Assaying Bewegungsapparat, Lernen und Gedächtnis Defizite in Drosophila Modelle von Neurodegeneration

Zusammenfassung

Behavior-Assays zur Messung der lokomotorischen Funktionen, Lern-und Gedächtnisleistung in Drosophila.

Zusammenfassung

Advances in genetischen Methoden haben die Untersuchung von Genen in menschlichen neurodegenerativen Erkrankungen mit Drosophila als Modellsystem ¹ beteiligt aktiviert. Die meisten dieser Erkrankungen, darunter Alzheimer, Parkinson und Huntington-Krankheit werden durch altersabhängige Verschlechterung Lernen und Gedächtnis-Funktionen und Bewegungskoordination ² gekennzeichnet. Hier verwenden wir Verhaltens-Assays, einschließlich der negativen Geotaxis Test ³ und die aversive phototaxic Unterdrückung Assay (APS-Assay) ^4,5, um zu zeigen, dass einige der Verhaltensmerkmale mit menschlichen Neurodegeneration verbunden in Fliegen können rekapituliert werden. In der negativen Geotaxis Assay, fliegt die natürliche Tendenz der gegen die Schwerkraft zu bewegen, wenn bewegt wird genutzt, um Gene oder Bedingungen, die Bewegungs-Fähigkeiten verhindern kann studieren. In der APS-Assay werden die Lern-und Gedächtnisfunktionen in positiv-phototaktischen getestet Fliegen trainiert, Licht mit aversive bitteren Geschmack verbinden und somit vermeiden diese sonst natürliche Tendenz, in Richtung Licht zu rücken. Der Test dieser Ausbildung fliegt 6 Stunden nach dem Training verwendet wird, um Speicher-Funktionen zu beurteilen. Mit diesen Tests kann der Beitrag eines genetischer oder umweltbedingter Faktoren auf die Entwicklung Neurodegeneration leicht in Fliegen untersucht werden.

Protokoll

1. Einführung

In diesem Video werden wir zeigen zwei Verhaltens-Assays mit Drosophila, um die Messung der Fortbewegung und Lernen und Gedächtnis-Funktionen, die bei neurodegenerativen Erkrankungen gefährdet sind nachzuweisen. Zunächst werden wir zeigen, wie Bewegungsapparates Verhalten gemessen werden kann mit dem negativen Geotaxis Assay werden. Zweitens werden wir beurteilen, Lern-und Gedächtnisleistung mit positiv-phototaktischen Fliegen, die geschult, um Licht mit einem aversiven bitteren Geschmack assoziieren und dann 6 Stunden später, um Speicher-Funktionen beurteilen getestet. Schließlich diskutieren wir die Auswirkungen und Grenzen dieser Verhalten Assays.

2. Geräte und Reagenzien

1. Fly Arbeit
   • Stereo-umfang (Zeiss)
   • Kleine Pinsel zum Schieben Fliegen
   • Drosophila Kohlendioxid (CO ₂₎ Narkosegerät (Geneseesci, Inc)
2. Negative Geotaxis Assay
   • 28,5 x 95 mm Polystyrol Vial (Capitol Vial, Inc.)
   • Mini-Alarm Timer / Stoppuhr (VWR International)
   • Sharpie Stifte
   • Klebeband
3. Aversive Phototaxis Suppression Assay
   • Chininhydrochlorid (Sigma Aldrich, CAS-Nummer: 6119-47-7)
   • Destilliertes Wasser
   • Digitale Mess-Skala für präzise Verdünnung Gew.
   • Quick Disconnect Stecker, High-Density Polyethylen (NALGENE VWR Katalog Nr. 62868-021)
   • 15 ml Zentrifugenröhrchen (VWR International), an der 2 mL-Marke aus geschlossenen Ende geschnitten, um mit der Quick Disconnect Stecker-Adapter für Lichtquelle fit
   • Single-Channel-200 ul Pipette auf Chinin-Lösung auf Filterpapier Auskleidung der Kammer Last
   • T-Maze (Simple Behavioral Systems; Abbildung 1)
   • Aluminiumfolie
   • Light Source (Zeiss)
   • Eine Lampe mit rotem Licht.
   • Filterpapier
   • Mini-Alarm Timer / Stoppuhr (VWR International)

3. Vorbereitung der Fliegen

• Fliegen sind auf Standard-Maismehl-Agar-Melasse-Hefe-Medium bei 25 ° C auf einem 12 h Licht / Dunkel-Zyklus.
• Virgin Fliegen sind unter Kohlendioxid Anästhesie am Tag der eclosion isoliert. Für Aging-Studien sind Fliegen in Gruppen von jeweils zwanzig pro Fläschchen gepflegt und in ein frisches Gefäß alle 3 Tage. Es ist wichtig, Geschwister fliegt aus der gleichen elterlichen Kreuz für ältere Studien zu verwenden, um Differenzen aus genetischen Hintergründen zu minimieren.
• Für beide Assays sind Fliegen sexed und in Gruppen von zehn Fliegen pro Flasche gehalten. Der Unterschied zwischen den Geschlechtern auf das Verhalten ist bezeichnend und es ist ratsam, nicht zu männlichen und weiblichen Fliegen in einer Studie Mix Daten könnte schwierig sein, zu interpretieren und zu reproduzieren ^6.
• Für negative Geotaxis Assay, sind Fliegen in Gruppen von zehn pro Fläschchen sortiert und geprüft 1 Stunde nach der Narkose. Es ist wichtig für Fliegen vollständig zu erholen, um aus der Narkose, da dies einen Einfluss auf Bewegungsapparates Aktivitäten haben könnten.
• Für APS-Assay werden fliegt jeder Gruppe in eine leere Flasche aus Polystyrol mit Wasser gelegt angefeuchtetem Filterpapier für 6 Stunden vor dem Test durchgeführt wird. Dies gewährleistet, dass die Fliegen vor dem Test sind verhungert und wird aufmerksamer auf aversive Geschmack. Kurz bevor der Test durchgeführt wird, wird jede Fliege aus einer Gruppe von zehn in eine leere 15ml-Zentrifugenröhrchen, die dann verschlossen wird locker, die Flucht zu verhindern platziert.

4. Negative Geotaxis Assay

• Geotaxis ist in der Regel für 10 bis 20 Gruppen von zehn Individuen der gleichen Genotyp oder Behandlung (100-200 fliegt insgesamt für jeden Genotyp / Behandlung) ⁷ gemessen. Sortieren Gruppen von zehn weiblichen oder männlichen Fliegen auf einen CO _{2-Narkosegerät} und Ort jeder Gruppe in einem separaten Gefäß. Warten Sie mindestens eine Stunde für die Fliegen aus der Narkose zu erholen.
• Bereiten Sie das Klettern Gerät für jede Gruppe, so dass zwei leere Polystyrol Röhrchen vertikal durch Tonband nach miteinander verbunden. Es ist wichtig, um sicherzustellen, dass die Öffnungen der Gefäße sind perfekt aufeinander abgestimmt, um eine gleichmäßige Kletterfläche für das Fliegen bieten.
• Für die untere Flasche, messen einem vertikalen Abstand von 8 cm über der Bodenoberfläche und markieren jedes Fläschchen durch Zeichnen eines Kreises um den gesamten Umfang des Fläschchens.
• Übertragen einer Gruppe von zehn fliegt in die untere Flasche sorgfältig verhindert das Entweichen von jeder fliegen. Unmittelbar decken den unteren Fläschchen mit der Spitze Fläschchen und Band sicher in der Nähe der Kontaktaufnahme mit Öffnungen. Lassen Sie die Fliegen um die neue Einstellung für 1 Minute vor Durchführung des Tests zu akklimatisieren.
• Klopfen Sie leicht die Fliegen auf den Boden des Fläschchens und messen Sie die Anzahl der Fliegen, die über den 8-cm-Marke um 10 Sekunden steigen, nachdem das Leitungswasser kann.
• Wiederholen Sie diesen Test für die gleiche Gruppe zehnmal, so dass für 1 Minute Pause zwischen den einzelnen Studien.
• Notieren Sie die Anzahl der Fliegen pro Gruppe, dass die 8-cm-Markierung als bestandenProzentsatz der gesamten Fliegen.

5. Aversive Phototaxis Suppression Assay (APS Assay)

Ursprünglich aus Le Bourg und Buecher (2002) ⁴ angepasst, nutzt dieses Tests die positive phototaktischen Verhalten bei Fliegen zu schulen, um Licht mit aversive Reize (in diesem Fall, bitteren Geschmack von Chinin) zu verknüpfen. Nach einer Ausbildung / Klimaanlage Phase wird Wildtyp-Fliegen in der Lage sein den beleuchteten Bereich mit aversiven Geschmack assoziieren und vermeiden Sie es. Fliegen mit eingeschränkter Lernfähigkeit wird fehlschlagen, um diese Zuordnung zu machen. Darüber hinaus die APS-Test kann auch verwendet werden, um das Kurzzeitgedächtnis Funktion messen fliegt ^5, indem bereits ausgebildete fliegt der gleiche Test 6 Stunden nach der Konditionierung auf ihre Fähigkeit, in Erinnerung an die Aufgabe gelernt zu testen.

1. Vorbereiten des Chinin-Lösung
   • Lösen Sie Chininhydrochlorid in destilliertem Wasser zu einer 0,1 M Stammlösung (1.98g in 50 mL destilliertem Wasser) zu machen. Die Stammlösung kann bei -20 ° C aufbewahrt werden bis zu einem Jahr in kleinen Portionen
   • Bereiten Sie eine funktionierende Lösung von 1 uM durch Verdünnen der Stammlösung mit destilliertem Wasser.
2. Vorbereiten des T-Maze
   • T-Labyrinth besteht aus der mittleren Spalte mit der Falltür und zwei getrennten Kammern, eine "dunkle" Kammer und eine "brennende" Kammer (Abbildung 1).
   • Chamber Zubereitung: Nehmen Sie zwei 15ml Kunststoff-Zentrifugenröhrchen und schneiden bei 2 mL-Marke von unten geschlossenen Ende mit einer Handsäge. Setzen Sie den Stecker-Adapter an jedem Ende, und versiegeln Sie die Verbindung mit Parafilm. Der Adapter am Ende der Röhre dient als Eingang Slot für den Schwanenhals Lichtquelle. Verbinden Sie einen Schlauch mit der Lichtquelle und dieses Rohr wird das "brennende" Kammer werden. Wickeln Sie das andere Rohr mit Alu-Folie, die als "dunkel" Kammer dienen.
   • Add 180uL entweder destilliertes Wasser oder Chinin-Lösung, um Papier und in das Licht Kammerfilterpresse.
   • Montieren Sie die T-Labyrinth durch Aufschrauben der beleuchteten und dunklen Kammern auf jeder Seite der mittleren Spalte mit der Falltür in der Mitte geschlossen (Abbildung 1).
   • Legen Sie die Lichtquelle in der beleuchteten Kammer.
3. Ausbildung fliegt Phototaxis mit aversive Reize zu unterdrücken
   • Lösen Sie die dunkle Kammer von der T-Labyrinth und übertragen eine einzige Fliege in diese Kammer und sofort Schraube der dunklen Röhre zurück, um das Labyrinth.
   • Schalten Sie das Licht in den Raum und schalten Sie die rote Lampe.
   • Lassen Sie die fliegen in die dunkle Kammer für 30 Sekunden zu gewöhnen und langsam auf die Lichtquelle beleuchtet die beleuchtete Kammer wenden. Langsam öffne die Falltür, dass die beiden Kammern trennt.
   • Wenn die Fliege geht zur beleuchteten Kammer innerhalb von 10 Sekunden, wird es als positiv phototaktisch und ist bereit, für den Test geschult werden. Failure in Phototaxis zeigt Probleme in das visuelle System und fliegt mit negativen Phototaxis aus dem Test ausgeschlossen werden müssen.
   • Für Aversive Phototaxis Suppression (APS) Ausbildung, tippen Sie auf die Fliege, die positive Phototaxis zeigte wieder auf die dunkle Kammer, in der Nähe der Klappe und das Licht auszuschalten. Lassen Sie 30 Sekunden akklimatisieren. Während dieser Zeit legte Filterpapier mit Chinin-Lösung in den beleuchteten Kammer. Langsam öffne die Falltür und schalten das Licht an. Lassen Sie die Fliege zu Fuß in die Chinin beschichtet beleuchteten Kammer. Nach einer Minute, tippen Sie auf die Fliege zurück in die dunkle Kammer und wiederholen Sie diesen 9 weitere Male. (In der Regel fliegt Wildtyp vermeiden beleuchteten Kammer nach 3 bis 5 Trainings-Studien.)
   • Unmittelbar nach dem Training werden fünf Testreihen durchgeführt werden. In jedem Test-Studie erlauben 10 Sekunden nach dem Licht ist für die Ausbildung zu fliegen, um den beleuchteten Kammer Spaziergang gemacht. Ein Verstoß gegen die brennende Flasche gehen wird als "Pass", der gleichbedeutend mit "Aufgabe durch Verstärkung gelernt" aufgezeichnet werden. Die Pass-Rate über fünf aufeinanderfolgende Versuche aufgezeichnet und unten in Abbildung 2 als PC0 (0 Stunden nach Konditionierung) gezeigt.
4. Die Beurteilung Short-Term Memory-Funktion in Flies
   • Nach seiner Ausbildung und ersten PC0 Aufnahmen ist jede Fliege wieder in seine ursprüngliche Nahrung Flasche gelegt und beiseite stellen für sechs Stunden.
   • Sechs Stunden nach dem Training unterziehen alle fliegen nach 5 Versuchen wieder in der gleichen Weise wie zuvor, und notieren Sie die Anzahl der Male-the-fly vermeidet (pass) oder geht in (fail) die beleuchtete Durchstechflasche. Diese Erfolgsquote ist als PC6 (6 Stunden post Konditionierung), die ein Indikator für das Kurzzeitgedächtnis wird aufgezeichnet.

6. Interpretation der Daten und statistische Analyse

1. Negative Geotaxis Assay
   • Die Rohdaten aus diesem Test erzeugt repräsentiert die Anzahl der Fliegen über den 8-cm-Marke in 10 Sekunden in jeder Gruppe. Wandeln Sie diese in Prozent und berechnet die durchschnittliche Erfolgsquote für jede Gruppe über 10 Sitzungen.
   • Die Daten werden grafisch als eine durchschnittliche Erfolgsquote pro Gruppe (Genotyp, Behandlung etc.) mit dem Standardfehler des Mittelwertes (SEM) dargestellt.
   • Unterschiede zwischen den Gruppenkann dann bestimmt werden statistisch signifikant ist oder nicht mit einem Student T-Test oder ANOVA werden.
2. Aversive Phototaxis Suppression Assay
   • Die Rohdaten aus diesem Test ist als die Anzahl der jeweils zu fliegen vermeidet die beleuchteten Kammer, in fünf aufeinander folgenden Studien vertreten. Die Erfolgsquote ist als der Prozentsatz der erfolgreichen Vermeidung Studien über die gesamte Studien berechnet. Berechnen Sie die durchschnittliche Erfolgsquote auf diese Weise für ein Minimum von 15 Fliegen pro Gruppe.
   • Oder durchschnittliche Erfolgsquote PC6 (6 Stunden nach der Konditionierung, "Speicher"-Anzeige) mit den jeweiligen SEM; Daten werden grafisch als durchschnittliche Erfolgsquote PC0 ("learning"-Anzeige unmittelbar nach der Konditionierung) vertreten.
   • Lernen und Gedächtnis-Indizes sind zwischen den Gruppen mit beiden Wildtyp und "genmanipulierte-gutartig"-Gruppe (z. B. GFP überexprimierenden Fliegen) entsprechend verglichen.

7. Repräsentative Ergebnisse

In diesem Video-Experiment werden wir die Beurteilung Lernen und Gedächtnis und motorische Defizite in Fliegen überexprimierenden menschlichen Tau in das zentrale Nervensystem und den Vergleich ihrer Leistung mit denen von Fliegen überexprimierenden GFP. Neuronale Überexpression des menschlichen Tau in Drosophila wurde gezeigt, dass schwere Vakuolisierung im Gehirn ⁸ verursachen und zu erheblichen Defiziten in Lern-und Gedächtnisfunktionen ^9. Wie in Abbildung 2A gezeigt, fliegt 10 Tage alten männlichen oder weiblichen überexprimierenden menschlichen Tau haben erhebliche Defizite im Vergleich zu Bewegungsapparates gleichaltrigen GFP überexprimierenden Fliegen. Darüber hinaus sind diese Fliegen, um Licht mit bitterem Geschmack assoziieren wie PC0 Erfolgsquote im Vergleich zur Kontrollgruppe gezeigt gescheitert, ebenso wie nicht zu dieser Vereinigung erinnern, als durch einen Rückgang in PC6 Erfolgsquote (Abbildung 2B) dargestellt. Dieses Experiment ist eine weitere Bestätigung, dass Drosophila-Modelle für das Studium der menschlichen neurodegenerativen Erkrankungen und rekapituliert einige der Verhaltens-Phänotypen bei Menschen und Säugetieren beobachtet verwendet werden kann.

Abbildung 1. T-Maze-Setup für Aversive Phototaxis Suppression Assay. A. Der gesamte Versuchsaufbau für die APSA Experiment mit der Lichtquelle verbunden, die "brennende" Falcon-Röhrchen, mit Filterpapier und die "dunkle" tube auf der linken Seite (die in Folie) ausgekleidet, durch eine Falltür getrennt. B. Während des Trainings-und Testphase, ist die Fliege in die dunkle Kammer und die Falltür geöffnet, nachdem das Licht auf in der beleuchteten Kammer eingeschaltet.

Abbildung 2. Repräsentative Ergebnisse aus dem negativen Geotaxis und APS Experiment mit Fliegen überexprimierenden GFP oder Tau mit einem pan-neuronalen Fahrer. A. In der negativen Geotaxis Assay, 10-Tage alten männlichen (blaue Säule) oder weiblich (rote Säule) fliegt überexprimierenden GFP zeigten höhere Klettern Aktivität als Tau-überexprimierenden Fliegen. B. 20-Tage alte weibliche Fliegen überexprimierenden GFP zeigten besseres Lernen (PC0) und Speicher (PC6) Funktionen als Tau überexprimierenden Fliegen.

Diskussion

Beide negativen Geotaxis und APS-Assays sind robust Verhaltens-Assays auf Veränderungen in der Bewegungsorgane oder Lern-und Speicherkapazitäten aus genetischer oder umweltbedingter Manipulation zu messen. Es gibt jedoch einige Nachteile auf diese Tests, die eine weitere Optimierung zu erwarten.

In negativen Geotaxis Assay können Mutationen in bestimmten Genen schweren motorischen Dysfunktionen bei Fliegen zu machen. In solchen Fällen können die Fliegen kaum klettern die Wände in Reaktion auf die Schwerkraft auf Agitation. Andere Verhaltens-Assays, welche direkt zu messen Bewegung besser geeignet sein können. Diese Tests umfassen Gleichgewichtsreflexes Verhalten, Lähmungen und Beschlagnahme ¹⁰ und optomotorischen Verhalten ^11, Verlust der Bewegungskoordination Aufzeichnungen Maßnahmen.

In APS-Assay kann das erste Hindernis fliegt zufällig stoppen am Eingang der beleuchteten Kammer ohne sich zu bewegen nach vorn. Das wird eher ein Problem, wenn Altern ist eine der Bedingungen untersucht, da ältere fliegt weniger aktiv im allgemeinen und neigen dazu, zu stoppen und für längere Zeit ruhen. In diesem Fall wird der Experimentator hat auf mechanische Reize bieten, um eine Bewegung, die nicht immer effektiv zu fördern. Zweitens könnte man argumentieren, dass die Nichteinhaltung der beleuchteten Kammer ergibt sich aus einem Verlust von positiven Phototaxis gehen. Dies ist selten der Fall, da bisherige Arbeit hat gezeigt, dass Fliegen wieder einzuschalten, um Licht reagieren, wenn die negative Verstärkung ⁴ entfernt ist. Drittens kann die Dauer des Kontakts mit dem aversiven Reiz von Versuch zu Versuch variieren. Diese Variante kann in der Regel durch Einkreisen der Innenwand der Kammer mit getränkten Filterpapier, um Fliegen aus der Vermeidung von Chinin zu verhindern reduziert werden. Darüber hinaus kann der Experimentator sicherzustellen, dass jeder Flug genügend Zeit in Kontakt mit dem Filterpapier zu verbringen, indem die Menge an Zeit in der Kammer aus dem nichts anderes angegeben ist 1 Minute verbrachte.

Zusammenfassend sind negativ Geotaxis und APS-Assays eine schnelle und einfache Methode zur Bewertung der Verhaltensdefiziten und quantitativ deuten Bewegungs-und Lern-und Gedächtnisleistung in Drosophila. Diese Assays sind besonders nützlich bei der Modellierung menschlichen neurodegenerativen Erkrankungen in Drosophila.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materialien	Firma	Catalog Number	Kommentar
Polystyrol Vial	Capitol Vial, Inc.	28Fly	28,5 x 95 mm Polystyrol Vial; Materialqualität wichtig, schlimm, wenn zu rutschig für Fliegen zu klettern.
Dissecting Stereoskop	Zeiss	000000-1432-979	2 Filialen Schwanenhals-Lichtleiter (12V/30W)
Chininhydrochlorid	Sigma Aldrich	6119-47-7	Man löst in destilliertem Wasser.
Quick Disconnect Stecker	Nalgene (VWR)	62868-021	High-Density Polyethylen
T-Maze	Einfache Behavioral-Systeme
Single-Channel-200 ul Pipette	Eppendorf	022443305