazırlık harici [K +] kısa süreler için değiştirilen oldukça sağlamdır.
4. Çeşitli sinaptik yanıtları, motor nöronların uyararak kolayca elde edilebilir.
5. Ekstansör kaslarının anatomik düzenleme ayırt etmek kolaydır ve büyük boyutları nedeniyle bu istikrarlı intrasellüler kayıtları elde etmek nispeten kolaydır.
6. Metilen mavisi boyama ile kas ve innervasyon desen kolayca görülebilir. Buna ek olarak, özellikle kas lifi tipleri kolayca sarkomer yapısını gözlemlemek için histoloji için işlenebilir.
7. Hiçbir hayvan protokolleri ABD içinde birçok kurum laboratuvar deney omurgasız hayvan hazırlıkları için şu anda ihtiyaç vardır.

2. Yöntemleri

1) Malzeme

• Makas (1)
• Forseps (1)
• Topraklama kablosu Gümüş Tel (1)
• Mikroskobu (1)
• Elektrot Probe (1)
• Alt Sylgard ile Petri Dish (1)
• Tuzlu Çözümü (1)
• Potasyum Çözümleri: 5.4mM (normal salin), 10, 20, 40, 80, 100 mM
• Bleach (Küçük miktarı, Ag-Cl oluşturmak için gümüş tel ucu için kullanın)
• Cam Pipet (1), çözümler kaldırmak ve eklemek
• Şırınga (1)
• Amfi / Toplama Sistemi (1)
• Faraday Kafesi (1)
• Masaüstü / Dizüstü Bilgisayar (1)
• Diseksiyon pimleri (4)
• Kerevit

2) Yöntemler

2.1) Hazırlık / Diseksiyon:

1. Bir kerevit, vücut uzunluğu yaklaşık 6-10 cm (ya da yönetilebilir bir boyutta) alınmalıdır. Başın arka kısmında kerevit veya gözlerin arkasında yaklaşık bir santimetre tutun. Kerevit ya da ağız pençeleri kerevit işleme bireysel ulaşamaz emin olun. (Kerevit, başının kesilmesi için önce onu uyutmak için 5 dakika boyunca ezilmiş buz yerleştirilmiş olabilir.)
2. Hızlı bir şekilde baş kaldırmak için büyük bir makas kullanın. Kerevit gözlerinin arkasında, temiz ve hızlı bir kesim olun. Baş ve ekleri atın.
   
   Şekil 1. Resim, kerevit baş kaldırmak için kesme yerleşimi gösterir .
3. Kerevit bacakları ve pençeleri yaralanmayı önlemek için bu noktada kaldırılabilir. Erkeklerde hem kadınlarda hem de erkeklerde ve swimmerets Stilelerin de çıkartılabilir (Şekil 2). Sonra, toraks karın ayırın. Karın ve göğüs (Şekil 3) katılan, eklem zarı boyunca bir kesim olun. Kerevit karın kısmını kaydedin ve toraks atmayın.
   
   Şekil 2 makas Stilelerin kesim vardır. Bu kerevit çıkarılmalıdır.
   
   Şekil 3 Resim karından toraks kaldırmak için kesme yerleşimi gösterir.
   
   Şekil 4 karından toraks kaldırılması. Segmentleri katılmadan kesim hattı boyunca dairesel biçimde yapılmalıdır.
   
   Şekil 5 üst görüntü yüzgeç uzantıları ile karın gösterir. Alt görüntü yüzgeç uzantıları olmadan karın gösterir.
4. Karın, karın her tarafı alt lateral sınır boyunca bir kesim kabuk yapılmış olmalıdır. Kerevit çok derin kesmek için alınmalıdır. Kabuk kesme sürecinde yardımcı olmak için, kesim, makas ile ventral tarafına doğru bir açıyla aşağı slighting işaret yapılmalıdır. Her segmentin uzunluğu (Şekil 6) çalıştırmak kerevit çizgilerin doğal kabuk deseni izleyin.
   
   Şekil 6. Makas bir açıyla yerleştirilir ve kabuk doğal bir uyum aşağıdaki gibidir . Çok derin kesmek ve hazırlık yok etmeyin. Ok kesimler için takip edilmesi gereken her segment boyunca doğal çizgiye gelin başları.
5. Kabuğun karın kısmını çıkarın. Karın kasları yok etmeye özen gösterin. Ventral kısmını çıkarmak için forseps kullanın. Ventral kabuk kısmı kaldırıldığı zaman, derin fleksör kasların üstüne beyaz bir doku kitlesi görülebilir. Bu doku forseps ile dikkatli bir şekilde kaldırılabilir.
   
   Şekil 7 forseps ile kabuk ventral kısmı kaldırılıyor. Kaldırmak için ventral kısmı yukarı çekin ve geri. Ventral kabuk altında kasları yok etmeyin.
   
   Şekil 8 atılmalıdır kabuk ventral kısmında geri çekilmesi.
   
   Şekil 9, makas ile hazırlık ventral kısmı kesin ve atın .
6. Gastrointestinal sistem, derin fleksör kaslarının orta hat boyunca uzanan küçük bir tüp, kerevit çıkarılmalıdır. Forseps ile yollarının üst sıkın ve karın uzak çekin. Cut yolu alt kuyruk sonunda. Fekal atık hazırlama ile karışmaz sağlamak için, tuzlu su ile diseksiyon durulayın.
   
   Şekil 10 Görüntü hazırlık GI yolu kaldırılması gösterir.
7. Petri kabı hazırlama güvenli diseksiyon pimleri kullanın. Hazırlanması alt ve üst köşelerinde çanak aşağı tutturulmuş olmalıdır. Tuz çözeltisi Petri çanak dökülür ve intrasellüler kayıtları yapılır kadar tamamen hazırlık kapağı olmalıdır.
   Bu böcek pimleri diseksiyonu çanak içine sıkışmış böylece altındaki bir Sylgard (Dow Corning) kaplama (1cm kalınlığında) olmalıdır.
   Disseke hazırlıkları, standart kerevit salin yıkanmış 205 NaCl ile yapılır Van Harreveld çözümü (1936), değiştirilmiş; 5.3KCl; 13.5 CaCl _2; 2H ₂ O; 2.45 MgCl _2; 6H ₂ O 5 Hepes ve pH ayarlanır 7.4 (mM).

2.2) Hücre içi Kaydı

Şekil 11 kayıt cihazları genel kurulum.

8. Petri kabı hazırlanması ile mikroskop altında yerleştirilir ve hareket etmesini önlemek için çanak alt balmumu ile güvence altına alınmalıdır.
   
   Şekil 12 mikroskop altında hazırlanması yerleşimi. Petri kabı ve hazırlık güvenli mum kullanın.
9. Her bir ucuna takılı gümüş tel kısa bir uzunlukta iki tel alınmalıdır. Ag-Cl kaplama gümüş tel elde etmek için, yaklaşık 20 dakika boyunca küçük bir miktar çamaşır suyu içine daldırılır olmalıdır. Tel kullanmadan önce su ile yıkayın. Bir bardak intrasellüler pipet 3M KCl çözeltisi ile dolu bir şırınga bağlı uzun bir iğne ile elde edilen ve dikkatli bir şekilde yeniden toprakla olmalıdır. Pipet geri çevirdi (açılış yere bakan) ve çözümü ile dolu olmalıdır. Bu, herhangi bir aşırı KCl elektrot geri damla olacağını garanti eder. Hiçbir KCl tuzlu su girecek cam pipet boyunca uzanan emin olun. Potasyum klorür çözeltisi ile dolum bittiğinde pipet dik açın. Gümüş tel sonra pipet içine yerleştirilebilir. Diğer ucunu amplifikatör kafa sahnede + (pozitif) direğe bağlanır. Pipet sonra elektrot probu üzerinde sabitlenir. Elektrot ucu kırmak için değil yapılmalıdır. Faraday kafesi bağlı üçüncü bir tel baş sahne yeşil kutup konulmalıdır. Aşağıda gösterilen kutupta (negatif) - Son olarak, kalan kurşun Ag tel, banyo ve bağlı diğer ucunda yer almalıdır. Bir tel de Faraday kafesi AD dönüştürücü Powerlab zemin kısmına konulmalıdır. Başkanı aşamasında, satın alma / amplifikatör (Powerlab) 'giriş-probe' bağlı.
   
   Şekil 13 Merkez sahne kurulumu. Başkanı sahne yeşil girişine bağlı tel, amplifikatör veya Faraday kafesi topraklı. Kırmızı girişine bağlı elektrot tel tel bağlı. Siyah giriş banyo çözümü bağlanmak için kullanılır.
   
   Şekil 14 "geçiş Testi" elektrot resistance.The "kaba" topuzu da test etmek için alt satırdaDC ofset altında akıllıca karşı saat açık olmalıdır. Kazanç 50, elli bir faktör sinyalleri güçlendirir. "GND" pin jak açılış kafa aşamasından zemin tel yerleştirilir.
10. LabChart yazılımı, masaüstü ya da dizüstü bilgisayar açılmalıdır. "Setup", daha sonra tıklayarak sadece bir kanal görüntülemek için grafik ayarlayın "Kanal ayarları." Kanal altında "Kanal ayarları," değişim bir numara. "Tamam" düğmesine tıklayın.. Grafik, sol köşede üst kısmında, saniyedeki devir 2K olmalıdır. 500mV 200mV etrafında volt (y-ekseni) ayarlayın. Ekranın sağ kısmında "Kanal 1" üzerine tıklayın. "Giriş Amplifikatör" düğmesine tıklayın.. Diferansiyel kutusu işaretli olduğundan emin olun.
    
    Amplifikatör çıkışı bir kanal olmalı. Aşağıdaki ayarları amplifikatör ile kullanılmalıdır:
    • High Pass-DC
    • Notch Filtre-OFF
    • Pass-20kHz Düşük
    • Kapasite Zorunlu .- saat yönünün tersine
    • DC ofset topuzu-saat yönünün tersine Güzel ve Ders
    • DC ofset (+ OFF-) - KAPALI
    • Gain-50
    • Giriş (DIFF MONO GND) - FARK
    • MODE (STIM-GATE-REC) - REC
    • ΩTEST-off
11. Elektrot direncinin bir ölçüsü olarak, gerilim 2.0 nA (yani, R = V / I, ya da Ohm kanunu), mevcut bölünmüş olmalıdır. Ortaya çıkan değer, cam elektrot direnci. Direnci 20 ila 60 MegaOhms arasında olmalıdır. Düşük (<20) ve yüksek direnci (> 100) kabul edilmemektedir. Direnç tespit edildikten sonra, hücre içi kayıtları başlayabilirsiniz. Tuzlu banyo cam elektrot ucu yerleştirin. Bir topraklama kablosu, tuzlu su da emin olun.
    Kayda başlamak için, ekranın alt kısmında basın. Kazanç, 5 V / div ayarlanmış olduğundan emin olun. Amplifikatör kurs topuzu elektrot takmadan önce, sıfır LabChart hattı hareket ettirmek için kullanın. Geçiş topuzu elektrot direnci test etmek için birkaç kez ve sonra kapalı durumda olmalıdır. Daha sonra, elde edilen değerler genlik ölçülmelidir. Sabit bir taban çizgisi üzerinde bir işaretleyici yerleştirin ve sonra elektrot direnci elde zirvesinde ikinci sırada.
12. Elektrot prob ve mikroskop hazırlık boyuna kasları (DEM veya DEL1 veya DEL2) (bkz. Şekil 16) elektrot eklemek için kullanın. Elektrot ancak kas içine girilmelidir. Kas yoluyla nüfuz etmez. Uzunlamasına kasların ve kas içine elektrotlar eklemek için mikroskop ve prob ayarları kullanın. Yüksek yoğunluklu aydınlatma elektrot takılı olan kas açıkça görmek için ayarlanabilir olmalıdır. Bu hazırlık kas lifleri alay zaman bir yaygın kas içinde boşluklar ve yarıkların içine çalıştırabilirsiniz. Bu membran potansiyeli görünür, sonra kaybolur, sonra yeniden neden nedeni budur.
    
    Şekil 15 kas içine elektrod yerleştirilmesi.
13. Membran potansiyeli ölçmek için elektrot takmadan önce, sıfır LabChart hattı hareket ettirmek için amplifikatör kaba topuzu kullanın. Bir kas lifi Poke. Daha sonra, elde edilen değerler genliğini ölçer. Bir marker sabit bir taban çizgisi üzerinde koyun ve değerini kaydedecektir.
    Fark marker ve aktif imleç ekranın sağ tarafında görüntülenir. Voltaj değeri verir. Kaydedilen voltaj amplifikatörü kullanılan amplifikasyon miktarı (yani 10x veya 100x büyütme) tarafından bölünmüş gerekebilir. Voltaj değerleri volt olarak yazılımı milivolt (1 V = 1.000 mV) volt dönüştürülmesi gerekir.
14. Dikkatlice mikroskop ve manipülatörler kas elektrot kaldırmak için kullanın. Başka bir kas lifi Poke ve istirahat membran potansiyeli not edin. Bir kaç kayıtları almak ve önlemlerin yanı sıra ilgi kas lifi hücrelerarası elektrot yönlendirilmesi ile rahat olmalıdır.
    Elektrot, muhtemelen tüm farklı değişmiş ^[K +] dışı çözümler değiştirilmesi sırasında bir kas lifi kalmayacak . Elektrot çekmek için en iyisi, daha sonra çözüm değiştirmek, daha sonra kas zarar vermemek için yeniden nüfuz eder. Ortalama 3 okuma ayrı kas lifleri bir çözüm elde etmek ve herhangi bir sahte okumaları önlemek için ortalama kullanmak en iyisidir.
15. Petri kabı salin solüsyonu çıkarmak ve atmak için bir şırınga kullanın. Petri kabı, potasyum klorür tuz çözeltisi hazırlama tamamen kaplayan bir sonraki daha yüksek konsantrasyon, ile dolu olmalıdır. Aynı işlemi her potasyum çözeltisi ile tekrar edilmeli ve gerilim / potansiyel değişiklikler not ve kayıt altına alınmalıdır. Serisi [K ^+] kullandığımız kerevit serum fizyolojik _dışında: 5.4, 20, 40, 60, 80, 100 mM.

2.3) Anatomi

Şimdi fizyolojisi tamamlanmış, ilgili inceleyebilirsinizkas lifleri ve innervasyon desen anatomisi. Hazırlık boyama kabına aktarın ve metilen mavisi (100 mL kerevit tuzlu su ile karıştırılır metilen mavisi 1 gram) ekleyin. 5 dakika hazırlık banyo tuzlu ve daha sonra kaldırmak ve leke olmadan taze kerevit tuzlu su ekleyin. Bu kasların anatomisi (Pilgrim ve Wiersma, 1963 Huxley, 1880) yıllar boyunca detaylı olarak tarif edilmiştir. Sadece son zamanlarda bazı kasların (Cooper ve ark, 1998; Griffis ve ark, 2000; Sohn ve ark, 2000), fizyolojik ve biyokimyasal anatomik olarak tarif edilmiştir.

Kasların genel anatomik yerleşimi Şekil 16 (bu amaç için şekil sağ tarafı) tasvir edilmiştir. Öncelikle bir segment içindeki kasları innervates ana sinir arayın. SEM, DEL2 DEL1 ve bir segment DEM kaslarının innervasyonu desen çizin. Karın tamamen sıkıca çanak hazırlık iğneleyerek uzanmış olması gerekir. Sonra tuzlu su çıkarmak ve fiksatif çözüm ekleyin. Düzeltme çözüm Bouin çözümü (Sigma-Aldrich Co doymuş pikrik asit, formaldehit ve asetik asit ile hazırlanan).

DİKKAT. Cildinizi veya gözlerinizi bu çözüm alamadım. Davlumbaz altında çalışarak çözüm buharlar kaçının. Gözlerinizi göz yıkama istasyonu hemen gözlerinizi yıkayın yanmaya başlar.

Bouin çözümü, yaklaşık 10 dakika hazırlık kalacak ve sonra bir pipet kullanmak ve tuzlu su karşılığında çözüm olsun. DEL1 veya DEL2 kas dışında ince bir parça kesin ve bir cam slayt yerleştirebilirsiniz. Etiket slayt. SEM kas için prosedürü tekrarlayın. Hem de doku hazırlıkları sarkomer bantlama desen. Bantlama modellerini görmek için bileşik mikroskop kullanımı ve hedeflerine uygun şekilde ayarlayabilirsiniz. Mikroskop göz parçası üzerinden bir dijital fotoğraf çekmek (not: bu işlem için bazı cep telefonu kameraları işe yarar).

Şekil 16, her segmentin ekstansör kas gösteren kerevit karın dorsal kısmının ventral şematik çizim . Dorsal zarı karın kas (DMA) ve yüzeysel ekstansör aksesuar kas kafa (SEAcc) segmentleri 1 ile 5 arasındaki her segment için farklı bir yönlendirme ile karın ortaya çıkar. Segmentinde 1 istisna ile bu kaslar kalsifiye tergite, anterior sonunda ve posterior eklem zarı sonunda bağlılığını siteleri var. 1 segmentinde, homolog kasları, Göğüs ve karın arasında bulunan eklem zarı ön ekini siteleri var. Resimde metilen mavisi lekeli hazırlıkları fotoğraf montajı üzerine dayanıyordu. Figürün sol taraftan tüm derin ekstansör kaslarda yüzeysel sırt ekstansör kaslarını göstermek için kaldırıldı. Ölçek = 2.35 mm. (Taken Sohn ve ark 2000).

3. Sonuçlar

Aşağıdaki sorular ve veri işleme için temel ilkeleri ve hedefleri Bu laboratuvar prosedürü göstermektedir.

1. ^[+ K] _dışında kullanılan her istirahat membran potansiyelleri elde önlemler çizilir. Gözlenen ve varsayımsal çizgiler, eğim uyumlu olup olmadığına bakın. Değerleri çizmek için x-ekseni ile yarı-log arsa kullanımı çeşitli [K ^+] günlük ve membran potansiyelleri (aşağıda gösterildiği gibi, Şekil 17) y ekseni. (Gerekirse serbest grafik kağıdına indirin http://incompetech.com/graphpaper/logarithmic/ )
   
   Şekil 17. Grafik kağıt
   5.4 mM elde edilen ortalama istirahat membran potansiyeli kullanın [K ^+] karşılaştırma için varsayımsal ve gözlenen çizgiler başlatmak için dışarı.
   Hatları neden olabilir tartışmak eşleşmiyorsa.
2. Na ⁺ iyonları dış düzeyinde değişiklik yaparsanız, K değiştirmek için görüldüğü gibi aynı tip değişiklikler ⁺ konsantrasyonu beklersiniz?
3. Sinirler ile karşılaştırıldığında ne kadar iyi metilen mavisi kasları leke mi? Neden farklılıklar olabilir? Bugün canlı insan hücreleri, doku ya da kontrast tanımlaması için kullanılan metilen mavisi mi? Sigmund Freud ve kerevit kullanılan lekeleri ile ne gibi bir ilişkisi nedir?
4. Sarkomer desenler DEL ve SEM kasları arasındaki herhangi bir farklılık dikkat edin. Eğer öyleyse, nedeni ne olabilir? Tüm kasları aynı dinlenme sarkomer mesafeler var mı? , Mümkün olduğu kadar bu rakam (bilinen sarkomer kas anatomisi ile ilgili) kadar mikroskop ve etiket ile görülen kas bantlama desen çizin.

4. Ölçüm Synaptic Reterapötik yanıtlar

1) GİRİŞ

Istirahat membran potansiyeli göstermek için kullanılan karın ekstansör kas hazırlık aynı zamanda çeşitli kaslar NMJs sinaptik yanıtları indüksiyon gösteren için ideal. Kabuklularda bazı kasların bazı tek lifleri gibi kerevit yürüyüş bacaklar ekstansör (Atwood, 2008 için iki fazik ve tonik eksitatör motor nöronlar tarafından innerve olmasına rağmen seçici bir fazik ya da bir tonik motor nöron veya innerve; vallahi bkz. üretim id # 2319-Wu ve Cooper, 2010) ve diğer pek çok bacak kasları (Wiersma, 1961a). Seçici fazik ve tonik motor nöronları uyararak, EPSPS fizyolojik farklılıklar ölçülebilir. Fazik motor nöronlar, kas liflerinin hızlı seğirmesi üretmek ve 10-40 mV sipariş üzerine EPSPS uyandırmak. Fazik yanıt stimülasyon 5-10-Hz trenler hızlı bir şekilde bastırın. Tonik motor nöronların stimülasyon daha yüksek frekanslı (10-50 Hz) varlığı kolaylaştırılabilir küçük EPSPS neden olmaktadır. Yapısal olarak, NMJs presinaptik fazik ve tonik terminalleri farklı (Atwood ve Cooper, 1996; Bradacs ve ark, 1997; Cooper ve ark, 1998).

(Mercier ve Atwood, 1989 Cooper ve ark, 1998) Şaşırtıcı fazik fizyolojik yanıtlar fenotip 7 gün boyunca günde bir kaç saat elektrikle klima fazik nöronlar tonik gibi bir devlet için bir dönüşüm geçirmek olabilir . Ayrıca dönüştürülmüş NMJs nöromodülasyon duyarlılığı reseptör ekspresyonunun regülasyonu (Griffis ve ark, 2000) araştırmak için asal.

Bu görece sağlam bir hazırlık (kerevit karın kasları), hem tonik ve fazik yanıtları kolayca kaydedilir ve kolaylaştırma ve / veya çeşitli stimülasyon paradigmalar ile sinaptik yanıtları depresyon açısından incelenir. Bu hazırlıkların, öğrenciler bir sinir demeti uyararak fazik ve tonik sinaptik yanıtları genellemeler tanımak için mümkün olacaktır.

Sunulan ek bir NMJ hazırlık CNS içsel motor aktivite ve duyusal uyarana bağlı motor aktivite izlenmesi için kullanılır. Bu kerevit karnın ventral tarafta yüzeyel fleksör kas. Bu hazırlık da duyusal-MSS-motor-kas devre izlemek için kullanılan ve etkileri nöromodülatör (Strawn ve ark, 2000). Olacaktır

Karın segment (son hariç) her üç kasların fonksiyonel gruplar vardır: (1) kontrol bu pleopod (swimmerets) hareketi, üç ekstansör kaslarda (2) ve (3) üç fleksör kaslar. Fleksör ve ekstansörleri intersegmental menteşe etrafında dönme neden karın fleksiyon veya uzatma ya sağlayan kasların antagonistik gruplardır. Tonik kas lifleri (ekstansörleri) dorsal ve ventral (fleksör) yönü her karın segment yayılan ince yaprak oluşmaktadır fazik kasları, karın hacmi kaplar.

Kerevit, kerevit tonik karın fleksör kasları her yarım segmentinde beş motor nöronlar ile periferik inhibitör nöron tarafından innerve. Eksitatör motor nöronlar bir nörotransmitter glutamat kullanır. Glutamat, öncelikle sodyum iyonları geçirgenliğinin artmasına neden kas lifleri depolarizes. Inhibitör nöronlar genellikle klorür iyonlarının geçirgenliğinin artmasına neden kas lifleri hyperpolarizes gama-amino bütirik asit (GABA), bırakın. Bazı kabuklu kaslarını (özellikle bacaklarda), kas lifleri ile motor nöron terminalleri yanı sıra periferik inhibitör nöronlar sinaptik rehber olun ve motor nöron (presinaptik inhibisyon) (Dudel ve Kuffler, 1961 tarafından yayımlanan verici miktarını azaltmak .) Bu olgu, kerevit tonik fleksör kaslarda mevcut değildir.

Kerevit ventral sinir kablosu hayvanın uzunluğu çalıştıran bilateral simetrik bir yapıdır. Başına bir vücut segmentinde ganglion vardır. Karın (6 parça), her ganglion birkaç yüz nöronlar, ve her iki bağlaçlar birkaç bin akson oluşur içerir. Sinir hücre gövdeleri her ganglion ventral yüzeyinde kalın bir tabaka birkaç hücre gövdeleri oluşturur. Nöronal süreçlerin hemen hücre gövdesi katmanının üstüne ince bir ağda, neuropile. Tüm sinaptik etkileşimler oluşur; hücre gövdeleri sinaps yoksun.

Her karın ganglion (son hariç) her iki tarafta üç kökleri vardır. Ikinci kök fazik ve tonik ekstansör kas ve duysal aksonların innerve aksonlar içerir; ilk kök pleopod kas ve duysal aksonların innerve nöronların aksonları içeren ve ganglion kaudal sinir kord birkaç milimetre bırakır üçüncü kök, aksonlar innervating fazik ve tonik fleksör kas. Üçüncü kök iki şubesi bulunmaktadır. Derin dalı (IIIa) sadece fazik fleksör kasları innervates. Her yarım segmentinde üçüncü kök (IIIb) yüzeysel şube tonik fleksör kaslarını innerve altı aksonlar içerir.

Tonik fleksör innerve nöron kendiliğinden aktif fazik efferent nöronlar aksine, iyi bir hazırlık, bu karın birçok saat sonra ateş etmeye devam edecektir hayvan çıkarıldı. Atwood (2008), bu karın hazırlıkları yapılan keşiflerin tarihsel tabiatı bir incelemesi için bkz. Dört motor nöron ve herhangi bir buçuk segmentinde tonik fleksör kas innerve periferik inhibitör nöron hücre gövdeleri ganglion bu segment bulunmaktadır. Kalan motor nöron hücre gövdesi sonraki kaudal ganglion yer almaktadır. Bu nöronlar güvenilir extracelluarly kaydedildi başak amplitüdleri temelinde birbirinden ayırt edilebilir. Bir yarım segmentinden tonik fleksör kas bu kası innerve nöron içeren iki ganglionlar ile birlikte çıkarılır ise, beş nöronlar genellikle spontan aktivite bazı derecesini göstermektedir. Bu nöronlar artan düzende, göreceli ekstrasellüler başak genlik bazında numaralandırılır. f4 için f1 motor nöronlar ve f5, en büyük kendiliğinden aktif nöron, periferik fleksör inhibitörüdür. f6, en büyük motor nöron, nadiren kendiliğinden aktif bir eksitatör motor nöron.

Tonik motor nöron etkinliği kendiliğinden doğa eksojen bileşiklerin uygulama tarafından ya da duyusal bir uyaran motor sinir aktivitesi için izlenmekte olan aynı segment içinde manikür sağlayarak modüle edilebilir.

2) Diseksiyon

Karın ekstansör hazırlık ekstrasellüler potasyum ile ilgili olarak istirahat membran potansiyelleri incelenmesi için yukarıda açıklandığı gibi aynı prosedürü elde etmek için. Fark karapaksta tarafı boyunca uzanan segmental bir sinir demeti dikkat çekmek için. Bu sinir uyarıcı elektrot olarak hizmet verecek bir emme elektrot içine çekilecektir. Fazik yanıtları izlemek için 1 Hz'de uyarır. 10 20 uyaranlara bakliyat 10Hz öbekler tonik tepkileri izlerken uyarır.

Kerevit tonik fleksör kasları üzerinde deneyler bakımı için deneysel prosedürleri ventral sinir kablosu olduğu gibi bırakmak için farklı ve bir ihtiyacı. Birkaç karın segmentleri oluşan bir hazırlık yapılır. Bu şu şekilde elde edilir:

1. Bir kerevit, vücut uzunluğu yaklaşık 6-10 cm (ya da yönetilebilir bir boyutta) alınmalıdır. Başın arkasında veya gözlerin arkasında yaklaşık 2 ya da 3 santimetre tutarak kerevit alın. Kerevit işlerken kerevit veya ağız pençeleri deneyci ulaşamadığı olun. Çıkardıktan sonra baş ve uzantılarının atın.
2. Hızlı baş kaldırmak için makas kullanın. Kerevit gözlerinin arkasında, temiz ve hızlı bir kesim olun.
   
   Şekil 18 Görüntü kerevit baş kaldırmak için kesme yerleştirme gösterir.
   Kerevit bacakları ve pençeleri yaralanmayı önlemek için bu noktada kaldırılabilir. Erkek ve kadın hem de erkek ve swimmerets Stilelerin da (Şekil 19 ve 20) silinebilir. Sonra, toraks karın ayırın. Karın ve göğüs (Şekil 20) katılan, eklem zarı boyunca bir kesim olun.
3. Kerevit karın kısmını kaydedin ve toraks atmayın.
   
   19 Şekil Görüntü kerevit çıkarılabilir Stilelerin yerleşimi gösterir.
   
   20 Şekil Resim karından toraks kaldırmak için kesme yerleşimi gösterir.
   
   Şekil 21 toraks, karın kaldırılması . Kesme segmentlerinin katılma hattı boyunca dairesel biçimde yapılmalıdır.
   
   Şekil 22 üst görüntü uzantıları ile karın gösterir. Alt görüntü karın uzantıları kaldırılması gösterir.
4. Büyük bir Petri kabındaki tuzlu çözüm izole kuyruk hazırlama yerleştirin. Yemeğin hazırlanması ve üst kuyruk kısmı yere sabitleyin. Hazırlık güvenli olduğundan emin olun. Kaburgalar arasındaki hazırlık ventral tarafta bir kare kısmını kaldırmak için bir neşter kullanın.
   
   Şekil 23.Kesme hazırlık ventral iksir kaldırmak için yapılmalıdır gösterir.
5. Küçük bir kesim (makas ile de yapılabilir) yapılmalıdır. Bir flep kesilir ve yukarı doğru kaldırılmalıdır. Flep sonra derin fleksör kasların ortaya makasla kaldırılır. Bu işlem sırasında mikroskop hazırlık ventral kısmı kaldırarak hassas sağlamak için kullanılmalıdır.
   
   Şekil 24, kasları ortaya çıkarmak için makas ile hazırlık Kesme .
   
   Şekil 25 Top görüntü forseps ile flep açgözlü gösterir. Alt görüntü mikroskop kullanılarak hazırlanması flep kaldırılması gösterir.
   
   Şekil 26 yüzeyel fleksör kasların Pozlama.

3) Hücre içi Kaydı:

Şekil 27 kayıt cihazları genel kurulum.

1. Petri kabı hazırlanması ile mikroskop altında yerleştirilir ve hareket etmesini önlemek için çanak alt balmumu ile güvence altına alınmalıdır.
   
   Şekil 28, mikroskop altında hazırlanması yerleştirme gösterir . Petri kabı ve hazırlık güvenli mum kullanın.
2. Kısa bir ucuna takılı gümüş tel uzunluğu ile iki tel alınmalıdır. Ag-Cl kaplama gümüş tel elde etmek için, yaklaşık 20 dakika boyunca küçük bir miktar çamaşır suyu içine daldırılır olmalıdır. Tel kullanmadan önce su ile yıkayın. Bir bardak intrasellüler pipet KCl (3 M) çözeltisi ile elde edilen ve dikkatli bir şekilde doldurulması gerekmektedir. Pipet geri çevirdi (açılış yere bakan) ve çözümü ile dolu olmalıdır. İkincisi, herhangi bir aşırı KCl elektrot geri damla olacağını garanti eder. Hiçbir KCl tuzlu su girecek cam pipet boyunca uzanan emin olun. Potasyum klorür çözeltisi ile dolum bittiğinde pipet dik açın. Gümüş tel sonra pipet içine yerleştirilebilir. Diğer ucunu baş sahnede + (pozitif) direğe bağlanır. Pipet sonra elektrot probu üzerinde sabitlenir. Bakım elektrot pipet kırmak için değil yapılmalıdır. Faraday kafesi bağlı üçüncü bir tel baş sahne yeşil kutup konulmalıdır. Aşağıda gösterilen kutupta (negatif) - Son olarak, kalan kurşun Ag tel, banyo ve bağlı diğer ucunda yer almalıdır. Bir tel de Faraday kafesi AD dönüştürücü Powerlab zemin kısmına konulmalıdır. Baş aşamasında, satın alma / amplifikatör (Powerlab) "giriş-probe" bağlı.
   
   Şekil 29 Merkez sahne kurulumu. Başkanı sahne yeşil kısmı bağlı tel, amplifikatör veya Faraday kafesi topraklı. Kırmızı kısmının bağlı tel elektrot teli bağlı. Siyah kısmı banyo çözümü bağlanmak için kullanılır.
   
   Şekil 30 "geçiş Testi" elektrot direncini test etmek için alt sıradaki. "Kaba" düğmesi de akıllıca karşı saat açık olmalıdır DC ofset altında bulunur. Kazanç 50, elli bir faktör sinyalleri güçlendirir. "GND" pin jak açılış kafa aşamasından zemin tel yerleştirilir.
3. LabChart yazılımı, masaüstü ya da dizüstü bilgisayar açılmalıdır. Sonra tıklayın "Setup" sadece bir kanal, görüntülemek için grafik ayarlayın "Kanal ayarları." Kanal altında "Kanal ayarları," değişim bir numara. "Tamam" düğmesine tıklayın.. Grafik, sol köşede üst kısmında, saniyedeki devir 2K olmalıdır. 500mV 200mV etrafında volt (y-ekseni) ayarlayın. Ekranın sağ kısmında "Kanal 1" üzerine tıklayın. "Giriş Amplifikatör" düğmesine tıklayın.. Diferansiyel kutusu işaretli olduğundan emin olun.
   
   Amplifikatör çıkışı bir kanal olmalı. Aşağıdaki ayarları amplifikatör ile kullanılmalıdır:
   
   • High Pass-DC
   • Notch Filtre-OFF
   • Pass-20kHz Düşük
   • Kapasite Zorunlu .- saat yönünün tersine
   • DC ofset topuzu-saat yönünün tersine Güzel ve Ders
   • DC ofset (+ OFF-) - KAPALI
   • Gain-50
   • Giriş (DIFF MONO GND) - FARK
   • MODE (STIM-GATE-REC) - REC
   • ΩTEST-off
4. Elektrot direncini ölçmek için, gerilim 2.0 nA akımı, bölünmüş olmalıdır. Ortaya çıkan değer, cam elektrot direnci. Direnci 20 ila 60 MegaOhms arasında olmalıdır. Direnç tespit edildikten sonra, hücre içi kayıtları başlayabilirsiniz. Tuzlu banyo cam elektrot ucu yerleştirin.. Bir topraklama kablosu, tuzlu su da emin olun.
   Kayda başlamak için, ekranın alt kısmında "start" tuşuna basın. Kazanç, 5 V / div ayarlanmış olduğundan emin olun. Amplifikatör kurs topuzu elektrot takmadan önce, sıfır LabChart hattı hareket ettirmek için kullanın. Geçiş topuzu elektrot direnci test etmek için birkaç kez ve sonra kapalı durumda olmalıdır. Daha sonra, elde edilen değerler genlik ölçülmelidir. Bir yapıcı kararlı bir taban çizgisi yerleştirin ve sonra elektrot direnci elde zirvesinde ikinci sırada.
5. Elektrot prob ve mikroskop, kas içine elektrod eklemek için kullanın. Kas yoluyla nüfuz etmez. Kas lifi ince bir tabaka bulmak ve liflerin içine elektrotlar eklemek için mikroskop ve prob ayarları kullanın. Kas nüfuz zaman yüksek yoğunluklu aydınlatma, bir ışık kaynağı olarak kullanılabilir.
   
   Şekil 31 kas içine elektrod yerleştirilmesi.
6. Yüzeysel kaslara giden sinir köklerine zarar görmesini önlemek için gerekli önlemler alınmalıdır.
   Tuzlu banyo hazırlıkları serin (10-15 santigrat derece) ve deneysel işlemleri yaparken de oksijenli tutmak için tavsiye edilir. Soğutma ünitesi bulunmayan taze tuzlu su yerine, düzenli olarak tuzlu su soğutmalı. Oksijen gazı, ya da en azından hava, tuzlu su baloncuklarının olmalıdır.
7. EPSPS spontan aktivite kaydedin. Not EPSPS farklı boyutlarda ve IPSPs mevcuttur.
8. Çok dikkatli bir şekilde küçük bir boya çalı ve elle aynı segment içinde bir spontan aktivite izleme olduğunu kütikula kenarı boyunca uyarmak. Cevapların frekans bir değişiklik Not ve farklı boyutta EPSPS manikür uyarıcı önce orada olmadığını ortaya çıkarsa.
   
   Şekil 32 fırça ve sinir köklerini uyarıcı ile hazırlanması. (Strawn ve ark, 2000 modifiye)
9. Stimülasyon, dikkatle, _{CO 2} ile kabarmış serotonin (1 Microm) veya serum fizyolojik olarak nöromodülatör içeren bir ile tuzlu su alışverişi sonra tekrar edilebilir . Aktivite profili üzerindeki etkisi belli bir uyarana dikkat edin. Ayrıca başlangıç ​​durumuna faaliyet taze tuzlu döner tuzlu geri alışverişi eğer dikkat edin.
10. Daha sonra, çeşitli şekillerde, duyusal-MSS-Motor nöron devresi içinde sinirsel aktivite izleyebilirsiniz. Biz monitör motor nöron faaliyetleri yerine hücre içi bir elektrot (Şekil 33) bir emme elektrot kullanabilirsiniz. , Cam emme elektrodun ucunda, plastik boru, sinir ucu içine çekmek için doğru boyutta bir açılış yerleştirilir. Elektrot basıncı ile sinir hasar olacaktır, çünkü çok küçük ya da açılış sinir düşeceği gibi, çok büyük olmamalıdır. Plastik boru alev üzerine çekti ve gerekli boyutuna geri kesilmiş.
    
    Şekil 33 emme elektrot kayıt düzeni ile ayarlayın.
    Mikromanipülatör tuzlu su emme elektrot kolay erişimi olan bir konuma yerleştirin. Emme Emme elektrot içindeki gümüş tel ile temas kadar tuzlu kadar. Elektrot ucu yakın emme elektrot kesim tarafında diğer tel düzenlemek, hem teller tuzlu su ile temas halinde olacak.
    AC / DC Diferansiyel Amplifikatör (Amfi) Güç Lab 26T elektrik izlenmesi için gibi bağlayın. PowerLab 26T Giriş 1 amplifikatör çıkış için uygun bir kablonun bunu.
    • Amplifikatör araç kontrolleri aşağıdaki ayarları ayarlanması gerekir:
      • High Pass-DC
      • Notch Filtre-OFF
      • Pass-20kHz Düşük
      • Kapasite Zorunlu .- saat yönünün tersine
      • DC ofset topuzu-saat yönünün tersine Güzel ve Ders
      • DC ofset (+ OFF-) - KAPALI
      • Gain-50
      • Giriş (DIFF MONO GND) - FARK
      • MODE (STIM-GATE-REC) - REC
      • ΩTEST-off
    'Giriş-prob amplifikatör başkanı aşamasında bağlayın.
    Elektrik telleri kafa aşamasına emme elektrot bağlayın. Tellerin ortasında siyah yeşil (zemin), (altta negatif, sol üst köşede kırmızı (pozitif) bağlı olmalıdır. Şekil 34 belirtilen topraklama kablosu sadece tuzlu su bulunan konabilir.
    
    Şekil 34 Baş sahne kurulumu
11. Şimdi dizüstü bilgisayar, PowerLab 26T USB kablosu bağlayın. Amplifikatör ve PowerLab26T hem de takılı ve bilgisayara LabChart7 açmadan önce açık olun.
12. LabChart7 açın.
    • LabChart Welcome Center kutusu açılır. Kapatın.
    • Kur'a tıklayın
    • Kanal ayarları tıklayın. Tamam'a basın 1 (kutunun sol alt) kanal numarasını değiştirin.
    • Grafiğin sol üst 2k hakkında saniyede döngüleri ayarlayın. 500 veya 200mV volt (y-ekseni) ayarlayın.
    • Kanal 1 grafiğin sağ tıklayın. Giriş Amplifikatör tıklayın. Emin olun ayarları: ac birleştiğinde, tek uçlu ve invert (gerekirse sinyali ters çevirir) ve anti-alias, kontrol edilir.
    • Kaydetmeye başlamak başlamak için.
    Biz ekstrasellüler kaydı ile aksiyon potansiyelleri boyutunu izlemek için yüzeyel fleksör kas (şube IIIb) innervates ^3. kök şube kaydedebilirsiniz. Ekstrasellüler sinir uyarılarının 'sivri' olarak adlandırılır. Beş excitor motor nöronlar ve bu kök bir inhibitörü motor nöron (Velez ve Wyman, 1978 Kennedy ve Takeda, 1965) olduğunu hatırlayın. Bir fırça veya nöromodülatör pozlama ile manikür uyarılması (Şekil 35) kullanılabilir. Fırça basınç ve hareket miktarını kontrol etmek için bir mikromanipülatör üzerine monte edilmiş olabilir, elle ya da tutarlı uyarılması için kullanılan olabilir.
    
    Şekil 35, tuzlu su (üst) ve 100 nM 5-HT (alt) cuticular stimülasyon öncesi ve ^sırasında 3. kök Aktivitesi . Manikür uyarılması sırasında zaman çubuğu ile gösterilir. Hazırlanması, 5-HT (Strawn ve ark, 2000 modifiye) yıkandığı stimülasyon öncesi ve sonrasında geliştirilmiş bir faaliyet unutmayın.
    ^1. veya ^2. kökleri sinir en geçerken kayıt yaparak kaydedebilirsiniz veya VNC ve VNC sinyalleri göndererek olurdu çevreden kaynaklanan rekor saf duyusal girdiyi uzak kök transect. Böylece, çevre duyusal faaliyet için giden transeksiyon kök kayıt.
    ^2. kök, kas reseptör organlar (MRO) ve efferentler küçük aksonlar ekstansör motor nöronların (Alanlar ve Kennedy, 1965) çok büyük primer afferent aksonlar içerir . ^1. ve ^2. kökleri çok duyusal aksonları vardır.
    Mechanosensory nöronlar lateral dev aksonlar (LG) (Zucker 1972 Krasne 1969) ile elektrik sinaps, doğrudan bağlantıları var. Ayrıca, mechanosensory nöronlar kimyasal sinaps yoluyla internöronlar heyecanlandırmak için bilinmektedir.
    Incelemek için nasıl duyusal girdi, duyusal-MSS-motor nöron devre üzerinden motor nöron aktivitesini etkileyebilir, biz bir kas sinaptik yanıtları kaydedebilirsiniz. Devre çeşitli yönleri incelenir. Örneğin, biz yalnız VNC içine sağlam duyusal girdi başak frekans kayıtları analiz etmek ya da duyusal sinir kök veya motor kök kaydedebilirsiniz biri farklı koşullarda bir süre içinde güvenebilirsiniz. Önlemler uyarılması ve zaman belirli bir miktar (Şekil 35) fırça uyarılması sırasında fırça önce yapılabilir. Bir koşulları 5 kez tekrarlayın ve karşılaştırmalar yapmak için bir önlem olarak frekans ortalama yüzde değişim elde edebilirsiniz.
    Bir de serotonin (Strawn ve ark, 2000) ya da asetilkolin (Ach), nikotin ya da glutamat gibi dışsal bileşikler uygulayabilirsiniz . Çeşitli davranışsal eylemler omurgasızlar nikotin için tarif edilmiştir. Bu nikotinik reseptörlerin varlığı (Tsunoyama ve Gojobori, 1998) tavsiye ediyorum. Glutamat, NMJ ve Ach en omurgasızlar önemli bir eksitatör nörotransmitter merkezi sinir sistemi içinde önemli eksitatör nörotransmiter (Watkins ve ark, 1990 Monoghan ve ark, 1989) .
    Bir heptanol deneyebilir veya CO ₂ Dr. Sonya M. Bierbower (University of Kentucky) onu tez araştırmalarında gösterdiği gibi bu devre içinde septalı (veya boşluk) kavşaklar kerevit çözmek çünkü tuzlu kabarmış . Bu eylem, çevre yüksek _{CO 2} (Bierbower ve Cooper, 2010) maruz kaldığında değişmiş bütün hayvan davranışları için sorumlu olabilir . Önce aktivite ve heptanol veya CO ₂ pozlama sırasında bir fark olup olmadığını, bir fırça ve sürücü duyusal girdi manikür teşvik etmek ve motor nöronların bir yanıt kaydederken, not . Veya duyusal-MSS-motor nöron devresi bir role sahip gap junction önermek değil olabilir.

Tartışmalar

Membran potansiyeli

Gibi erken 1902 olarak Bernstein bir kalamar akson bir dinlenme potansiyeli konuları ile ilgili. Berstein (1902) ve Nernst (1888) bu erken fikirler ve gözlemler daha sonra membran fizyolojisi araştırma nasıl etkilediğini göz önünde ilginç. (Malmivuo ve Plonsey, 1995 tarafından gözden geçirilmesi; www de mevcuttur http://www.bem.fi/book/) . Iyon kanalı, doku, organ ve sistemlerin işlevi ile ilgilidir hücresel fizyoloji anlamada çok önemli bir biyolojik membranlar fonksiyonu ve özellikleri hakkında yapılan atılımlar, bu güne kadar hala vardır.

Dış deneysel ve teorik olarak elde edilen etkilerinin karşılaştırılması [K ^+] istirahat membran potansiyeli, membran potansiyeli iyonlarının etkisi gösterir . Ek deneyler bu aynı hazırlık kullanarak temel fizyolojik soruları adresine yapılacak kalır. Bazı Atwood ve Parnas tarafından 1968 yılında tekrar vurgulanır ve henüz tam olarak ele alınması gerekiyor. Bu egzersizi elde teknikleri ile, bir diğer deneysel hazırlıkların yanı sıra, tıp ve sağlık ile ilgili fizyolojik uygulamaları kalan birçok sorulara cevap vermeye devam edebilirsiniz. Biz, tüm hayvanlar ile ilgili temel soruları yanıtlamak için bir model omurgasız hazırlık yararlılığını göstermiştir.

Bu yukarıdaki egzersiz iyonlarının elektrokimyasal eğimde kazanılan bilgi ile artık kerevit nöromüsküler hazırlıkları sinaptik iletim inceleyerek membranların eksitabilite ilerletebilir.

Ölçüm Synaptic Yanıtları

Bu laboratuvarda ilk bölümünde, ilgili film için verilen detaylar, membran potansiyelleri kayıt ve kas yapısını incelemek için önemli adımlar sağladı. Bu laboratuvar ikinci bölümünde, fazik ve tonik motor üniteleri NMJs diseksiyon ve kayıt sinaptik iletim gösteri fizyolojisi temel kavramlar bir poz verdi. Maruz kalma, kısmen sağlam hayvan ilişkili davranışlar, laboratuvar egzersiz içinde çeşitli açık uçlu sorular araştırmak için öğrenciler için değil, aynı zamanda nöronal devreler üzerinde gelecekteki araştırmalar için sadece bir potansiyele sahip iyi açıklamak için kullanılan olabilir bir sinir devresi, kurulan omurgasız hazırlama (Kennedy ve ark, 1969; Antonsen ve Edwards, 2003)

Bu hazırlıklar da sinaptik kolaylaştırılması, depresyon ve uzun vadeli plastisite (Bu laboratuvar çalışmasında incelenmiştir) araştırmak için kullanılabilir. Yanı sıra, kendi doğal ortamında; kerevit bazı türler içinde bile, nöronal plastisite deneysel stimülasyon (Cooper ve ark, 1998 Mercier ve Atwood, 1989) bağlıdır. Ne ölçüde sinaptik etkinliği ve kas dinamikleri değiştirmek için yetenek hayvan araştırılmalıdır hala hizmet vermektedir. Kerevit, mevsimsel değişim ve tüy dökümü döngüsü ile ilgili olarak davranışlarını değiştirmek için ne yapmalıyım bu yana, kendi nöromüsküler sistemlerinde nispeten uzun vadeli etkinliği farklılıklar vardır. Bu kış aylarında pençe yakın kasları fazik motor sinir terminalleri klasik fazik morfoloji sergiler, ancak yaz aylarında terminalin uzunluğu boyunca daha fazla varisli (Lnenicka ve Zhao, 1991 Lnenicka 1993) şişer ve olmaya gösterilmiştir.

Ventral sinir kordonu içerisinde kerevit yanal dev (LG) internöronlar yapılan bazı erken çalışmalar gap junction (Watanabe ve Grundfest, 1961 Johnson, 1924) varlığını göstermiştir. CO ₂ gap junction (Arellano ve ark, 1990) uncoupling elektrik iletişim üzerinde bir etkisi olduğu bilinmektedir. Yakın zamanda bu raporda açıklandığı gibi duyusal-MSS-motor-kas devresi, içinde sinir kablosu ve iletişim CO ₂ maruz gap junction (Bierbower 2010 varlığını gösteren, aynı zamanda hassas olduğunu göstermiştir; Bierbower ve Cooper, 2010)

1960, aynı ya da komşu segment içinde statik kas reseptör organ (MRO) ateş tonik spontan motor sürücü için hesap eğer Eckert (1961) incelendiğinde bu ^yana 3. motor kök spontan aktivitede bir konu olmuştur . Bu daha önceki çalışmalarda etkinliği muhtemelen daha yüksek merkezleri (Kennedy ve Takeda, 1965a, b;. Strawn ve ark, 2000 Eckert, 1961), ventral sinir kablosu (VNC) içinde sürüldü belirgin hale gelmiştir . CO _{2 'nin} varlığı kendiliğinden faaliyet durdu, bir gap junction veya glutamaterjik eksitatör sürücü olabilir yerde sürücü motor nöronların varsayabiliriz. NMJs bloke veya sergi CO ₂ varlığında glutamat duyarlılığı azalmış, ve onlar blok olabilir.(Bierbower ve Cooper, 2010; Badre ve ark ayrıca bkz, 2005. Bierbower, 2010), merkezi sinir sistemi içinde de KED .

Çeşitli nöromodülatör eylem, aynı zamanda kolayca NMJs çeşitli türleri (Griffis ve ark, 2000; Southard ve ark, 2000;. Strawn ve ark, 2000 Cooper ve Cooper, 2009) okudu. Buna ek olarak, çeşitli etkiler CNS devresi nöromodülatör tarafından sarf edilir. Schneider ve ark, 1996;. Horner ve ark, 1997; 5-HT ve octopaminergic nöronlar nöronal devrelerin çıkış (Ma ve ark, 1992 değiştirerek 'kazanç belirleyiciler' olarak işlev önerilen olmuştur Edwards ve ark, 2002). Tam nöromodülatör bireysel hedef hücreleri üzerindeki etkilerini anlamak için önce çok çalışma yapılması gerekmektedir. Farklı nöromodülatör birbirleriyle uyum içinde çalışması olduğu dikkate alındığında, kendi karma eylem analizi, gelecekteki araştırmalar için bir alan (Djokaj ve ark, 2001) . Buna ek olarak, birkaç çalışma, özellikle omurgalılarda, belirli bir davranışı düzenleyen tüm yollar üzerinde nöromodülatör etkileri. Bu duyusal-MSS-motor ünitesi hazırlanmasında bir motor nöronların aktivitesi (Kennedy ve ark, 1969) duyusal girdi ve nöromodülatör etkisini inceleyebilirsiniz.

5-HT, davranış devlet kerevit, ıstakoz düzenlenmesinde önemli bir rol oynar ve yengeç (Livingstone ve diğerleri, 1980; Sneddon ve ark, 2000) olduğu öne beri, çeşitli girişimleri konsantrasyonunu belirlemek için yapılmış var VNC hemolimf ve ıstakoz (Livingstone ve ark, 1980; Harris-Warrick ve Kravitz 1984; Fadool ve ark, 1988) izole ganglionlarda. Ancak, davranışsal eylemler için geçerli olabilecek özel doz-yanıt ilişkileri engelleyen, kaydedilen ölçümleri önemli farklılıklar var olmuştur.

Yükseltilmiş bir konumda ve onun karın altında sıkışmış kuyruk ile düzenlenen pençeleri ile bir kerevit (Livingstone ve ark, 1980) bir hakim duruş sergilemek düşünülmüştür. Kerevit karın fleksiyonu devlet baskın kerevit baskın bir hiyerarşik durum (Listerman ve ark, 2000) korurken, bir çift içinde, sosyal etkileşimler sırasında sergi ya da duruş görünmüyor. Köle kerevit bir rakip çekilme olarak kendilerini bile altında karınları sokun. Böyle kuyruk tıkınma, aynı zamanda bir savunma duruş (Listerman ve ark, 2000) olarak görülmektedir . Bu davranışlar, kolayca saha ve laboratuvar (Bruski ve Dunham, 1987; Li ve ark, 2000;. Listerman ve ark, 2000 Bovbjerg, 1953, 1956) gözlenmiştir. İlginçtir, davranışsal duruşlar ıstakoz (Livingstone ve ark, 1980) belirtildiği gibi 5-HT ve Avustralya kerevit, Cherax yıkıcı (McRae, 1996) octopamine enjeksiyonları için ters çevrilir. Muhtemelen, tamamen farklı tepkiler Avustralya kerevit yüzeyel fleksör hazırlık gözlenen olacaktır. Buna ek olarak, egemenliği genellikle kerevit arasında ilgili boyutu olduğundan bir hızla değişen sosyal koşullar (Strawn ve ark, 2000) için bir çok plastik yanıt sistemi beklenebilir. Omurgasızlarda nöromodülatör verme plastisite açık bir araştırma alanıdır.

Wyttenbach, Johnson ve Hoy (1999), dijital medya ve diğer kerevit hazırlıkların yanı sıra, bu raporda sunulan aynı kas içeren çeşitli kerevit deneyleri için bir laboratuar kılavuzu üretmişlerdir. Bu öğrenci egzersizleri için mükemmel bir kaynaktır.

Malzemeler