Assaying של תנועה, למידה, וזיכרון גירעונות תסיסנית מודלים של ניוון מוחיים

Summary

מבחני התנהגות למדידת פונקציות של תנועה, למידה, ויכולות הזיכרון תסיסנית.

Abstract

התקדמות בשיטות גנטיות אפשרו חקר גנים המעורבים במחלות ניווניות אנושי באמצעות תסיסנית כמערכת מודל ^1. רוב מחלות אלו, כולל אלצהיימר, פרקינסון מחלת הנטינגטון מאופיינים הידרדרות גיל תלוי בפונקציות למידה וזיכרון וקואורדינציה תנועה ^2. כאן אנו משתמשים מבחני התנהגות, כולל assay geotaxis שלילית ³ ו assay דיכוי phototaxic מרתיעה (assay APS) ^4,5, כדי להראות כמה מן המאפיינים התנהגות הקשורים ניוון מוחיים האדם ניתן לחזור בדיוק זבובים. ב assay geotaxis שלילי, הנטייה הטבעית של זבובים לנוע כנגד כוח הכבידה כאשר נסער מנוצל ללימוד גנים או מצבים שעלולים לעכב יכולות של תנועה. ב assay APS, פונקציות למידה וזיכרון נבדקים phototactic-חיובי זבובים מאומן לקשר אור עם טעם מריר מרתיעה ומכאן הנטייה הטבעית להימנע אחרת לעבור אל האור. בדיקות אלה הכשרה זבובים 6 שעות שלאחר האימון משמש כדי להעריך את תפקודי הזיכרון. באמצעות מבחני אלה, תרומתו של כל גורמים גנטיים או סביבתיים לקראת ניוון מוחיים בפיתוח ניתן ללמוד בקלות זבובים.

Protocol

1. הקדמה

בסרטון הזה, אנו ממחיש שני מבחני התנהגות באמצעות תסיסנית כדי להדגים את המדידה של תנועה ועל למידה וזיכרון פונקציות כי הם בסכנה בהפרעות ניווניות. ראשית, אנו נראה כיצד התנהגות של תנועה ניתן למדוד באמצעות assay geotaxis שלילית. שנית, נוכל להעריך יכולות למידה וזיכרון באמצעות זבובים חיובי-phototactic כי מאומנים לקשר אור עם טעם מריר מרתיעה, ואז הם נבחנו 6 שעות מאוחר יותר כדי להעריך את תפקודי הזיכרון. לבסוף, נדון בהשלכות והמגבלות של אלה מבחני התנהגות.

2. ציוד ריאגנטים

1. טוס עבודה
   • היקף סטריאו (Zeiss)
   • מכחולים קטנים עבור דוחפים זבובים
   • תסיסנית פחמן דו חמצני (CO ₂₎ מנגנון הרדמה (Geneseesci, Inc)
2. Geotaxis שלילי Assay
   • 28.5 x 95 מ"מ Vial פוליסטירן (הקפיטול, Vial Inc)
   • ה-Mini-Alarm טיימר / שעון עצר (VWR הבינלאומי)
   • לנוכל עטים
   • דבק Tape
3. מרתיעה Phototaxis Assay דיכוי
   • כינין הידרוכלוריד (Sigma Aldrich, מספר CAS: 6119-47-7)
   • מים מזוקקים
   • סולם מדידה דיגיטלי עבור דילול מדויקת לפי משקל
   • נתק מחברים מהירים, פוליאתילן בצפיפות גבוהה (NALGENE VWR קטלוג מספר 62868-021)
   • 15 מ"ל צנטריפוגה Tube (VWR הבינלאומי), לחתוך את סימן 2 מ"ל מסוף סגור כדי להתאים עם מתאם נתק מהירים מחבר מקור אור
   • Single-ערוץ 200 pipetter μL לטעון פתרון כינין על נייר לסנן רירית קאמרית
   • T-Maze (מערכות התנהגותיים פשוטים; איור 1)
   • אלומיניום לסכל
   • מקור האור (Zeiss)
   • פנס עם אור אדום.
   • מסנן נייר
   • ה-Mini-Alarm טיימר / שעון עצר (VWR הבינלאומי)

3. הכנת זבובים

• זבובים נשמרות בינוני קמח תירס, אגר, מולסה, שמרים רגיל של 25 ° C על מחזור אור / חושך 12 שעות.
• זבובים הבתולה מבודדים בהרדמה פחמן דו חמצני ביום eclosion. עבור מחקרים הזדקנות, זבובים נשמרים בקבוצות של עשרים לכל בקבוקון והועברו בקבוקון חדש כל 3 ימים. חשוב להשתמש זבובים אח מן הצלב הורית אותו ללימודי הזדקנות, כדי למזער את ההבדלים הנובעים מרקע גנטי.
• עבור שני מבחני, זבובים הם מינית ומתוחזק בקבוצות של עשרה זבובים בכל בקבוקון. ההבדל המגדר על התנהגות היא משמעותית רצוי לא לערבב זבובים זכרים ונקבות במחקר כנתונים עלול להיות קשה לפרש ולהתרבות ^6.
• עבור assay geotaxis שלילי, זבובים ממוינים לקבוצות של עשרה לכל בקבוקון ונבדקו שעה אחרי הרדמה. חשוב זבובים להחלים לחלוטין מן ההרדמה כמו זו עשויה להיות השפעה על פעילות של תנועה.
• עבור assay APS, זבובים של כל קבוצה ממוקמים בקבוקון ריק קלקר עם מים לחלח נייר סינון במשך שש שעות לפני assay מבוצע. הדבר מבטיח כי הזבובים הם מורעבים לפני assay ויהיה תפיסה יותר לטעם מרתיעה. רגע לפני assay מבוצע, לטוס כל מקבוצה של עשר ממוקמת שפופרת ריק צנטריפוגה 15 מ"ל, אשר הכתיר אז באופן רופף, כדי למנוע בריחה.

4. Geotaxis שלילי Assay

• Geotaxis נמדד בדרך כלל 1-20 קבוצות של עשרה אנשים גנוטיפ של אותו טיפול או (100-200 זבובים סך כל גנוטיפ / טיפול) ^7. מיין קבוצות של עשרה זבובים זכר או נקבה על מנגנון הרדמה CO ₂ ומקום כל קבוצה בבקבוקון נפרד. אפשר לפחות שעה אחת של זבובים להתאושש מן ההרדמה.
• הכן את מנגנון טיפוס עבור כל קבוצה, כגון כי שני בקבוקונים קלקר ריקות מחוברות אנכית על ידי סרט זה מול זה. חשוב לוודא כי פתחי מבחנות מיושרים בצורה מושלמת אחד עם השני כדי לספק משטח אפילו לטפס על הזבובים.
• עבור בקבוקון התחתון, למדוד מרחק אנכי של 8 ס"מ מעל פני השטח לתחתית ולסמן כל בקבוקון ידי ציור עיגול סביב היקף שלם של הבקבוקון.
• העברת קבוצה של עשרה זבובים לתוך בקבוקון התחתון בזהירות למנוע בריחה של זבוב כלשהו. מיד לכסות את הבקבוקון נמוך עם בקבוקון את הקלטת בראש ומאובטח ליד פתחי קשר. אפשר הזבובים להתאקלם להגדרה חדשה עבור דקה 1 לפני ביצוע assay.
• לטפוח בעדינות הזבובים לתחתית של הבקבוקון ולמדוד את מספר הזבובים שיכולים לטפס מעל סימן 8 ס"מ על ידי 10 שניות אחרי הברז.
• חזור על פעולה זו assay עבור הקבוצה אותה עשר פעמים, ומאפשר למשך 1 דקה מנוחה בין כל ניסוי.
• רשום את מספר הזבובים לכל קבוצה שעברה את סימן 8 ס"מ כמואחוז מסך זבובים.

5. מרתיעה Phototaxis Assay דיכוי (Assay APS)

מותאם במקור מ Le Bourg ו Buecher (2002) ^4, assay זה מנצל את התנהגות phototactic חיובית זבובים להכשיר אותם לקשר אור עם גירויים מרתיעים (במקרה זה, הטעם המר של כינין). לאחר שלב אימון / מיזוג, זבובים סוג בר יוכלו לשייך את השטח המואר עם טעם מרתיעה ולמנוע אותה. זבובים עם יכולות למידה נפגעת ייכשל כדי להפוך את העמותה. יתר על כן, assay APS יכול לשמש גם כדי למדוד את תפקוד הזיכרון קצר הטווח של זבובים ⁵ ידי העמדת זבובים כבר מאומנים באותו מבחן 6 שעות מיזוג לפרסם לבחון את יכולתם לזכור את המשימה ללמוד.

1. הכנת פתרון כינין
   • ממיסים hydrochloride כינין במים מזוקקים כדי להפוך פתרון מניות 0.1M (1.98g במים מזוקקים 50 מ"ל). הפתרון המניות יכולים להישמר ב -20 ° C עד שנה ב aliquots קטן
   • הכן פתרון עבודה של 1 מיקרומטר על ידי דילול פתרון המניות מים מזוקקים.
2. הכנת T-Maze
   • T-מבוך מורכב בעמודה מרכז עם דלת מלכודת שני חדרי עצמאית, תא "כהה" וחדר "מואר" (איור 1).
   • הכנה הקאמרית: לוקחים שני צינורות פלסטיק, 15 מ"ל צנטריפוגות לחתוך ב סימן 2 מ"ל מלמטה סגורה בסוף עם מדריך ראה. התאימו את מתאמי מחבר בכל קצה, ואת החותם את הקשר עם parafilm. מתאם בסוף הצינור משמש חריץ הזנה עבור מקור האור מתכווננת. חבר את צינורית עם מקור אור צינור זה יהיה קאמרית "מואר". לעטוף את צינור אחרים ברדיד אלומיניום לשמש הקאמרית "כהה".
   • הוסף 180uL מים מזוקקים או או פתרון כינין לסנן נייר מקום בתא אור.
   • להרכיב את T-מבוך על ידי הברגה לתאי מואר וחשוך בכל צד של הטור במרכז, עם דלת המלכודת נסגרה באמצע (איור 1).
   • הכנס את מקור האור אל תוך החדר מואר.
3. הדרכה זבובים לדכא phototaxis עם גירויים מרתיעים
   • הברג החוצה את החדר חשוך מן המבוך-T והעברת זבוב בודד לתוך תא זה ומיד לדפוק את צינור כהה חזרה במבוך.
   • כבו את האורות בחדר, להדליק את המנורה האדומה.
   • אפשר לטוס להתאקלם בחדר חשוך במשך 30 שניות לאט להפעיל את מקור האור המאיר את החדר מואר. לאט לאט לפתוח את הדלת מלכודת המפריד בין שני החדרים.
   • אם הזבוב נכנס לחדר מואר תוך 10 שניות, זה נחשב phototactic חיובי הוא מוכן להיות מאומנים assay. כישלון phototaxis מצביע על בעיות במערכת הראייה וזבובים עם phototaxis שלילי צריך להיות מחוץ assay.
   • לאימונים מרתיעה Phototaxis דיכוי (APS), הקש על לטוס שהוכיח phototaxis חיובית בחזרה אל החדר החשוך, לסגור את הדלת מלכודת לכבות את האור. אפשר 30 שניות של מסתגל. במהלך תקופה זו את נייר הסינון עם פתרון כינין לחדר המואר. לאט לאט לפתוח את הדלת מלכודת להדליק את האור. אפשר ללכת לטוס לתוך תא כינין מצופים מוארים. לאחר דקה אחת, הקש על לטוס חזרה לחדר חשוך לחזור על 9 פעמים יותר. (בדרך כלל, סוג בר זבובים למנוע את החדר מואר אחרי 3-5 אימונים ניסויים).
   • מיד לאחר האימון, חמישה ניסויים הבדיקה תתבצע. במשפט אחד מבחן, לאפשר 10 שניות אחרי האור מופעלת עבור לטוס מאומן ללכת לחדר מואר. אי הליכה בקבוקון המוארת תירשם בשם "Pass", שהוא שווה ערך "משימה למדו באמצעות חיזוקים". שיעור Pass מעל חמישה מחקרים עוקבים הוא הקליט להלן באיור 2 כמו PC0 (0 מיזוג hr הודעה).
4. הערכת לטווח קצר פונקציית זיכרון זבובים
   • לאחר הכשרה ראשונית PC0 הקלטות, לטוס כל מושם חזרה לתוך הבקבוקון מזון המקורי שמר בצד במשך שש שעות.
   • שש שעות אימון לפרסם, כל נושא לטוס 5 ניסויים שוב באותה צורה כמו קודם, ולהקליט את מספר הפעמים לטוס נמנע (עובר) או נכנס (להיכשל) את הבקבוקון מואר. שיעור זה לעבור נרשם PC6 (6 שעות מיזוג פוסט), המהווה אינדיקטור של זיכרון לטווח קצר.

6. נתונים פרשנות וניתוח סטטיסטי

1. Geotaxis שלילי Assay
   • הנתונים הגולמיים שנוצר assay זה מייצג את מספר הזבובים חציית סימן 8 ס"מ 10 שניות בכל קבוצה. המר הזה אחוז לחשב את שיעור לעבור הממוצע עבור כל קבוצה מעל 10 מפגשים.
   • נתונים מיוצגת בצורה גרפית כמו בשיעור ממוצע לעבור קבוצה (גנוטיפ, טיפול וכו ') עם שגיאת תקן של ממוצע (SEM).
   • הבדלים בין קבוצותאז יכול להיות נחוש בדעתו להיות משמעותיים מבחינה סטטיסטית או לא באמצעות סטודנטים T-ANOVA או מבחן.
2. מרתיעה Phototaxis Assay דיכוי
   • הנתונים הגולמיים של assay זה מיוצג כמספר הפעמים לטוס כל ימנע את החדר מואר בחמישה משפטים רצופים. שיעור לעבור מחושב כאחוז ניסויים הימנעות מוצלחת על ניסויים מוחלט. לחשב את שיעור ממוצע לעבור באופן זה למשך תקופה מינימלית של 15 זבובים לכל קבוצה.
   • נתונים מיוצגת בצורה גרפית כמו קצב להעביר הממוצע PC0 (מיד לאחר מיזוג, "למידה" אינדיקטור) או לעבור שיעור ממוצע PC6 (6 שעות מיזוג הודעה: אינדיקטור "זיכרון") עם SEM בהתאמה.
   • מדדי למידה וזיכרון בהשוואה בין הקבוצות הם עם סוג שני בר "מניפולציה גנטית, שפיר" הקבוצה (כגון ה-GFP overexpressing זבובים) כראוי.

7. נציג תוצאות

בניסוי זה וידאו, אנחנו הערכת למידה וזיכרון מנוע חסרים זבובים overexpressing האדם טאו במערכת העצבים המרכזית השוואת הביצועים שלהם לאלה של זבובים overexpressing GFP. Overexpression העצבית של טאו האדם תסיסנית הוכח לגרום vacuolization חמור במוח ⁸ ולהוביל גירעונות משמעותיים בלמידה פונקציות הזיכרון ^9. כפי שניתן לראות בתרשים 2A, גבר בן 10 יום או נקבה זבובים overexpressing האדם טאו יש גירעונות של תנועה משמעותית לעומת גיל בהתאמה GFP overexpressing זבובים. בנוסף, זבובים אלה לא הצליחו לקשר אור עם טעם מר כפי שמוצג בשיעור PC0 לעבור בהשוואה לקבוצת הביקורת, כמו גם מצליחים לזכור העמותה כפי שמוצג על ידי ירידה בשיעור PC6 לעבור (תרשים 2B). ניסוי זה עוד יותר מאמת כי מודלים תסיסנית יכול לשמש ללימוד תנאים ניווניות האדם משחזרת כמה פנוטיפים התנהגותיים שנצפו אצל בני אדם ויונקים.

באיור 1. T-Maze ההתקנה Assay דיכוי Phototaxis מרתיעה א. ההתקנה ניסיוני הכולל הניסוי APSA עם מקור האור מחובר צינור "מואר" בז, מרופדת בנייר לסנן את הצינור "כהה" בצד שמאל (מכוסה בנייר כסף), מופרדים על ידי דלת מלכודת. ב בשלב הדרכה ובחינות, לטוס הוא בחדר חשוך והדלת נפתחה לאחר מלכודת האור דולק בחדר מואר.

איור 2. תוצאות נציגת geotaxis השלילי ולהתנסות APS באמצעות זבובים overexpressing GFP או טאו עם הנהג הפאן נוירונים א. ב assay geotaxis שלילי, 10 יום בן זכר (עמודות כחולות) או נקבה (עמודה אדומה) זבובים overexpressing GFP הראו פעילות מטפסים גבוה יותר מאשר טאו-overexpressing זבובים. ב 20 יום הנקבה הישן זבובים overexpressing GFP הראה למידה טובה יותר (PC0) וזיכרון (PC6) פונקציות מאשר טאו overexpressing זבובים.

Discussion

שני geotaxis שלילי מבחני APS הם מבחני התנהגות חזקים כדי למדוד שינויים של תנועה או למידה יכולות זיכרון הנובע מניפולציה גנטית או סביבתית. עם זאת, ישנם כמה חסרונות אלה מבחני כי מחכים אופטימיזציה נוספת.

ב assay geotaxis שליליות, מוטציות בגנים מסוימים יכול להפוך בתפקוד המוטורי הקשה זבובים. במקרים כאלה, הזבובים בקושי יכול לטפס על קירות בתגובה הכבידה על תסיסה. מבחני התנהגות אחרים למדוד ישירות תנועה עשויים להיות מתאימים יותר. מבחני אלו כוללים התנהגות רפלקס ליישר המודד שיתוק ותפיסה ^10, והתנהגות optomotor ¹¹ שרושמת הפסד של תיאום התנועה.

ב assay APS, הפרעה הראשון ניתן זבובים אקראי לעצור בכניסה של החדר מואר בלי לזוז קדימה. זה הופך יותר בעיה אם הזדקנות היא אחד התנאים למד, מאז זבובים ישנים הם פחות פעילים בכלל נוטים לעצור ולנוח במשך תקופות זמן ארוכות. במקרה זה הניסוי יש לספק גירויים מכניים כדי לקדם את התנועה, אשר לא תמיד יעילה. שנית, אפשר לטעון כי הכישלון להגיע לתוצאות חדר מואר מהפסד של phototaxis חיובית. זהו מקרה נדיר, שכן מחקרים קודמים הראו כי זבובים ולשוב היענות אור פעם השלילי לחזק מוסר ^4. שלישית, את משך המגע עם הגירוי מרתיעה עשוי להשתנות ממשפט למשפט. וריאציה זו יכולה בדרך כלל להיות מופחת על ידי המקיפה את הקיר הפנימי של החדר בנייר מסנן הספוג למנוע זבובים הימנעות כינין. בנוסף, הניסוי יכול להבטיח כי כל זבוב מבלים מספיק זמן במגע עם נייר הסינון על ידי הגדלת כמות הזמן שבילה בחדר מהרגע 1 צוין אחרת.

לסיכום, geotaxis שלילי APS מבחני דרכים מהירה ופשוטה של הערכת הגירעונות התנהגותיות כמותית מצביעים של תנועה ולמידה ויכולות הזיכרון תסיסנית. מבחני אלה שימושיים במיוחד דוגמנות תנאים ניווניות האדם תסיסנית.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
חומרים	חברה	מספר קטלוגי	הערה
פוליסטירן Vial	Vial הקפיטול, Inc	28Fly	28.5 x 95 מ"מ פוליסטירן Vial: איכות חומר חשוב, רע אם חלקלק מדי זבובים לטפס.
הביתור Stereoscope	Zeiss	000000-1432-979	2 סניפים אווז הצוואר אור מדריך (12V/30W)
כינין הידרוכלוריד	סיגמא אולדריץ	6119-47-7	ממיסים במים מזוקקים.
נתק מחברים מהירים	Nalgene (VWR)	62868-021	פוליאתילן בצפיפות גבוהה
T-Maze	מערכות ההתנהגות Simple
Single-ערוץ 200 μL פיפטה	Eppendorf	022443305