Membranpotentiale, Synaptic Responses, neuronalen, Neuromodulation und Muscle Histologie Mit dem Crayfish: Schülerlabor Übungen

Zusammenfassung

Die Experimente zeigen, eine einfache Möglichkeit für Studenten, um Erfahrungen bei der Prüfung Muskulatur, synaptische Antworten, die Auswirkungen der Ionengradienten und Durchlässigkeit auf Membranpotentiale zu gewinnen. Auch ist ein sinnlich-ZNS-motor-Muskel-Schaltung vorgestellt, um ein Mittel, um Wirkungen von Verbindungen auf einem neuronalen Schaltkreis-Test zeigen.

Zusammenfassung

Der Zweck dieses Berichts ist es, ein Verständnis der Auswirkungen von Ionengradienten über eine biologische Membran verursacht. Zwei Aspekte, die eine Zellmembran potenziellen Einfluss und die wir-Adresse in diesen Experimenten sind: (1)-Ionen-Konzentration von K ⁺ an der Außenseite der Membran, und (2) die Durchlässigkeit der Membran für bestimmte Ionen. Die Krebse abdominale Streckmuskeln sind in Gruppierungen wobei einige Tonika (langsam) und andere phasische (schnell) in ihren biochemischen und physiologischen Phänotypen, sowie in ihrer Struktur, die Motoneuronen, dass diese Muskeln innervieren sind entsprechend unterschiedlich in funktionellen Eigenschaften. Wir benutzen diese Muskeln sowie die oberflächliche, Tonic abdominale Beugemuskeln, um die Eigenschaften der synaptischen Übertragung zu demonstrieren. Darüber hinaus führen wir eine sinnlich-CNS-Motoneuronen-Muskel-Schaltung, um die Wirkung der Kutikula sensorische Stimulation wie auch der Einfluss der Neuromodulatoren über bestimmte Aspekte der Schaltung zu demonstrieren. Mit den Techniken in dieser Übung erhalten, kann man anfangen zu viele Fragen noch in anderen experimentellen Präparaten sowie in physiologischen Anwendungen im Zusammenhang mit Medizin und Gesundheit zu beantworten. Wir haben den Nutzen des Modells wirbellosen Vorbereitungen auf grundlegende Fragen relevant für alle Tiere-Adresse gezeigt.

Protokoll

1. Einführung

Die Ziele dieser Laborübungen werden, um die Eigenschaften von erregbaren Membranen, die ionische Basis der Ruhemembranpotential und Methoden zu verstehen, um das Membranpotential zu messen. Darüber hinaus ist Färbung und Histologie des Muskels vorgestellt, die verwendet werden, um Muskulatur zu lehren. Außerdem sind zwei verschiedene Arten von seziert Zubereitungen verwendet, um die Eigenschaften der synaptischen Übertragung in verschiedenen Muskelgruppen zu demonstrieren. Eine komplette Sensorik-Zentralen Nervensystems (ZNS)-Motoneuron-Muskel-Schaltung in die Krebse Bauch ist auch verwendet, um ein Präparat derzeit auf sensorische Stimulation und der Einfluss der neromodulators und Neurotransmitter auf die Aspekte einer Schaltung zu untersuchen.

Der erste Teil dieses Berichts werden die Ansätze zur Ruhemembranpotential und der Einfluss der extrazellulären K ⁺ auf Membranpotential messen. Wir werden auch vorstellen Muskulatur. Im zweiten Teil dieser Übung stellen wir verschiedene Möglichkeiten zur Messung der synaptischen Antworten von verschiedenen Arten von neuromuskulären Synapsen (NMJs). Die erste Übung wird die Krebse abdominale Streckmuskeln und die zweite verwendet die abdominale oberflächlichen Beugemuskeln. Darüber hinaus stellen wir einen neuronalen Schaltkreis (das Bauchmark der Krebse mit sensorischen Ein-und Motor-Ausgänge), die leicht zu pflegen ist, und welche für den Unterricht sowie für die Forschung in verschiedene Aspekte eines sensorischen-CNS verwendet werden -Motoneuronen-Muskel-Schaltung. Nach Abschluss der Erklärung der ersten Übungen, präsentieren wir die Physiologie des NMJs und ZNS-Schaltung.

Die Ionen-Gradienten über eine biologische Membran kann in eine Potentialdifferenz führen. Für eine Zelle in Ruhe, ist dieser Unterschied in elektrische Ladung durch die Zellmembran als der Zelle Ruhemembranpotential bekannt. Es gibt zwei wesentliche Faktoren, die wir-Adresse, die Einfluss auf eine Zellmembran Potenzial. Der erste ist der Ionen-Konzentration auf beiden Seiten der Membran. Die zweite ist die ionische Durchlässigkeit der Membran. Es ist wichtig zu bedenken, dass in einer lebenden Zelle gibt es eine Reihe verschiedener Ionen mit unterschiedlichen Konzentrationen innerhalb und außerhalb der Zelle. Der Schlüssel Ionen werden wir-Adresse sind Natrium (Na ^+), Kalium (K ⁺⁾ und Chlorid (Cl-). Die Mengen und die Bewegung dieser Ionen in den Muskel Membran bestimmt die Membranpotentials. Von dieser Grundlage können wir auf elektrische Potentiale im elektrischen Erregung und Hemmung einer Membran aus synaptischen Antworten beobachtet und untersucht die Auswirkungen von pharmakologischen Wirkstoffen. Wir können auch biophysikalische Modelle, um diese Prozesse zu experimentellen Test-Konzepte (Robinson et al., 2010) vertreten.

Die Verwendung von Glaskapillare Mikroelektroden erlaubt die Aufnahme von Membran-Potentiale. Die Elektrode kann durch die Zellmembran, ohne Schäden eingesetzt werden, wodurch die Spitze ist klein genug, und ein genaues Maß für die transmembrane Potential erhalten werden kann. Die Technik eignet sich besonders für große Zellen, die weniger wahrscheinlich, dass durch die Einfügung des intrazellulären Elektrode beschädigt werden können. Dies ist eine der wesentlichen Techniken in der Physiologie.

Das Gleichgewicht der Na + und K + durch die Membran wird durch die Na-K-ATPase-Pumpe unter physiologischen Bedingungen gehalten. Unter normalen Bedingungen die Pumpe bewegt sich im Durchschnitt drei Na + aus der Zelle und zwei K + in die Zelle. Als Randnotiz wurde ein Nobelpreis für Chemie im Jahr 1997 für diese Entdeckung in den späten 1950er Jahren machte ausgezeichnet. Die Grundlagen der Entdeckung wurden von der Forschung über Axone von einer Krabbe (Skou, 1965, 1998) erhalten.

Diese Pumpe wird auch als elektrogenen, da sie eine größere Fähigkeit zur Pumpe, wenn die Membran depolarisiert (Skou, 1989a, b) hat. In vielen Zellen, beschleunigt die Pumpe, wenn eine Zelle elektrisch durch Depolarisation aktiviert.

Kalium kann auch durch Kalium "Leck"-Kanäle zu bewegen, während eine Zelle in einem Ruhezustand. Aufgrund dieser Kalium-Leck-Kanäle wird die Zellmembran in Ruhe durchlässiger für Kalium als andere Ionen. Somit ist die Zelle Ruhemembranpotential näher an das Gleichgewichtspotential für Kalium als für Natrium. Das Ruhemembranpotential kann dann untersucht werden, um zu sehen, ob es auf den Kalium-Gleichgewichtspotential abhängt.

1) Muscle Variabilität

Krustentier Muskelfasern zeigen eine größere Variabilität der strukturellen Merkmale, Membran elektrischen Eigenschaften und kontraktile Eigenschaften als nicht Wirbeltier Muskelfasern. Phasischen Muskelfasern in Krebstiere sind für twitch-type Kontraktionen geändert. Sie zeichnen sich durch kurze Sarkomer Längen (2-4 Mikrometer), dünne, gerade Z-Linien, ein niedriges Verhältnis von dünn bis dick Myofilamente und gut entwickelte Systeme der T-Tubuli und sarkoplasmatischen charakterisiertRetikulum. Phasischen Muskelfasern Membranen erzeugen benotet oder Alles-oder-Nichts-Aktionspotentiale. Tonic Muskelfasern, auf der anderen Seite sind für eine längere Aufrechterhaltung der Spannung verändert. Sie haben oft Sarkomer Längen von 10 bis 15 Mikrometer, dichtes, welliges Z-Linien, ein hohes Verhältnis von dünn bis dick Myofilamente, und weniger gut entwickelten Systeme der T-Tubuli und sarkoplasmatischen Retikulum. Tonic Muskelfaser Membranen sind oft elektrisch unerregbar, oder sie können abgestufte elektrische Reaktionen hervorrufen ("abgestufte Spitzen"). Eine breite Palette von Zwischenprodukten Fasertypen ist in Krustentier Muskeln gefunden.

2) Die Gleichungen

Gleichungen, die häufig verwendet werden, um das Gleichgewichtspotential eines Ions und Ruhemembranpotential bestimmen, sind die Nernst-Gleichung und der Goldman-Hodgkin-Katz (GHK) Gleichung bzw.. Ein wichtiger Unterschied zwischen den beiden Gleichungen ist, dass die Nernst-Gleichung nur für eine bestimmte Ionen, um das Gleichgewicht Potenzial für die Ionen zu ermitteln verwendet, während die GHK-Gleichung wird verwendet, um das Ruhepotential, indem man die Durchlässigkeit von mehreren Ionen und ihre Gradienten über bestimmen einer Zellmembran (Nernst, 1888, 1889; Goldman, 1943; Hodgkin und Huxley, 1952; Hodgkin et al, 1952;. Hodgkin und Katz, 1949; siehe Hille, 1992).

Die Nernst-Gleichung ist in der Regel für Ionen durch eine Membran erzeugt eine elektromotorische Kraft, wie sie üblicherweise wie dargestellt als:

V = (RT / ZF) ln ([X] _out / [X] _in)

X = Ionen von Interesse
V = Gleichgewicht Spannung für die X-Ionen durch die Membran
R = Gaskonstante [8,314 J / (mol • K)]
T = absolute Temperatur [Kelvin]
Z = Wertigkeit des Ions
F = Faraday-Konstante [9,649 x 10 ⁴ C / mol]

Für die K ^+-Ionen bei 20 ° C und Transformation von Ln bis ₁₀ Log mit Füllung in die Konstanten, kommt man auf:

Potenzielle = 58 log ([K _in] / [K _out]); in mV ausgedrückt

Nehmen wir an, dass nur K ⁺ ist Permeationsmittel durch Diffusion. [K _in] ist die K ⁺ Konzentration auf das Innere der Zelle und [K _out] ist die K ^{+-Konzentration} auf der Außenseite der Zelle.

Als Übung Schätzung [K _in]. ______________

Nehmen wir für diese Berechnung ist Membranpotential nur abhängig von der K ⁺ Gleichgewichtspotential.

Angesichts der [K _out] = für die Kochsalzlösung verwendet wird 5,4 mm. Außerdem nehmen Membranpotential ist-70mV.

Potenzielle = 58 log ([K _in] / 5,4).

Im Experiment messen wir einer Zelle Ruhemembranpotential und bestimmen, wie es durch die Veränderung [K _out] beeinflusst wird. Die Steigung der hypothetische Linie im Zusammenhang Membranpotentials und [K _out] ist 58. Nach Erhebung von Daten über das Ruhemembranpotential bei verschiedenen [K _out] (Bereich von 5,4 mM bis 100 mM) werden wir Plot der beobachteten Werte zu ermitteln, ob es eine Übereinstimmung mit der hypothetischen Linie. Wir werden die durchschnittlichen Ruhemembranpotential bei 5,4 mM [K _out] erhalten für die Einleitung des hypothetischen und beobachteten Linien zum Vergleich.

Man bedenkt, dass eine Membran kann durchlässig für mehr als ein Ion in Ruhe, als auch an verschiedenen depolarisiert Staaten, nutzt man die GHK-Gleichung zu berücksichtigen, die Permeabilität (P in der Gleichung) für verschiedene Ionen. Die GHK-Gleichung wird der Nernst-Gleichung zu reduzieren, wenn eine Membran ist durchlässig für nur ein Ion.

Hier ist eine verallgemeinerte GHK-Gleichung für Na ^+, K ⁺ und Cl ^--Ionen:



Da Cl ^- hat eine negative Ladung, ist die Konzentration Begriff in dieser Gleichung für innen und außen invertiert. Dies ermöglicht die Z (Ionenladung) ausgeschaltet bleiben.

3) Ziele dieser Übung

In diesem Experiment werden wir messen das Membranpotential einer Krebse Muskelzelle und wenden Sie die oben genannten Prinzipien zu Adresse diskutiert:

1. Wie man eine Zellmembranpotential mit geeigneten Instrumenten und Technik zu messen.
2. Ion Durchlässigkeit des Muskels Zellmembran und wie es zu dem Membranpotential.
   
   Darüber hinaus werden wir eine erste Untersuchung der Muskulatur:
3. Verwenden Sie Flecken auf die Anatomie der Muskeln in den dorsalen Aspekt der Krebse Bauch, die für die Durchführung dieser elektrophysiologischen Experimenten verwendet wird hervorzuheben.
4. Untersuchen Sie die Histologie der verschiedenen Fasertypen.

In diesem Labor üben, werden wir die Krebse abdominale Streckmuskeln. Dieses Präparat hat in der Vergangenheit benutzt worden, um diese Prinzipien in der Physiologie lernt, lerntd Anatomie (Atwood und Parnas, 1968). Wir haben viele der Verfahren aus dieser Quelle und modifiziert anderen verwendet werden, um aktuelle Instrumente Rechnung zu tragen und die Ziele in einem einzigen 3 Stunden Schülerlabor Zeitraum abzuschließen. Diese Übungen sind eine Grundlage für weitere Experimente in der Tierphysiologie natürlich in der Abteilung für Biologie an der University of Kentucky (Instructor Dr. RL Cooper, 2010) verwendet.

4) Warum dieses Modell Tier

Es gibt mehrere gute Gründe für die Krebse abdominale Streckmuskeln in diesem Experiment:

1. Crayfish sind allgemein verfügbar und relativ billig und leicht zu pflegen unter Laborbedingungen.
2. Die Dissektion ist relativ leicht für Lernende Dissektion Techniken für die Live-Vorbereitungen.
3. Der Muskel ist für mehrere Stunden in eine minimale physiologische Kochsalzlösung, die gut bedient für Lernende elektrophysiologische Techniken stabil. Die Muskel-Präparat ist recht robust, wenn externe [K +] ist für kurze Zeiträume verändert.
4. Verschiedene synaptischen Antworten können leicht durch die Stimulierung Motoneuronen erreicht werden.
5. Die anatomische Anordnung der Streckmuskeln ist leicht zu erkennen, und aufgrund ihrer Größe ist es relativ einfach, um stabile intrazelluläre Ableitungen zu erhalten.
6. Die Muskeln und die Innervationsmuster kann leicht mit Methylenblaufärbung beobachtet werden. Darüber hinaus können bestimmte Fasertypen leicht für die Histologie verarbeitet werden, um die Sarkomerstruktur beobachten.
7. Kein Tier-Protokolle werden in dieser Zeit für wirbellose Tiere Präparate im Labor Experimente in vielen Institutionen innerhalb der USA benötigt.

2. Methoden

1) Materialien

• Schere (1)
• Pinzetten (1)
• Silber Draht für Erdungskabel (1)
• Mikroskop (1)
• Elektrodensonde (1)
• Petrischale mit Sylgard auf der Unterseite (1)
• Kochsalzlösung (1)
• Kalium Solutions: 5.4mm (normale Salzlösung), 10, 20, 40, 80, 100 mM
• Bleach (kleine Menge, für die Spitze des Silberdraht verwendet, um Ag-Cl zu bauen)
• Glaspipette (1), zu entfernen und Lösungen
• Spritze (1)
• Verstärker / Acquisition System (1)
• Faraday-Käfig (1)
• Desktop / Laptop (1)
• Dissection Pins (4)
• Flusskrebs

2) Die Methoden

2,1) Vorbereitung / Dissection:

1. Ein Flusskrebs etwa 6-10 cm Körperlänge sollte erhalten (oder eine überschaubare Größe) sein. Halten Sie die Krebse auf der Rückseite des Kopfes oder etwa einen Zentimeter von der Rückseite der Augen. Stellen Sie sicher, dass die Klauen der Krebse oder seinen Mund nicht erreichen können, die individuelle Handhabung der Krebse. (Die Krebse können in zerstoßenem Eis für 5 Minuten gesetzt werden, um sie vor betäuben, um den Kopf abzuschneiden.)
2. Verwenden Sie die große Schere, um schnell den Kopf. Machen Sie einen sauberen und schnellen Schnitt von hinten die Augen der Krebse. Entsorgen Sie den Kopf und Gliedmaßen.
   
   Abbildung 1. Das Bild zeigt die Platzierung des Schnittes auf den Kopf des Krebses zu entfernen.
3. Die Beine und Scheren des Krebses kann an dieser Stelle entfernt werden, um Verletzungen zu vermeiden. Stylets auf Männer und swimmerets auf beiden Männchen und Weibchen können auch entfernt werden (Abbildung 2). Als nächstes trennen den Bauch aus dem Thorax. Machen Sie einen Schnitt entlang der artikulierenden Membran, die die Bauch-und Thorax (Abb. 3) verbindet. Speichern Sie die Bauch Teil der Krebse und der Entsorgung des Thorax.
   
   Abbildung 2. Die Schere Schneiden der Stilette. Diese können von den Krebsen entfernt werden.
   
   Abbildung 3. Das Bild zeigt die Platzierung des Schnittes auf den Thorax aus dem Bauch zu entfernen.
   
   Abbildung 4. Die Entfernung der Brust aus dem Bauch. Der Schnitt sollte in kreisförmig entlang der Linie werden in die Verbindung der Segmente.
   
   Abbildung 5. Das obere Bild zeigt den Bauch mit swimmeret Anhängsel. Bild unten zeigt den Bauch ohne swimmeret Anhängsel.
4. Mit dem Bauch, sollte ein Schnitt in die Schale entlang des unteren, seitlichen Rand jeder Seite des Bauches erfolgen. Es sollte darauf geachtet, nicht zu tief in die Krebse werden. Um in den Prozess des Schneidens der Schale, sollte der Schnitt mit der Schere zeigt slighting nach unten in Richtung der Bauchseite und in einem Winkel getroffen werden. Folgen Sie den natürlichen Schale Muster aus Linien des Krebses, dass die Länge der einzelnen Segmente (Abbildung 6) laufen.
   
   Abbildung 6. Scheren sind in einem Winkel platziert und folgen der natürlichen Ausrichtung der Schale. Schneiden Sie nicht zu tief und zerstören die Vorbereitung. Die Pfeilspitzen weisen auf die natürliche Linie entlang jedes Segment, das für die Kürzungen befolgt werden sollten.
5. Entfernen Sie den ventralen Teil der Schale. Achten Sie darauf, die Bauchmuskeln zu zerstören. Verwenden einer Pinzette, um den ventralen Teil zu entfernen. Wenn der ventrale Teil der Schale entfernt wird, kann eine weiße Masse von Gewebe auf der Oberseite des tiefen Beugemuskeln zu sehen. Dieses Gewebe kann vorsichtig mit einer Pinzette entfernt werden.
   
   Abbildung 7. Entfernen der ventralen Teil der Schale mit einer Pinzette. Ziehen Sie nach oben und hinten auf der ventralen Teil zu entfernen. Zerstören Sie nicht die Muskeln unter der ventralen Schale.
   
   Abbildung 8. Pulling wieder auf dem ventralen Teil der Schale, die verworfen werden wird.
   
   Abbildung 9. Cut der ventralen Teil der Vorbereitung mit einer Schere entfernen und entsorgen.
6. Der GI-Trakt, ein kleines Rohr entlang der Mittellinie des tiefen Beugemuskeln, können von der Krebse entfernt werden. Pinch der Spitze der Trakt mit der Zange und ziehen weg von den Unterleib. Schneiden Sie den unteren Rand des Traktes - am Ende des Schwanzes. Spülen Sie die Dissektion mit Kochsalzlösung, um sicherzustellen, dass die fäkale Abfälle nicht mit der Vorbereitung stören.
   
   Abbildung 10. Das Bild zeigt die Entnahme des GI-Trakts von der Vorbereitung.
7. Verwenden Sie Dissektion Stifte für die Vorbereitung auf die Petrischale zu sichern. Die oberen und unteren Ecken der Zubereitung sollte auf den Teller merken werden. Saline-Lösung sollte in die Petrischale gegossen werden und auf die Vorbereitung komplett bis intrazelluläre Ableitungen durchgeführt werden.
   Diese Zerlegung Gericht sollte ein Sylgard (Dow Corning)-Beschichtung auf der Unterseite (1cm dick) haben, so dass Insekten Stifte hinein kann geklebt werden.
   Dissected Vorbereitungen sind in Standard-Krebse Kochsalzlösung getaucht, modifiziert nach Van Harreveld-Lösung (1936), die mit 205 NaCl hergestellt wird; 5.3KCl; 13,5 CaCl _2; 2H ₂ O, 2,45 MgCl _2; 6 H ₂ O, 5 HEPES und auf pH 7,4 (in mm).

2,2) Intrazelluläre Aufnahme

Abbildung 11. Insgesamt Setup des Kontrollgeräts.

8. Die Petrischale mit der Vorbereitung sollte unter das Mikroskop gelegt und gesichert werden mit Wachs an der Unterseite der Schale, um Bewegung zu verhindern.
   
   Abbildung 12. Die Platzierung der Vorbereitung unter dem Mikroskop. Verwenden Sie Wachs auf die Petrischale und Vorbereitung zu sichern.
9. Zwei Drähte jeweils mit einer kurzen Länge von Silberdraht an einem Ende eingeholt werden. Die Silber-Draht in einer geringen Menge Chlorbleiche für etwa 20 Minuten getaucht werden, um eine Ag-Cl-Beschichtung erhalten. Waschen Sie den Draht mit Wasser zu spülen. Ein Glas intrazellulären Pipette sollte erhalten und sorgfältig verfüllt mit einer langen Nadel eine Spritze mit einer 3M KCl-Lösung gefüllt. Die Pipette sollte nach unten gedreht werden (mit der Öffnung nach dem Boden) und gefüllt mit Lösung. Dadurch wird sichergestellt, dass alle überschüssigen KCl tropft aus der Rückseite der Elektrode. Seien Sie sicher, dass keine KCl verläuft entlang der Glaspipette, dass die Saline Bad geben wird. Schalten Sie die Pipette aufrecht, wenn Sie fertig Füllung mit Kaliumchlorid-Lösung. Der Silberdraht können dann in die Pipette gelegt werden. Das andere Ende ist der + (positive) Pol des Verstärkers Kopf Stufe verbunden. Die Pipette wird dann auf der Elektrode Sonde befestigt. Pflege sollte nicht auf die Spitze der Elektrode zu brechen. Ein dritter Draht an der Faraday-Käfig sollte in den grünen Pol der Kopf der Bühne platziert werden. (Negative) Pol unten - Schließlich der Ag-Draht der übrigen führen sollte in die Badewanne und das andere Ende an die platziert werden. Ein Draht ist auch aus dem Faradayschen Käfig auf den Boden Teil des AD-Wandlers Powerlab platziert werden. Der Kopf der Bühne ist es, die "Input-Sonde" auf Übernahme / Verstärker (Powerlab) verbunden.
   
   Abbildung 13. Leiter der Bühne Konfiguration. Der Draht mit dem grünen Eingang des Kopfes der Bühne ist mit dem Verstärker oder Faraday-Käfig geerdet. Der Draht mit dem roten Eingang ist mit der Elektrode Draht verbunden. Die schwarzen Eingang wird in die Bade-Lösung zu verbinden.
   
   Abbildung 14. "Test toggle" ist in der unteren Reihe zu testen Elektrode resistance.The "grob"-Knopf auch gefunden wirdunter DC-Offset, sollte gegen den Uhrzeigersinn gedreht werden. Die Verstärkung wird auf 50, die Signale verstärkt um einen Faktor von fünfzig gesetzt. Das Erdungskabel vom Kopf Bühne ist in der "GND"-Buchse Öffnung gesetzt.
10. Die LabChart Software sollte auf dem Desktop oder Laptop geöffnet werden. Passen Sie das Diagramm, um nur einen Kanal, indem Sie "Setup", dann Anzeige "Channel-Einstellungen." Unter "Channel-Einstellungen" ändern Anzahl der Kanäle zu eins. Klicken Sie auf "OK". Am oberen Rand des Diagramms, linken Ecke, sollte Zyklen pro Sekunde werden 2K. Set Volt (y-Achse) auf rund 200mV bis 500mV. Klicken Sie auf "Channel 1" auf dem rechten Teil des Bildschirms. Klicken Sie auf "Input Amplifier." Stellen Sie sicher, das Differential aktiviert ist.
    
    Der Verstärker-Ausgang sollte im Kanal sein. Die folgenden Einstellungen sollten mit dem Verstärker verwendet werden:
    • High Pass-DC
    • Notch Filter-OFF
    • Low Pass-20kHz
    • Capacity Comp .- Uhrzeigersinn
    • DC Offset Fein-und Course-Knopf-im Gegenuhrzeigersinn
    • DC-Offset (+ OFF-) - OFF
    • Gain-Regler-50
    • Input (DIFF MONO GND) - DIFF
    • MODE (STIM-GATE-REC) - REC
    • ΩTEST-OFF
11. Als Maß für die Elektrode Widerstand, sollte die Spannung durch den Strom, die 2,0 nA (dh, R = U / I oder Ohm-Gesetz) aufgeteilt werden. Der resultierende Wert ist der Widerstand der Glaselektrode. Der Widerstand sollte 20 bis 60 MOhm sein. Lower (<20) und eine hohe (> 100) sind nicht akzeptabel. Sobald der Widerstand bestimmt wurde, können intrazelluläre Aufnahme beginnt. Setzen Sie die Spitze der Glaselektrode in die Saline Bad. Stellen Sie sicher, ein Erdungskabel ist auch in der Saline Bad.
    Zu Beginn der Aufnahme drücken Sie starten am unteren Rand des Bildschirms. Achten Sie darauf, den Gewinn bis 5 V / div eingestellt ist. Verwenden Sie den Kurs Knopf am Verstärker auf der Linie auf dem LabChart bewegen Null vor dem Einsetzen der Elektrode. Das Toggle-Knopf sollte und dann sich mehrmals gedreht werden, um die Elektrode Widerstand zu testen. Als nächstes sollte die Amplitude der resultierenden Werte gemessen werden. Setzen Sie einen Marker auf die stetige Basislinie und legen Sie dann die zweite an der Spitze der Elektrode Widerstand zu erhalten.
12. Verwenden Sie die Elektrode Sonde und Mikroskop, um die Elektrode in die Längsmuskeln (DEM oder Del1 oder Del2) der Zubereitung (siehe Abbildung 16) aufzunehmen. Die Elektrode sollte kaum in den Muskel eingesetzt werden. Dringen nicht durch den Muskel. Verwenden Mikroskop und Sonde Einstellungen, um die Längsmuskeln zu finden und an die Elektroden in den Muskel einzufügen. Die hohe Intensität Beleuchtung sollte so eingestellt werden deutlich die Muskeln als Elektrode eingesetzt wird. Wenn Stossen Muskelfasern in dieser Vorbereitung kann man häufig in Räumen und Spalten innerhalb des Muskels führen. Dies ist der Grund, warum das Membranpotential erscheinen, dann verschwinden, dann wieder kann.
    
    Abbildung 15. Insertion der Elektrode in den Muskel.
13. Zur Messung des Membranpotentials, die groben Knopf am Verstärker auf der Linie auf dem LabChart bewegen Null vor dem Einsetzen der Elektrode. Poke eine Muskelfaser. Dann messen Sie die Amplitude der resultierenden Werte. Platzieren Sie eine Markierung auf der stetigen Basislinie und notieren Sie den Wert.
    Der Unterschied in der Markierung und der aktive Cursor wird auf der rechten Seite des Bildschirms angezeigt. Der Wert ist, gibt die Spannung. Die aufgezeichneten Spannung muss möglicherweise um den Betrag der Verstärkung des Verstärkers verwendet (dh 10x oder 100x Verstärkung) unterteilt werden. Die Spannung sollte von Volt in Millivolt (1 V = 1.000 mV) umgewandelt werden, wenn die Werte, auf die Software als Volt gemeldet werden.
14. Vorsichtig mit dem Mikroskop und Manipulatoren, die Elektrode aus dem Muskel zu entfernen. Poke anderen Muskelfaser und beachten Sie die Ruhemembranpotential. Man sollte sich mehrere Aufnahmen und bequem mit Maßnahmen sowie die Leitung der interzellulären Elektrode in den Muskelfasern des Interesses.
    Die Elektrode wird wahrscheinlich nicht in einer Muskelfaser Aufenthalt während der Wechsel von den verschiedenen verändert [K ^+] out-Lösungen. Am besten ist es, die Elektrode zurückziehen, ändern Sie dann die Lösung, dann wieder zu durchdringen, um eine Beschädigung des Muskels. Es ist am besten zu 3 Messungen pro Lösung aus getrennten Muskelfasern zu erhalten und einen Durchschnitt jede falsche Messwerte zu vermeiden.
15. Verwenden Sie eine Spritze zu entfernen und entsorgen Sie die Kochsalzlösung aus der Petrischale. Die Petrischale sollte mit der nächst höheren Konzentration von Kaliumchlorid Kochsalzlösung, für die Zubereitung vollständig ausgefüllt werden. Der gleiche Prozess sollte mit jeder Kalium-Lösung wiederholt werden und die Änderungen in der Spannung / Potential zu beachten und aufgezeichnet werden. Die Serie von [K ^+] _aus Flusskrebsen Salzlösungen wir benutzen, sind: 5,4, 20, 40, 60, 80, 100 mM.

2,3) Anatomy

Nun, da die Physiologie abgeschlossen ist, können wir die damit verbundenenAnatomie der Muskelfasern und Innervationsmuster. Übertragen Sie die Vorbereitung auf die Färbung Schüssel und fügen Sie die Methylenblau (1 Gramm von Methylenblau mit 100 ml Kochsalzlösung gemischt Krebse). Lassen Sie die Salzlösung baden die Vorbereitung für 5 Minuten und entfernen Sie dann und fügen frische Krebse Kochsalzlösung ohne den Fleck. Die Anatomie dieser Muskeln wurde im Detail über die Jahre hinweg beschrieben (Huxley, 1880; Pilgrim und Wiersma, 1963). Erst in jüngster Zeit einige der Muskeln anatomisch haben, beschrieb physiologisch und biochemisch (Cooper et al, 1998;. Griffis et al, 2000;. Sohn et al, 2000.).

Die allgemeinen anatomischen Anordnung der Muskeln ist in Abbildung 16 (rechte Seite der Abbildung zu diesem Zweck) dargestellt. Suchen Sie nach dem Haupt-Nerv, der in erster Linie innerviert die Muskeln innerhalb eines Segments. Skizzieren Sie die Innervationsmuster der SEM, Del2, Del1 und DEM Muskeln in einem Segment. Der Bauch muss sich vollständig durch Pinning der Vorbereitung in der Schüssel fest gespannt werden. Nächstes entfernen Sie die Kochsalzlösung und fügen Sie die Fixierlösung. Der Fix-Lösung ist ein Bouin-Lösung (hergestellt mit gesättigten Pikrinsäure, Formaldehyd und Essigsäure; Sigma-Aldrich Co.).

VORSICHT. Lassen Sie sich nicht diese Lösung auf die Haut oder in die Augen. Vermeiden Sie die Dämpfe der Lösung durch die Arbeit unter dem Abzug. Wenn Ihre Augen brennen waschen Sie Ihre Augen sofort an der Augenwaschstation starten.

Lassen Sie die Bouin-Lösung auf die Vorbereitung für etwa 10 Minuten bleiben und dann mit einer Pipette und tauschen die Lösung für Kochsalzlösung. Schneiden Sie ein dünnes Stück Del1 oder Del2 Muskel aus und legen Sie auf einem Glasträger. Beschriften Sie die Folie. Wiederholen Sie den Vorgang für die SEM Muskel. Sehen Sie sich die Sarkomere Bandenmuster in beiden Gewebe Zubereitungen. Sie können das zusammengesetzte Mikroskop und stellen Sie die Ziele entsprechend dem Bandenmuster zu sehen. Wenn möglich, nehmen ein digitales Foto durch das Okular des Mikroskops (Hinweis: Einige Handy-Kameras eignen sich gut für dieses Verfahren).

Abbildung 16. Schematische Darstellung einer ventralen Ansicht der dorsalen Teil der Krebse Bauch zeigt die Streckmuskulatur der einzelnen Segmente. Die dorsalen Membran Bauch Muskel (DMA) und der oberflächlichen Strecker Zubehör Muskel Kopf (SEAcc) treten in den Segmenten 1 bis 5 des Bauches mit unterschiedlicher Ausrichtung für jedes Segment. Mit Ausnahme des Segments 1, haben diese Muskeln ihre Bindungsstellen an ihrem vorderen Ende an den verkalkten Tergit und am hinteren Ende in den Gelenkflächen Membran. In Segment 1, haben die homologen Muskeln ihre vorderen Bindungsstellen an den Gelenkflächen Membran zwischen Brust und Hinterleib befindet. Die Darstellung wurde auf Fotomontagen von Methylenblau gefärbte Präparate basieren. Auf der linken Seite der Figur all den tiefen Extensoren wurden entfernt, um den dorsalen oberflächlichen Extensoren zeigen. Scale = 2,35 mm. (Entnommen aus Sohn et al. 2000).

3. Ergebnisse

Die folgenden Fragen und Datenverarbeitung zeigen die wichtigsten Grundsätze und Ziele dieses Laborverfahren.

1. Zeichnen Sie die Maßnahmen für den ruhenden Membranpotentiale an jedem [K ^+] erhalten _out verwendet. Schauen Sie, ob die beobachteten und hypothetischen Linien in ihrer Neigung abgestimmt sind. Zur Aufnahme der Werte mit einem semi-log-Plot mit der x-Achse variiert [K ^+] _als ein Protokoll und die y-Achse der Membranpotentiale (wie unten abgebildet, Abbildung 17). (Download kostenlos Millimeterpapier, wenn nötig http://incompetech.com/graphpaper/logarithmic/ )
   
   Abbildung 17. Millimeterpapier
   Verwenden Sie die mittlere Ruhemembranpotential bei 5,4 mM erhalten [K ^+] out für die Einleitung des hypothetischen und beobachteten Linien zum Vergleich.
   Wenn die Linien passen nicht zu diskutieren, warum dies sein könnte.
2. Wenn Sie die externe Ebene der Na ^+-Ionen verändert, würden Sie erwarten, dass die gleiche Art von Veränderungen wie zum Ändern der K ^{+-Konzentration} beobachtet?
3. Wie gut hat Methylenblau färben die Muskeln, die Nerven im Vergleich? Warum könnte es Unterschiede? Ist Methylenblau heute für die Identifizierung von Gewebe oder den Kontrast in lebenden menschlichen Zellen? Welche Beziehung gibt es mit Sigmund Freud und Flecken in Krebsen verwendet?
4. Beachten Sie die Unterschiede im Sarkomer Muster zwischen den DEL-und SEM-Muskeln. Wenn ja, was könnte der Grund sein? Haben alle Muskeln haben die gleiche Ruhe Sarkomer Distanzen? Zeichnen Sie die Muskeln Bandenmuster Sie mit dem Mikroskop und Label so viel von der Gestalt wie möglich (in Relation zu bekannten Sarkomer Muskel Anatomie) beobachtet.

4. Messen Synaptic Reworten

1) EINFÜHRUNG

Die Bauch-extensor Muskel-Präparat verwendet werden, um das Ruhemembranpotential demonstrieren ist auch ideal für den Nachweis der Induktion der synaptischen Antworten auf die NMJs aus den verschiedenen Muskeln. Einige Muskeln in Krebstieren selektiv entweder durch einen phasischen oder tonischen Motoneuronen innerviert, obwohl einige einzelne Fasern von beiden phasischen und tonischen exzitatorischen Motoneuronen, wie Streckmuskel in die Krebse Laufbeinen (Atwood, 2008 innerviert werden können, siehe JOVE Produktion id # 2319-Wu und Cooper, 2010) und den meisten anderen Beinmuskeln (Wiersma, 1961a). Durch gezielte Stimulation phasischen und tonischen motorischen Neuronen, kann physiologische Unterschiede in der EPSPs gemessen werden. Phasischen motorischen Neuronen produzieren schnellen Zucken von Muskelfasern und evozieren EPSPs in der Größenordnung von 10-40 mV. Die phasische Reaktion kann schnell drücken mit 5-10 Hz-Züge der Stimulation. Das Tonikum Motoneuronen führen zu kleineren EPSPs, dass in Gegenwart von einer höheren Frequenz (10-50 Hz) Stimulation erleichtert werden kann. Strukturell sind die präsynaptischen phasischen und tonischen Terminals am NMJs verschiedenen (Atwood und Cooper, 1996; Bradacs et al, 1997;.. Cooper et al, 1998).

Überraschenderweise den Phänotyp der phasischen physiologischen Reaktionen können eine Transformation zu einem tonisch-ähnlichen Zustand durch elektrisch Klimaanlage phasischen Neuronen für ein paar Stunden täglich über 7 Tage (Cooper et al, 1998;. Mercier und Atwood, 1989). Auch die Empfindlichkeit gegenüber Neuromodulation der transformierten NMJs eine Primzahl ist für die Untersuchung der Regulation der Rezeptor-Expression (Griffis et al., 2000).

In dieser relativ robust Vorbereitung (Krebse Bauchmuskulatur), sind beide tonische und phasische Reaktionen einfach aufgezeichnet und untersucht für die Erleichterung und / oder Depression der synaptischen Antworten mit abwechslungsreichen Stimulation Paradigmen. Mit diesen Vorbereitungen werden die Kursteilnehmer in der Lage sein, Allgemeinheiten des phasischen und tonischen synaptischen Antworten, indem sie eine Nerven-Bündel zu erkennen.

Eine zusätzliche NMJ Vorbereitung präsentiert wird zur Überwachung intrinsische Motorik und sensorische Reize induzierten motorischen Aktivität im ZNS verwendet. Dies ist die oberflächliche Beugemuskeln auf der Bauchseite des Krebses Bauch. Diese Vorbereitung wird auch benutzt, um die sensorische-CNS-motor-Muskel-Schaltung zu überwachen und die Auswirkungen von Neuromodulatoren (Strawn et al., 2000).

In jedem der Abdominalsegment (mit Ausnahme des letzten) gibt es drei funktionellen Gruppen von Muskeln: (1) die Steuerung Pleopoden (swimmerets) Bewegung, (2) drei Streckmuskeln und (3) drei Beugemuskeln. Die Beuger und Strecker sind antagonistische Muskelgruppen, die über entweder abdominal Beugung oder Streckung von verursacht eine Drehung um die segmentale Scharniere zu bringen. Die phasische Muskulatur nimmt den größten Teil des Volumens des Bauches, während die tonischen Muskeln dünne Fasern, die dorsal (Strecker) und ventralen (Flexoren) Aspekt jedes Abdominalsegment span umfassen.

In Krebse, sind die Tonika abdominale Beugemuskeln Krebse in jeder Hälfte Segment um fünf Motoneuronen und durch eine periphere hemmenden Neuronen innerviert. Die exzitatorischen Motoneuronen verwenden Glutamat als Neurotransmitter. Glutamat depolarisiert die Muskelfasern durch was zu einer Erhöhung der Durchlässigkeit in erster Linie auf Natrium-Ionen. Die hemmende Neuronen Release gamma-Aminobuttersäure (GABA), die in der Regel hyperpolarisiert die Muskelfasern, indem ein Anstieg der Durchlässigkeit für Chlorid-Ionen. In einigen Krustentier Muskeln (vor allem in den Gliedmaßen), stellen die peripheren hemmenden Neuronen synaptische Kontakte mit motorischen Neurons Terminals sowie mit den Muskelfasern, und die Menge des Senders durch den Motor Neuron (präsynaptische Inhibition) (Dudel und Kuffler, 1961 veröffentlicht ). Dieses Phänomen ist nicht in der Tonika Beugemuskeln Krebse.

Das Bauchmark von Flusskrebsen ist eine bilateral symmetrische Struktur über die gesamte Länge des Tieres. Es gibt ein Ganglion pro Körpersegment. In den Bauch (6 Segmente) enthält jedes Ganglion mehrere hundert Neuronen, und jedes der beiden Verknüpfungen besteht aus ein paar tausend Axonen. Die Zellkörpern bilden eine Schicht mehrere Zellkörper dick auf der ventralen Oberfläche jedes Ganglion. Unmittelbar oberhalb der Zellkörper Schicht ist ein feines Geflecht von neuronalen Prozessen, die Neuropile. Alle synaptische Interaktionen kommen hier; die Zellkörper sind frei von Synapsen.

Jeder Abdominalganglion (mit Ausnahme des letzten) hat drei Wurzeln auf jeder Seite. Die erste Wurzel enthält Axone von Neuronen innervieren die Pleopoden Muskulatur und sensorischer Axone, die zweite Wurzel enthält Axone innervieren phasischen und tonischen Streckmuskulatur und sensorischer Axone und die dritte Wurzel, die den Nervenstrang mehrere Millimeter kaudal der Ganglion verlässt, enthält Axone innervating phasischen und tonischen Beugemuskulatur. Es gibt zwei Filialen der dritten Wurzel. Der tiefe Ast (IIIa) innerviert nur phasischen Beugemuskeln. Der oberflächliche Ast des dritten Wurzel (IIIb) in jeder Halbzeit-Segment enthält sechs Axone, die die Tonika Beugemuskeln innervieren.

Die Neuronen innervieren die Tonika flexor sind spontan aktiv, im Gegensatz zu den phasischen efferenten Neuronen und in eine gute Vorbereitung, sie wird auch weiterhin für viele Stunden nach dem Bauch Feuer aus dem Tier entfernt worden. Für einen Überblick über den historischen Charakter der Entdeckungen in dieser Bauch-Vorbereitungen getroffen siehe Atwood (2008). Die Zellkörper von vier der Motoneuronen und der peripheren hemmenden Neuronen innervieren die Tonika Beugemuskeln in jedem halbwegs Segment sind in den Ganglienzellen dieses Segments liegt. Die Zellkörper der übrigen motorischen Neurons wird in den nächsten caudal Ganglion entfernt. Diese Neuronen können zuverlässig voneinander auf der Grundlage von extracelluarly aufgezeichnet spike Amplituden aus. Wenn der Tonika Beugemuskeln von einem halben Segment wird zusammen mit den beiden Ganglien, welche die Neuronen innervieren dieses Muskels entfernt, fünf Neuronen zeigen in der Regel ein gewisses Maß an spontanen Aktivität. Diese Neuronen sind auf der Grundlage der relativen extrazellulären spike Amplitude nummeriert, in aufsteigender Reihenfolge. F1 bis F4 sind Motoneuronen und f5, dem größten spontan aktiven Neuronen, ist die periphere flexor Inhibitor. f6, dem größten Motor Neuron ist ein exzitatorischen Motoneuronen, die selten spontan aktiv.

Der spontane Charakter der tonischen motorischen Neuronen-Aktivität moduliert werden kann durch die exogene Applikation von Verbindungen oder durch die Bereitstellung eines sensorischen Stimulus, um die Nagelhaut im gleichen Segment, der für die motorischen Nerven-Aktivität wird überwacht.

2) Dissection

Um die abdominale extensor Vorbereitung das gleiche Verfahren wie oben für die Prüfung der ruhende Membranpotentiale in Bezug auf extrazelluläre Kalium beschrieben. Der Unterschied ist die Pflege der segmentalen Nerven-Bündel, die an der Seite des Panzers fährt. Dieser Nerv wird in eine Saug-Elektrode, die als der stimulierenden Elektrode dient gezogen werden. Stimulieren Sie mit 1 Hz für die Überwachung der phasischen Reaktionen. Stimulieren Sie mit kurzen Ausbrüchen von Impulsen 10Hz für 10 bis 20 Reize bei gleichzeitiger Überwachung der Tonika Antworten.

Die experimentellen Verfahren zur Pflege von Experimenten auf der Krebse Tonic Beugemuskeln sind verschieden und man braucht zum Verlassen des Bauchmark intakt. Eine Zubereitung aus mehreren Abdominalsegmenten ist. Dies ist wie folgt:

1. Ein Flusskrebs etwa 6-10 cm Körperlänge sollte erhalten (oder eine überschaubare Größe) sein. Besorgen Sie sich die Krebse, indem es von der Rückseite des Kopfes oder ca. 2 oder 3 Zentimeter von der Rückseite der Augen. Stellen Sie sicher, dass die Klauen der Krebse oder Mund nicht erreichen können, der Experimentator bei der Handhabung der Krebse. Entsorgen Sie den Kopf und Gliedmaßen nach dem Herausnehmen.
2. Verwenden Sie die Schere, um schnell den Kopf. Machen Sie einen sauberen und schnellen Schnitt von hinten die Augen der Krebse.
   
   Abbildung 18. Das Bild zeigt die Platzierung des Schnittes auf den Kopf des Krebses zu entfernen.
   Die Beine und Scheren des Krebses kann an dieser Stelle entfernt werden, um Verletzungen zu vermeiden. Stylets auf Männer und swimmerets auf beiden Männchen und Weibchen können auch entfernt werden (Abbildung 19 und 20). Als nächstes trennen den Bauch aus dem Thorax. Machen Sie einen Schnitt entlang der artikulierenden Membran, die die Bauch-und Thorax (Abb. 20) verbindet.
3. Speichern Sie die Bauch Teil der Krebse und der Entsorgung des Thorax.
   
   Abbildung 19. Das Bild zeigt die Platzierung der Stilette, die aus der Krebse entfernt werden können.
   
   Abbildung 20. Das Bild zeigt die Platzierung des Schnittes auf den Thorax aus dem Bauch zu entfernen.
   
   Abbildung 21. Entfernung der Brust aus dem Bauch. Der Schnitt sollte in kreisförmig entlang der Linie der Verbindung der Segmente vorgenommen werden.
   
   Abbildung 22. Das obere Bild zeigt den Bauch mit Anhängseln. Bild unten zeigt die Entfernung der Bauch-Anhängsel.
4. Legen Sie die isoliert Schwanz Vorbereitung in Kochsalzlösung in einer großen Petrischale. Pin den Schwanz und den oberen Teil der Vorbereitung auf den Teller. Achten Sie darauf, das Präparat zu sichern. Verwenden Sie ein Skalpell, um einen quadratischen Teil der Bauchseite der Vorbereitung zwischen den Rippen entfernen.
   
   Abbildung 23.Zeigt, wo der Schnitt gemacht, um den ventralen Trank der Zubereitung zu entfernen sollte.
5. Ein kleiner Schnitt soll (kann auch mit der Schere gemacht werden). Eine Klappe sollte geschnitten werden und hob nach oben. Die Klappe kann dann mit der Schere entfernt werden, Freilegung der tiefen Beugemuskeln. Das Mikroskop sollte in diesem Prozess verwendet werden, um Präzision bei der Entfernung der ventralen Teil der Vorbereitung zu gewährleisten.
   
   Abbildung 24. Cutting Vorbereitung mit einer Schere, um Muskeln freizulegen.
   
   Abbildung 25. Top Bild zeigt das Greifen der Klappe mit einer Pinzette. Bild unten zeigt die Entfernung der Klappe von der Vorbereitung mit dem Mikroskop.
   
   Abbildung 26. Exposure der oberflächlichen Flexoren.

3) Intrazelluläre Aufnahme:

Abbildung 27. Insgesamt Setup des Kontrollgeräts.

1. Die Petrischale mit der Vorbereitung sollte unter das Mikroskop gelegt und gesichert werden mit Wachs an der Unterseite der Schale, um Bewegung zu verhindern.
   
   Abbildung 28. Zeigt die Platzierung der Vorbereitung unter dem Mikroskop. Verwenden Sie Wachs auf die Petrischale und Vorbereitung zu sichern.
2. Zwei Drähte mit kurzen Länge von Silberdraht an einem Ende eingeholt werden. Die Silber-Draht in einer geringen Menge Chlorbleiche für etwa 20 Minuten getaucht werden, um eine Ag-Cl-Beschichtung erhalten. Waschen Sie den Draht mit Wasser zu spülen. Ein Glas intrazellulären Pipette sollte erhalten werden, und sorgfältig ausgefüllt mit einem KCl (3 M)-Lösung. Die Pipette sollte nach unten gedreht werden (mit der Öffnung nach dem Boden) und gefüllt mit Lösung. Letztere sorgt dafür, dass überschüssiges KCl tropft aus der Rückseite der Elektrode. Seien Sie sicher, dass keine KCl verläuft entlang der Glaspipette, die in das Solebad geben wird. Schalten Sie die Pipette aufrecht, wenn Sie fertig Füllung mit Kaliumchlorid-Lösung. Der Silberdraht können dann in die Pipette gelegt werden. Das andere Ende ist der + (positive) Pol am Kopf der Bühne verbunden. Die Pipette wird dann auf der Elektrode Sonde befestigt. Pflege sollte nicht an die Elektrode Pipette zu brechen. Ein dritter Draht an der Faraday-Käfig sollte in den grünen Pol der Kopf der Bühne platziert werden. (Negative) Pol unten - Schließlich der Ag-Draht der übrigen führen sollte in die Badewanne und das andere Ende an die platziert werden. Ein Draht ist auch aus dem Faradayschen Käfig auf den Boden Teil des AD-Wandlers Powerlab platziert werden. Der Kopf der Bühne ist es, die "Input-Sonde" auf Übernahme / Verstärker (Powerlab) verbunden.
   
   Abbildung 29. Leiter der Bühne Konfiguration. Der Draht mit dem grünen Teil des Kopfes der Bühne ist mit dem Verstärker oder Faraday-Käfig geerdet. Der Draht mit dem roten Teil ist mit der Elektrode Draht verbunden. Der schwarze Teil wird benutzt, um in die Bade-Lösung zu verbinden.
   
   Abbildung 30. "Test toggle" ist in der untersten Zeile der Elektrode Widerstand zu testen. Die "grobe"-Knopf ist auch unter DC-Offset, die gegen den Uhrzeigersinn gedreht werden sollte gefunden. Die Verstärkung wird auf 50, die Signale verstärkt um einen Faktor von fünfzig gesetzt. Das Erdungskabel vom Kopf Bühne ist in der "GND"-Buchse Öffnung gesetzt.
3. Die LabChart Software sollte auf dem Desktop oder Laptop geöffnet werden. Passen Sie das Diagramm, um nur einen Kanal, indem Sie auf "Einstellungen", dann Anzeige "Channel-Einstellungen." Unter "Channel-Einstellungen" ändern Anzahl der Kanäle zu eins. Klicken Sie auf "OK". Am oberen Rand des Diagramms, linken Ecke, sollte Zyklen pro Sekunde werden 2K. Set Volt (y-Achse) auf rund 200mV bis 500mV. Klicken Sie auf "Channel 1" auf dem rechten Teil des Bildschirms. Klicken Sie auf "Input Amplifier." Stellen Sie sicher, das Differential aktiviert ist.
   
   Der Verstärker-Ausgang sollte im Kanal sein. Die folgenden Einstellungen sollten mit dem Verstärker verwendet werden:
   
   • High Pass-DC
   • Notch Filter-OFF
   • Low Pass-20kHz
   • Capacity Comp .- Uhrzeigersinn
   • DC Offset Fein-und Course-Knopf-im Gegenuhrzeigersinn
   • DC-Offset (+ OFF-) - OFF
   • Gain-Regler-50
   • Input (DIFF MONO GND) - DIFF
   • MODE (STIM-GATE-REC) - REC
   • ΩTEST-OFF
4. Zur Messung der Elektrode Widerstand, sollte die Spannung durch den Strom, die 2,0 nA ist aufgeteilt werden. Der resultierende Wert ist der Widerstand der Glaselektrode. Der Widerstand sollte 20 bis 60 MOhm sein. Sobald der Widerstand bestimmt wurde, können intrazelluläre Aufnahme beginnt. Setzen Sie die Spitze der Glaselektrode in die Saline Bad. Stellen Sie sicher, ein Erdungskabel ist auch in der Saline Bad.
   Zu Beginn der Aufnahme drücken Sie "Start" am unteren Rand des Bildschirms. Achten Sie darauf, den Gewinn bis 5 V / div eingestellt ist. Verwenden Sie den Kurs Knopf am Verstärker auf der Linie auf dem LabChart bewegen Null vor dem Einsetzen der Elektrode. Das Toggle-Knopf sollte und dann sich mehrmals gedreht werden, um die Elektrode Widerstand zu testen. Als nächstes sollte die Amplitude der resultierenden Werte gemessen werden. Setzen Sie einen Hersteller die stetige Basislinie und legen Sie dann die zweite an der Spitze der Elektrode Widerstand zu erhalten.
5. Verwenden Sie die Elektrode Sonde und Mikroskop, um die Elektrode in den Muskel einzufügen. Dringen nicht durch den Muskel. Verwenden Mikroskop und Sonde Einstellungen, um die dünne Schicht von Muskelfasern zu finden und an die Elektroden in die Fasern einfügen. Die hohe Intensität Beleuchtung kann als Lichtquelle verwendet werden, wenn Eindringen in die Muskulatur.
   
   Abbildung 31. Insertion der Elektrode in den Muskel.
6. Es muss darauf geachtet, um eine Beschädigung der Nervenwurzeln, die oberflächlichen Muskeln werden.
   Es ist ratsam, damit die Salzlösung baden die Vorbereitungen kühl (10-15 Grad Celsius) und gut mit Sauerstoff während der Durchführung der experimentellen Verfahren. Wenn Kühlaggregate nicht verfügbar sind, ersetzen Sie die Salzlösung mit frischen, gekühlten Salzlösung regelmäßig. Sauerstoffgas, oder zumindest Luft, sollte durch die Kochsalzlösung perlen.
7. Notieren Sie sich die spontane Aktivität der EPSPs. Beachten Sie die unterschiedlichen Größen der EPSPs und wenn IPSPs vorhanden sind.
8. Sehr vorsichtig einen kleinen malen Busch und von Hand entlang der Nagelhaut Rand innerhalb der gleichen Segment, das eine ist die Überwachung der spontanen Aktivität zu stimulieren. Beachten Sie eine Veränderung in der Häufigkeit der Antworten, und wenn andere Größe EPSPs scheint, dass waren nicht da vor Stimulierung der Nagelhaut.
   
   Abbildung 32. Vorbereitung mit stimulierenden Bürste und Nervenwurzeln. (Modifiziert nach Strawn et al., 2000)
9. Die Stimulation kann nach sorgfältiger Austausch der Solebad mit einer mit einer Neuromodulator wie Serotonin (1 microM) oder Kochsalzlösung mit CO ₂ sprudelte wiederholt werden. Beachten Sie die Auswirkung auf die Aktivität Profil für einen bestimmten Reiz. Beachten Sie auch, wenn Austausch der Kochsalzlösung zurück an die frische salzhaltige kehrt die Aktivität zu ihrem ursprünglichen Zustand.
10. Als nächstes kann man neuronale Aktivität innerhalb der sensorisch-CNS-Motor Neuron-Schaltung überwacht in vielfältiger Weise. Wir können eine Saugelektrode anstelle einer intrazellulären Elektrode (Abbildung 33) zu verwenden, um zu überwachen Motoneuron Aktivität. An der Spitze des Glases Saugelektrode ist Kunststoffrohr gelegt, die eine Öffnung in der richtigen Größe, um den Nerv in die Spitze zu ziehen. Die Öffnung sollte nicht zu groß sein, da die Nerven fallen würde aus; oder zu klein, weil der Nerv durch den Druck der Elektrode beschädigt werden würde. Das Kunststoffrohr wird über einer Flamme gezogen und beschnitten zurück, um die Größe benötigt.
    
    Abbildung 33. Set mit Saugelektrode Aufnahmeanordnung.
    Positionieren Sie den Mikromanipulator in einer Position, wo die Saugelektrode hat leichten Zugang zu den Solebad. Saug-up Kochsalzlösung, bis sie in Kontakt mit dem Silberdraht in der Saug-Elektrode. Ordnen Sie den anderen Draht auf dem cut-Seite Saugelektrode nahe der Spitze der Elektrode, so dass beide Drähte in Kontakt mit dem Solebad werden.
    Wie für die elektrische Überwachung verbinden die AC / DC Differential Amplifier (Verstärker) an den Power Lab 26T. Tun Sie dies, indem Sie das richtige Kabel aus Input 1 auf der PowerLab 26T auf den Ausgang des Verstärkers.
    • Der Verstärker Instrument Kontrollen sollten die folgenden Einstellungen festgelegt werden:
      • High Pass-DC
      • Notch Filter-OFF
      • Low Pass-20kHz
      • Capacity Comp .- Uhrzeigersinn
      • DC Offset Fein-und Course-Knopf-im Gegenuhrzeigersinn
      • DC-Offset (+ OFF-) - OFF
      • Gain-Regler-50
      • Input (DIFF MONO GND) - DIFF
      • MODE (STIM-GATE-REC) - REC
      • ΩTEST-OFF
    Verbinden Sie den Kopf der Bühne auf die "Input-Sonde" am Verstärker.
    Schließen Sie die elektrischen Leitungen von der Saug-Elektroden am Kopf der Bühne. Die Drähte sollten mit dem roten (positive) in der oberen linken angeschlossen werden, grün (Masse) in der Mitte, schwarz (negative an der Unterseite. Dies ist in Abbildung 34 dargestellt. Das Erdungskabel kann einfach in der Saline Bad genommen werden.
    
    Abbildung 34. Leiter der Bühne Konfiguration
11. Nun verbinden Sie das USB-Kabel aus dem PowerLab 26T an den Laptop. Stellen Sie sicher, dass sowohl der Verstärker und PowerLab26T angeschlossen sind und eingeschaltet, bevor LabChart7 auf dem Computer.
12. Öffnen LabChart7.
    • Die LabChart Welcome Center-Box öffnet sich. Schließen Sie es.
    • Klicken Sie auf Setup
    • Klicken Sie auf Kanaleinstellungen. Ändern Sie die Anzahl der Kanäle auf 1 (unten Kasten links) drücken OK.
    • An der oberen linken Ecke des Diagramms stellen Sie den Zyklen pro Sekunde bis etwa 2k. Setzen Sie den Volt (y-Achse) bis etwa 500 oder 200 mV.
    • Klicken Sie auf Kanal 1 auf der rechten Seite des Diagramms. Klicken Sie auf Eingang Verstärker. Stellen Sie sicher, dass die Einstellungen: single-ended, AC-gekoppelt, und (invertiert das Signal bei Bedarf), Invertzucker und Anti-Aliasing, werden überprüft.
    • Um die Aufnahme zu starten drücken beginnen.
    Wir können aus der Branche der ^3. Wurzel, die den oberflächlichen Flexoren (Zweig IIIb) innerviert die Größe der Aktionspotentiale mit extrazellulären Aufnahme-Monitor aufzuzeichnen. Die extrazelluläre Nervenimpulse werden als "Spikes" genannt. Recall, dass es fünf Erreger Motoneuronen und einem Inhibitor Motoneuronen in dieser Wurzel (Kennedy und Takeda, 1965; Velez und Wyman, 1978). Stimulation der Kutikula mit einem Pinsel oder die Exposition von Neuromodulatoren können genutzt werden (Abbildung 35). Der Pinsel kann von Hand oder für eine konsistente Stimulation verwendet werden sie auf einem Mikromanipulator konnte montiert werden, um den Druck und die Bewegung zu kontrollieren.
    
    Abbildung 35. Activity der ^3. Wurzel vor und während der Kutikula Stimulation in Kochsalzlösung (oben) und in 100 nM 5-HT (unten). Die Zeit, während Nagelhaut Stimulation ist durch den Balken angezeigt. Beachten Sie die verstärkte Aktivität vor und nach Stimulation, wenn die Zubereitung in 5-HT (modifiziert nach Strawn et al., 2000) wird gebadet.
    Wir können aus dem ^1. oder ^2. Wurzeln indem eine en passant die Aufnahme des Nervs Rekord, oder können wir die Wurzel entfernt Transekt von der VNC und aufzeichnen reinen sensorischen Input aus der Peripherie, die entsenden würden Signale in den VNC. So würden Sie aus der durchtrennten Wurzel, die zu der Peripherie für die sensorische Aktivität aufzuzeichnen.
    Die ^2. Wurzel enthält sehr großen primären afferenten Axone aus dem Muskel-Rezeptor-Organe (MRO) und kleinere Axone der Efferenzen zu extensor Motoneuronen (Fields and Kennedy, 1965). Es gibt viele Riechzellen in der ^1. und ^2. Wurzeln.
    Die mechanosensorischen Neuronen haben direkte Verbindungen durch elektrische Synapsen mit den seitlichen riesigen Axone (LG) (Krasne 1969; Zucker 1972). Auch sind mechanosensorischen Neuronen bekannt Interneuronen über chemische Synapsen anzuregen.
    Um zu untersuchen, wie sensorische Reize können Motoneuronen-Aktivität zu beeinflussen, durch eine sinnlich-CNS-Motor Neuron-Schaltung, können wir erfassen die synaptischen Antworten in einen Muskel. Verschiedene Aspekte der Schaltung werden wir untersucht werden können. Zum Beispiel können wir aus den sensorischen Nervenwurzel allein oder die motorische Wurzel mit oder ohne intakte sensorischen Input in das VNC Um die Spike-Frequenz-Aufnahmen zu analysieren aufnehmen, kann man über einen Zeitraum Zeit unter verschiedenen Bedingungen zu zählen. Die Maßnahmen können vor unternommen werden, um Stimulation und während der Bürste Stimulation für eine bestimmte Zeit (Abbildung 35) Bürste. Man kann wiederholen Sie die Bedingungen 5-mal und erhalten die durchschnittliche prozentuale Veränderung in der Frequenz als Maß, um Vergleiche anzustellen.
    Man kann auch gelten exogene Verbindungen wie Serotonin (Strawn et al., 2000) oder Acetylcholin (Ach), Nikotin-oder Glutamat. Verschiedene Verhaltensstörungen Aktionen für Nikotin in wirbellosen Tieren beschrieben. Dies würde darauf hindeuten das Vorhandensein von Nikotinrezeptoren (Tsunoyama und Gojobori, 1998). Glutamat ist ein wichtiger erregende Neurotransmitter in den meisten Wirbellosen am NMJ und Ach ist der wichtigste erregende Neurotransmitter im ZNS (Monoghan et al, 1989;. Watkins, et al, 1990).
    Man kann versuchen Heptanol oder CO ₂ sprudelte Kochsalzlösung, da sie die Krebse septiert (oder Spalt) Kreuzungen innerhalb der Schaltung zu entkoppeln als Dr. Sonja M. Bierbower (University of Kentucky) in ihrer Dissertation die Forschung gezeigt hat. Diese Maßnahme darf nicht verändert ganze Verhalten der Tiere Rechnung, wenn sie hohen CO ₂ in die Umwelt (Bierbower und Cooper, 2010) ausgesetzt. Wenn Sie die Nagelhaut zu stimulieren mit einer Bürste und fahren sensorischen Input und Aufzeichnen einer Antwort in der Motoneuronen, beachten Sie, wenn es einen Unterschied in der Aktivität vor und während Heptanol oder CO _{2-Exposition.} Dies kann oder kann nicht darauf schließen, Gap Junctions eine Rolle in der sensorisch-CNS-Motor Neuron-Schaltung zu haben.

Diskussion

Membrane Potential

Bereits 1902 wurde Bernstein mit den Themen ein Ruhepotential in das Axon eines Tintenfisches zu tun haben. Es ist faszinierend, zu prüfen, wie diese frühen Ideen und Beobachtungen Berstein (1902) und Nernst (1888) später in der Forschung Membran Physiologie beeinflusst. (Siehe Überprüfung durch Malmivuo und Plonsey, 1995; auch auf der www http://www.bem.fi/book/ ). Es sind noch bis zum heutigen Tag, Durchbrüche zu über Ionenkanal-Funktion und Eigenschaften von biologischen Membranen, die sehr bedeutsam für das Verständnis der zellulären Physiologie, welche die Funktion von Geweben, Organen und Systemen bezieht gemacht werden.

Der Vergleich der experimentellen und theoretisch abgeleiteten Auswirkungen externer [K ^+] auf das Ruhemembranpotential zeigt den Einfluss der Ionen auf das Membranpotential. Weitere Experimente mit dem gleichen Präparat bleiben durchgeführt werden, um grundlegende physiologische Fragen anzugehen. Einige waren im Jahr 1968 von Atwood und Parnas hervorgehoben und sind noch nicht vollständig gelöst werden. Mit den Techniken in dieser Übung erhalten, kann man vorgehen, um viele Fragen noch in anderen experimentellen Präparaten sowie in physiologischen Anwendungen im Zusammenhang mit Medizin und Gesundheit zu beantworten. Wir haben den Nutzen eines Modells wirbellosen Vorbereitung auf grundlegende Fragen relevant für alle Tiere-Adresse gezeigt.

Mit den Kenntnissen über die elektrochemischen Gradienten von Ionen in diesem oben genannten Übung können Sie jetzt auf die Erregbarkeit der Membranen Voraus durch die Untersuchung der synaptischen Übertragung auf neuromuskuläre Präparate in der Krebse.

Messen Synaptic Responses

Die Details für den ersten Teil dieses Labors, und die damit verbundenen Film zur Verfügung gestellt haben wichtige Schritte für die Aufnahme Membranpotentiale und Untersuchung von Muskel-Struktur zur Verfügung gestellt. Im zweiten Teil dieses Labors, sofern der Nachweis einer Dissektion und Aufnahme synaptischen Übertragung im NMJs der phasischen und tonischen motorischen Einheiten ein Engagement in grundlegende Konzepte in der Physiologie. Die Exposition gegenüber einem neuronalen Schaltkreis, der in Teil kann kann man damit verbundenen Verhaltensweisen im intakten Tier erklären, hat das Potenzial nicht nur für Studenten, um verschiedene offene Fragen im Rahmen ihrer Laborübung zu untersuchen, sondern auch für die zukünftige Forschung auf neuronale Schaltkreise in einem gut gegründet wirbellosen Vorbereitung (Kennedy et al, 1969;. Antonsen und Edwards, 2003)

Diese Präparate können auch zur synaptischen Erleichterung, Depressionen und langfristige Plastizität (die nicht in dieser Laborstudie untersucht) zu untersuchen. Selbst innerhalb einiger Arten von Krebsen, hängt neuronalen Plastizität auf den experimentellen Stimulation Bedingungen (Mercier und Atwood, 1989;. Cooper et al, 1998) sowie ihrer natürlichen Umgebung. Inwieweit die Fähigkeit zur synaptischen Wirksamkeit und Muskel Dynamik verändern dient das Tier bleibt zu untersuchen. Da Krebse ändern ihr Verhalten in Bezug auf saisonale Schwankungen und die Häutung Zyklus zu tun, gibt es relativ langfristige Tätigkeit Unterschiede in ihrer neuromuskulären Systems. Es hat sich gezeigt, dass die phasischen motorischen Nervenenden der Kralle näher Muskeln der klassischen phasischen Morphologie weisen im Winter, sondern anschwellen und mehr Krampfadern entlang der Länge des Terminals während der Sommermonate (Lnenicka 1993; Lnenicka und Zhao, 1991).

Einige frühe Studien in Flusskrebse seitlichen Riese (LG) Interneuronen im Bauchmark durchgeführt wurde, zeigte die Anwesenheit von Gap Junctions (Johnson, 1924; Watanabe und Grundfest, 1961). Es ist bekannt, dass CO ₂ eine Auswirkung auf elektrische Kommunikation durch Abkoppeln Gap Junctions (Arellano et al, 1990) hat. Es wurde kürzlich gezeigt, dass die Nervenstrang und die Kommunikation innerhalb der sensorischen-CNS-motor-Muskel-Schaltung, wie in diesem Bericht beschrieben, ist auch empfindlich auf _2-Exposition CO, auf das Vorhandensein von Gap Junctions (Bierbower, 2010; Bierbower und Cooper, 2010)

Die spontane Aktivität der 3 ^rd motorische Wurzel hat ein Thema seit den 1960er Jahren, als Eckert (1961), wenn die Tonika Brennen statischen Muskel-Rezeptor-Orgel (MRO) in der gleichen oder benachbarten Segment für die spontane Antrieb Konto konnte untersucht. In diesen früheren Studien zeigte sich, dass die Aktivität im ventralen Nervenstrang (VNC) wurde möglicherweise von höheren Zentren (Eckert, 1961; Kennedy und Takeda, 1965a, b;. Strawn et al, 2000) angetrieben. Da die Anwesenheit von CO ₂ stoppte die spontane Aktivität, kann man irgendwo in der Antrieb auf die Motoneuronen nehme an, es könnte Gap Junctions oder glutamatergen exzitatorischen Laufwerk sein. Die NMJs blockiert oder weisen verminderte Sensitivität gegenüber der in Gegenwart von CO ₂ Glutamat, und sie können bloc werdensowie innerhalb des ZNS ked (Bierbower, 2010; Bierbower und Cooper, 2010; siehe auch Badre et al, 2005.).

Die Wirkung verschiedener Neuromodulatoren ist auch leicht an die verschiedenen Arten von NMJs (; Griffis et al, 2000;. Southard et al, 2000;.. Strawn et al, 2000 Cooper und Cooper, 2009) untersucht. Darüber hinaus sind verschiedene Einflüsse von Neuromodulatoren auf das ZNS Schaltung ausgeübt. Es wurde vorgeschlagen, dass die 5-HT und Oktopaminerge Neuronen kann als "Gewinn-Setter" in der Veränderung der Ausgang des neuronalen Schaltkreisen (Ma et al, 1992 Funktion;. Schneider et al, 1996;. Hörner et al, 1997;. Edwards et al., 2002). Es bleibt noch viel zu tun, bevor wir völlig verstehen kann, die Auswirkungen von Neuromodulatoren auf einzelne Zielzellen. Da die verschiedenen Neuromodulatoren können in Absprache mit den anderen zusammenzuarbeiten, ist die Analyse ihrer gemischten Aktion ein Bereich für die zukünftige Forschung (Djokaj et al., 2001). Darüber hinaus nur wenige Studien, vor allem in der Wirbeltiere, die Auswirkungen der Neuromodulatoren auf dem gesamten Wege, die ein bestimmtes Verhalten regulieren können. In diesem sinnlich-CNS-Motor-Einheit Vorbereitung kann man den Einfluss der beiden sensorischen Input und Neuromodulatoren auf die Aktivität der Motoneuronen (Kennedy et al., 1969).

Da es postuliert hat, dass 5-HT eine Rolle spielt bei der Regulierung des Verhaltens Zustand der Krebse, Hummer und Krabben (Livingstone et al, 1980;.. Sneddon et al, 2000) wurden mehrere Versuche unternommen, um seine Konzentration zu bestimmen, die VNC, der Hämolymphe und in isolierten Ganglien Hummer (Livingstone et al, 1980;. Harris-Warrick und Kravitz 1984;. Fadool et al, 1988). Allerdings gab es erhebliche Unterschiede in den aufgezeichneten Messungen ausschließen spezielle Dosis-Wirkungs-Beziehungen, die für Verhaltensstörungen Aktionen verantwortlich sein könnten.

Ein Flusskrebs mit den Klauen in einer erhöhten Position und mit dem Schwanz unter seinem Bauch versteckt gehalten wurde gedacht, um eine dominieren Haltung aufweisen (Livingstone et al., 1980). Der Zustand der Bauch-Flexion in Krebsen scheint nicht die Haltung, dass dominante Krebse, innerhalb eines Paares, während die sozialen Interaktionen aufweisen oder unter Beibehaltung eines dominierenden hierarchischen Status (Listerman et al., 2000). Devot Krebse wird auch tuck ihren Bauch unter sich, wie sie Rückzug von einem Gegner. Solche Schwanz stopfte wird auch als eine Abwehrhaltung (Listerman et al., 2000) gesehen. Diese Verhaltensweisen wurden leicht im Feld und im Labor Einstellungen beobachtet (Bovbjerg, 1953, 1956; Bruski und Dunham, 1987; Li et al, 2000;.. Listerman et al, 2000). Interessanterweise stellte die Verhaltens-Haltungen in Hummer (Livingstone et al., 1980) sind für die 5-HT und Octopamin Injektionen in die australische Flusskrebse, Cherax destructor (McRae, 1996) umgekehrt. Möglicherweise würden ganz unterschiedliche Reaktionen in der oberflächlichen Beuger Vorbereitung in der australischen Krebse beobachten. Darüber hinaus, da Dominanz ist in der Regel eine Größe zwischen Krebsen verwandt, würde man erwarten, eine sehr plastische Antwort-System für die schnelle veränderten gesellschaftlichen Bedingungen (Strawn et al., 2000). Die Plastizität in Reaktion auf Neuromodulatoren in wirbellosen Tieren ist ein offenes Forschungsgebiet.

Wyttenbach, Johnson und Hoy (1999) haben digitale Medien und ein Labor Anleitung für verschiedene Krebse Experimente mit den gleichen Muskel in diesem Bericht neben anderen Krebse Vorbereitungen vorgestellt produziert. Dies ist eine hervorragende Ressource für Schüler Übungen.

Materialien