Deficit Locomotore dosaggio, apprendimento e memoria in Drosophila Modelli di neurodegenerazione

Riepilogo

Test per misurare il comportamento delle funzioni locomotore, apprendimento, memoria e abilità in Drosophila.

Abstract

I progressi nei metodi di genetica hanno permesso lo studio dei geni coinvolti in malattie neurodegenerative umane utilizzando Drosophila come sistema modello ^1. La maggior parte di queste malattie, tra cui l'Alzheimer, il Parkinson e la malattia di Huntington sono caratterizzati da età-dipendente deterioramento delle funzioni di apprendimento e memoria e coordinazione motoria ^2. Qui usiamo test comportamentali, tra cui il test negativo geotassi ³ e il test di soppressione phototaxic avversivo (APS test) ^4,5, per mostrare che alcune delle caratteristiche di comportamento associato neurodegenerazione umana può essere riassunta nelle mosche. Nel test geotassi negativo, la tendenza naturale di mosche a muoversi contro la gravità, quando agitato è utilizzata per studiare i geni o le condizioni che possono ostacolare la capacità locomotoria. Nel saggio APS, le funzioni di apprendimento e la memoria sono testati in modo positivo-phototactic vola addestrati per associare la luce con gusto amaro avverso e, quindi, evitare questa tendenza altrimenti naturale a muoversi verso la luce. Test questi addestrati vola 6 ore dopo la formazione è utilizzata per valutare le funzioni di memoria. L'utilizzo di questi saggi, il contributo di fattori genetici o ambientali verso lo sviluppo di neurodegenerazione può essere facilmente studiato in mosche.

Protocollo

1. Introduzione

In questo video, ci mostrerà due saggi comportamentali utilizzando Drosophila per dimostrare la misura di locomozione e le funzioni di apprendimento e memoria che sono compromesse nei disordini neurodegenerative. In primo luogo, mostreremo come il comportamento motorio può essere misurata con il test negativo geotassi. In secondo luogo, si valuterà la capacità di apprendimento e la memoria vola utilizzando positivamente phototactic che sono addestrati ad associare la luce con un gusto amaro avversivo e poi testato 6 ore dopo per valutare le funzioni di memoria. Infine, si discutono le implicazioni ei limiti di questi test comportamento.

2. Attrezzature e reagenti

1. Vola lavoro
   • Ambito stereo (Zeiss)
   • Pennelli piccoli per spingere le mosche
   • Drosophila anidride carbonica (CO ₂₎ dell'apparecchio di anestesia (Geneseesci, Inc)
2. Geotassi test negativo
   • 28,5 x 95 polistirolo Vial mm (Capitol Vial, Inc.)
   • Mini-allarme timer / cronometro (VWR International)
   • Penne Sharpie
   • Nastro adesivo
3. Avversiva fototassi Soppressione Assay
   • Chinino cloridrato (Sigma Aldrich, numero CAS: 6119-47-7)
   • Acqua distillata
   • Digital scala di misurazione per la diluizione precisa in peso
   • Connettori rapidi Disconnetti, polietilene ad alta densità (Nalgene VWR Catalog No. 62868-021)
   • 15 Centrifuga Tubo mL (VWR International), tagliata in segno di 2 ml da fine chiuso per adattarsi con la Quick Disconnect adattatore connettore per fonte di luce
   • Singolo canale 200 pipetter microlitri per caricare soluzione di chinino su carta da filtro rivestimento della camera
   • T-Maze (Simple sistemi comportamentali; Figura 1)
   • Foglio di alluminio
   • Sorgente luminosa (Zeiss)
   • Una lampada con luce rossa.
   • Filtro di carta
   • Mini-allarme timer / cronometro (VWR International)

3. Preparazione delle mosche

• Le mosche sono mantenuti su standard di farina di mais-agar-melassa, lievito di media a 25 ° C 12 ore su un ciclo luce / buio.
• Vola Virgin sono isolati in anestesia anidride carbonica nel giorno della eclosion. Per gli studi di invecchiamento, le mosche sono mantenuti in gruppi di venti per fiala e trasferito in una fiala fresco ogni 3 giorni. E 'importante utilizzare le mosche fratello dalla croce stessa dei genitori per gli studi di invecchiamento, di minimizzare le differenze derivanti da substrato genetico.
• Per entrambi i test, le mosche sono sessuato e mantenuti in gruppi di dieci mosche per flaconcino. La differenza di genere sul comportamento è significativo ed è consigliabile non mescolare le mosche maschio e femmina in uno studio di dati potrebbe essere difficile da interpretare e riprodurre ^6.
• Per il saggio di geotassi negativo, mosche vengono ordinate in gruppi di dieci per flaconcino e testato un'ora dopo l'anestesia. E 'importante per le mosche di recuperare completamente da anestesia in quanto ciò potrebbe avere un effetto sulle attività locomotoria.
• Per il saggio di APS, vola di ogni gruppo vengono inseriti in una fiala vuota polistirolo inumidito con acqua carta da filtro per sei ore prima che il test viene eseguito. Questo assicura che le mosche sono affamati prima che il test e sarà più percettivo al gusto avverse. Poco prima del test viene eseguito, ogni volare da un gruppo di dieci è posto in una provetta vuota centrifuga 15 ml, che sono state limitate in modo impreciso, per evitare la fuga.

4. Geotassi test negativo

• Geotassi è generalmente misurata per 10-20 gruppi di dieci persone del genotipo stesso o di trattamento (100-200 vola totale per ciascun genotipo / trattamento) ^7. Gruppi sorta di dieci mosche di sesso femminile o maschile per un apparato di CO ₂ l'anestesia e il luogo di ogni gruppo in un flaconcino a parte. Attendere almeno un'ora per le mosche di recuperare da anestesia.
• Preparare l'apparato arrampicata per ogni gruppo, in modo che due fiale polistirolo vuote sono verticalmente uniti da nastro di fronte all'altra. E 'importante assicurarsi che le aperture dei flaconcini sono perfettamente allineati tra loro per fornire una superficie piana di arrampicata per le mosche.
• Per il flacone inferiore, misurare una distanza verticale di 8 cm al di sopra della superficie inferiore e contrassegnare ogni fiala disegnando un cerchio lungo l'intero perimetro del flaconcino.
• Trasferimento di un gruppo di dieci vola nel flacone inferiore attentamente impedire la fuga di una mosca. Coprire immediatamente il flacone inferiore con la fiala superiore e nastro in modo sicuro in prossimità del contatto con aperture. Lasciare le mosche per acclimatarsi alla nuova impostazione per 1 minuto prima di effettuare il test.
• Battere delicatamente la vola verso il fondo del flaconcino e misurare il numero di mosche che possono salire sopra il marchio da 8 cm per 10 secondi dopo il rubinetto.
• Ripetere questo test lo stesso gruppo dieci volte, consentendo periodo di riposo per 1 minuto tra ogni prova.
• Registrare il numero di mosche per ogni gruppo che hanno superato gli 8 cm marchio come unpercentuale totale di mosche.

5. Avversiva fototassi saggio di soppressione (APS Assay)

Originariamente adattato da Le Bourg e Buecher (2002) ^4, questa analisi sfrutta il comportamento positivo phototactic in treno vola a loro di associarsi luce con stimoli avversi (in questo caso, il gusto amaro del chinino). Dopo una formazione / condizionamento fase, mosche wild-type in grado di associare l'area illuminata con gusto repulsivo e evitarlo. Vola con compromessa capacità di apprendimento non riuscirà a fare questa associazione. Inoltre, il saggio APS può essere utilizzato anche per misurare la memoria a breve termine funzione di mosche ⁵ sottoponendo già vola addestrati per la stessa prova 6 ore dopo condizionamento per verificare la loro abilità nel ricordare il compito imparato.

1. Preparazione della soluzione di chinino
   • Sciogliere chinina cloridrato in acqua distillata per ottenere una soluzione 0,1 M magazzino (1.98g in 50mL di acqua distillata). Soluzione di riserva possono essere conservati a -20 ° C per un massimo di un anno in piccole aliquote
   • Preparare una soluzione di lavoro di 1 microM diluendo la soluzione madre in acqua distillata.
2. Preparazione del T-Maze
   • T-labirinto è costituito dalla colonna centrale con la botola e due camere indipendenti, una camera di "dark" e una camera "illuminata" (Figura 1).
   • Preparazione Camera: prendere due tubi 15ml centrifuga di plastica e tagliate a 2 ml marchio dal fondo chiuso concluderà con una sega manuale. Montare gli adattatori connettore ad ogni estremità, e sigillare il collegamento con parafilm. L'adattatore alla fine del tubo serve come lo slot di ingresso per la sorgente di luce a collo d'oca. Collegare un tubo con la sorgente di luce e questo tubo sarà la camera "illuminata". Avvolgere il tubo altre con un foglio di alluminio per fungere da camera "oscura".
   • Aggiungi 180uL o di acqua distillata o di soluzione di chinino per filtrare carta e porre in camera di luce.
   • Assemblare la T-labirinto avvitando le camere luminose e scure su ogni lato della colonna centrale, con la botola in mezzo chiuso (Figura 1).
   • Inserire la fonte di luce nella camera illuminata.
3. Formazione vola a sopprimere fototassi con stimoli avversi
   • Svitare la camera oscura dal T-labirinto e trasferire una mosca in questa camera e subito avvitare il tubo di nuovo al buio labirinto.
   • Spegnere le luci in sala e accendere la spia rossa.
   • Consentire al volo per acclimatare nella camera oscura per 30 secondi e lentamente accendere la fonte di luce illumina la camera illuminata. Aprire lentamente la botola che separa le due camere.
   • Se la mosca si dirige verso la camera illuminata entro 10 secondi, è considerato positivamente phototactic ed è pronto per essere addestrato per l'analisi. Fallimento in fototassi indica problemi nel sistema visivo e vola con fototassi negativi devono essere esclusi dal test.
   • Per la soppressione avversivo fototassi (APS) la formazione, tocca al volo che ha dimostrato fototassi positivo ritorno alla camera oscura, chiudere la botola e spegnete la luce. Attendere 30 secondi di acclimatazione. Durante questo tempo mettere carta da filtro con una soluzione di chinino nella camera illuminata. Aprire lentamente la botola e accendere la luce. Lasciare che il cammino volare nella camera di chinino rivestito illuminata. Dopo un minuto, toccare il volo di ritorno alla camera oscura e ripetere questo 9 volte di più. (In genere, tipo selvatico vola evitare la camera illuminata dopo 3 o 5 studi di formazione.)
   • Immediatamente dopo l'allenamento, cinque studi di prova sarà condotta. In ogni prova, prova, attendere 10 secondi dopo la luce è accesa per il volo addestrati a camminare verso la camera illuminata. Il mancato piedi dalla fiala illuminata sarà registrato come "Pass", che equivale a "compito appreso attraverso rinforzo". Il tasso Pass più di cinque prove consecutive viene registrato e mostrato sotto nella figura 2 come PC0 (0 condizionamento post ora).
4. La valutazione a breve termine funzione di memoria in Flies
   • Dopo una formazione iniziale e PC0 registrazioni, ogni volo è posto di nuovo nella sua fiala cibo originale e tenuti da parte per sei ore.
   • Sei ore di formazione post, sottopone ogni volare a 5 studi ancora allo stesso modo di prima, e registrare il numero di volte al volo evita (pass) o va in (non riuscito) il flacone illuminato. Questo tasso di passaggio viene registrato come PC6 (6 ore dopo condizionamento), che è un indicatore della memoria a breve termine.

6. Interpretazione dei dati e analisi statistica

1. Geotassi test negativo
   • I dati grezzi generati da questa analisi rappresenta il numero di mosche che attraversano l'8-cm marchio in 10 secondi in ogni gruppo. Convertire questa percentuale e per calcolare il tasso medio di passaggio per ogni gruppo di oltre 10 sessioni.
   • Dati sono rappresentati graficamente come un pass rate medio per gruppo (genotipo, trattamento, ecc) con l'errore standard della media (SEM).
   • Differenze tra i gruppipuò essere determinata per essere statisticamente significativo o non si utilizza un test t di Student o ANOVA.
2. Avversiva fototassi Soppressione Assay
   • I dati grezzi di questa analisi è rappresentato come il numero di volte ogni volo evita la camera illuminata in cinque prove successive. Il tasso di passaggio è calcolato come la percentuale di prove evitare di successo nel corso degli studi clinici totale. Calcolare il tasso medio di passare in questo modo per un minimo di 15 mosche per gruppo.
   • I dati vengono rappresentati graficamente come il tasso medio di passare PC0 (subito dopo il condizionamento; indicatore di "apprendimento") o il tasso medio di passare PC6 (6 ore dopo il condizionamento; indicatore "memoria") con i rispettivi SEM.
   • Indici di apprendimento e memoria vengono confrontate tra i gruppi sia di tipo selvatico e "geneticamente manipolati-benigno" gruppo (come la GFP iperespressione di aria) in modo appropriato.

7. Rappresentante Risultati

In questo esperimento video, stiamo valutando deficit di apprendimento e la memoria e il motore nelle mosche iperespressione umano Tau nel sistema nervoso centrale e confrontando le loro prestazioni a quelle delle mosche overesprimenti GFP. Sovraespressione neuronale del Tau umani in Drosophila ha dimostrato di causare gravi vacuolizzazione nel cervello ⁸ e portare a significativi deficit di apprendimento e di funzioni di memoria ^9. Come mostrato nella Figura 2A, 10 giorni maschio o femmina vola sovraesprimono umano Tau hanno deficit motorio significativo rispetto ai pari età GFP sovraesprimono mosche. Inoltre, queste mosche non associare la luce con gusto amaro come dimostrato dal tasso di PC0 passare rispetto al gruppo di controllo, così come non ricordare questa associazione, come indicato dalla diminuzione del tasso di passaggio PC6 (Figura 2B). Questo esperimento conferma ulteriormente che i modelli di Drosophila possono essere usati per studiare le malattie neurodegenerative umane e ricapitola alcuni dei fenotipi comportamentali osservati negli esseri umani e mammiferi.

Figura 1. T-Maze di installazione per analisi avversivo Soppressione fototassi. A. L'impostazione generale sperimentale per l'esperimento APSA con la sorgente luminosa collegata al tubo "illuminato" falco, foderato con carta da filtro e il tubo "dark" a sinistra (coperto in fogli), separati da una botola. B. Durante la fase di test e allenamenti, la mosca è nella camera oscura e la botola aperta dopo la luce è accesa nella camera illuminata.

Figura 2. Risultati rappresentativi dal geotassi negativo e sperimentare APS con iperespressione di mosche GFP o Tau con un pan-neuronale driver. A. Nel test geotassi negativo, 10 giorni di età maschile (colonna blu) o femmina (colonna rossa) vola sovraesprimono GFP ha mostrato una maggiore attività di arrampicata di Tau-sovraesprimono mosche. B. di 20 giorni vecchia femmina vola iperespressione GFP ha mostrato una migliore apprendimento (PC0) e memoria (PC6) le funzioni di Tau iperespressione di mosche.

Discussione

Sia geotassi negativo e saggi APS sono robusti test comportamentali per misurare le variazioni locomotore o di apprendimento e capacità di memoria derivanti da manipolazioni genetiche o ambientali. Tuttavia, ci sono alcuni svantaggi di questi saggi che attendono un'ulteriore ottimizzazione.

Nel saggio geotassi negativo, le mutazioni in alcuni geni può rendere gravi disfunzioni motorie nelle mosche. In tali casi, le mosche difficilmente può scalare i muri, in risposta alla forza di gravità su agitazione. Saggi di altro comportamento che, direttamente misurare il movimento può essere più appropriato. Questi test includono il comportamento riflesso di raddrizzamento che misura la paralisi e il sequestro ^10, e il comportamento optomotor ¹¹ che registra la perdita di coordinazione motoria.

Nel saggio APS, l'ostacolo prima può essere vola a caso fermarsi all'ingresso della camera illuminata, senza andare avanti. Questo diventa più un problema se l'invecchiamento è una delle condizioni studiate, dal momento che vola più anziani sono meno attivi in ​​generale e tendono a fermarsi e riposare per lunghi periodi di tempo. In questo caso lo sperimentatore deve fornire stimoli meccanici di promuovere la libera, che non è sempre efficace. In secondo luogo, si potrebbe sostenere che la mancata andare ai risultati camera illuminata da una perdita di fototassi positivo. Questo è raramente il caso, in quanto il lavoro precedente ha mostrato che vola tornare indietro alla capacità di risposta luce una volta che il negativo rafforzare viene rimosso ^4. In terzo luogo, la durata del contatto con lo stimolo avversivo può variare da prova a prova. Questa variazione di solito può essere ridotto circonda la parete interna della camera con carta da filtro imbevuto di prevenire vola da evitare il chinino. Inoltre, lo sperimentatore può garantire che ogni volo passano abbastanza tempo a contatto con la carta da filtro, aumentando la quantità di tempo trascorso nella camera da diversamente specificato 1 minuto.

In sintesi, geotassi negativo e saggi APS sono modi veloci e semplici per valutare deficit comportamentali e quantitativamente indicare locomotore e di apprendimento e le capacità di memoria in Drosophila. Questi test sono particolarmente utili nella modellazione umana malattie neurodegenerative in Drosophila.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materiale	Azienda	Numero di catalogo	Commento
Polistirolo Vial	Vial Campidoglio, Inc.	28Fly	28,5 x 95 Vial polistirolo mm, qualità dei materiali importanti, male se troppo scivoloso per le mosche a salire.
Dissezione stereoscopio	Zeiss	000000-1432-979	2 filiali a collo d'oca guida di luce (12V/30W)
Chinino cloridrato	Sigma Aldrich	6119-47-7	Sciogliere in acqua distillata.
Quick Disconnect Connettori	Nalgene (VWR)	62868-021	Polietilene ad alta densità
T-Maze	Semplici sistemi comportamentali
Singolo canale 200 microlitri pipetta	Eppendorf	022443305