에 시금 운동력이있는 사람, 학습, 및 메모리 적자 Drosophila 모델

요약

, 전위의 기능을 측정하는 학습을위한 행동 assays, 및 메모리 능력 Drosophila.

초록

유전 방식의 발전 모델 시스템 ^1로 Drosophila를 사용하여 인간의 neurodegenerative 질병에 관련된 유전자의 연구를 활성화했습니다. 알츠하이머, 파킨슨병과 헌팅턴의 질병을 포함하여 이러한 질병의 대부분은 학습과 기억 기능 및 운동 조정 ² 연령에 의존 저하가 특징입니다. 여기 우리는 인간 neurodegeneration와 관련된 행동 특성 중 일부는 파리에 recapitulated 수있는 것을 보여주기 위해 부정적인 geotaxis 분석 ³ aversive phototaxic 억제 분석 (APS 분석) ^4,5를 포함한 행동 assays를 사용합니다. 부정 geotaxis 분석에의 자연 경향이 흥분이 유전자 또는 전위의 용량을 저해 수 조건을 연구 활용하면 중력에 대해 이동 파리. APS의 분석에서 학습 및 메모리 기능 aversive 쓴맛과 조명을 연결시키고 그럼으로써 빛을 향해 이동이 다르게 자연적인 경향을 피하기 위해 훈련 비행 긍정적 - phototactic에서 테스트합니다. 이러한 훈련을 테스트하는 것은 6시간 사후 교육이 메모리 기능을 평가하는 데 사용됩니다 날아. 이러한 assays를 사용하여 개발 neurodegeneration 대​​한 모든 유전 또는 환경 요인의 기여는 쉽게 파리에서 공부하실 수 있습니다.

프로토콜

1. 소개

이 비디오에서는, 우리는 운동과 neurodegenerative 장애에 손상 아르 학습과 기억 기능의 측정을 설명하기 Drosophila를 사용하여 두 행동 assays을 설명합니다. 첫째, 우리는 운전하는 행위는 부정 geotaxis 분석을 사용하여 측정하는 방법을 보여줍니다. 둘째, 우리는 aversive 쓴맛과 조명을 연결하기 위해 훈련하고 메모리 기능을 평가 6 시간 후에 테스트 긍정적 - phototactic 파리를 사용하여 학습과 기억 능력을 평가할 것입니다. 마지막으로, 우리는 이러한 행동 assays의 의미와 한계를 설명합니다.

2. 장비 및 시약

1. 작업 플라이
   • 스테레오 스코프 (자이스 혈구)
   • 파리 푹신한 작은 페인트 붓
   • Drosophila 이산화탄소 (CO ₂₎ 마취 장치 (Geneseesci, 병원)
2. 부정 Geotaxis 분석
   • 28.5 X 95mm의 폴리스티렌 비알 (국회 의사당 여사님, 주식 회사)
   • 미니 알람 타이머 / 스톱워치 (VWR 인터내셔널)
   • 샤피의 펜
   • 접착제 테이프
3. Aversive Phototaxis 억제 분석
   • 퀴나인 염산염 (시그마 알드리치, CAS 번호 : 6119-47-7)
   • 증류수
   • 무게로 정확한 희석 디지털 측정 스케일
   • 빠른 연결 해제 커넥터, 고밀도 폴리에틸렌 (NALGENE VWR 카탈로그 번호 62868-021)
   • 광원에 대​​한 빠른 연결 끊기 커넥터 어댑터에 맞게 폐쇄 월말부터 2 ML 마크에서 컷 15 ML의 원심 분리기 튜브 (VWR 인터내셔널),
   • 챔버 라이닝 여과지에 말라리아 솔루션을 로드할 수 단일 채널 200 μL pipetter
   • T - 미로 (간단한 행동 시스템, 그림 1)
   • 알루미늄 호일
   • 광원 (자이스 혈구)
   • 빨간 불빛과 함께 램프.
   • 필터 페이퍼
   • 미니 알람 타이머 / 스톱워치 (VWR 인터내셔널)

3. 파리 준비

• 파리가 25 표준 cornmeal - 한천 - 당밀 - 효모 매체에 유지 관리됩니다 ° C 12 시간 라이트 / 어두운주기.
• 버진 파리는 eclosion 당일 이산화탄소 마취 격리됩니다. 노화 연구, 파리는 유리병 당 스무 그룹으로 관리하고 매 3 일 신선한 유리병로 전학 왔어. 유전 배경에서 발생하는 차이를 최소화하기 위해, 노화 연구에 대해 동일한 부모의 십자가에서 형제 파리를 사용하는 것이 중요합니다.
• assays 모두, 파리는 유리병 지당 10 파리의 그룹 sexed 유지하고 있습니다. 행동에 성별 차이가 상당한이며 데이터가 ^6을 해석하고 재현하기 어려울지도로 연구에 남성과 여성의 파리 혼합하지 않는 것이 좋습니다.
• 부정 geotaxis 분석을 위해, 파리는 유리병 지당 10의 그룹으로 분류되고 마취 후 한 시간을 테스트했습니다. 이 전위의 활동에 영향을 미칠 수도로 난다는 마취에서 완전히 회복하는 것이 중요합니다.
• APS의 분석은 각 그룹의 파리는 분석이 수행되기 전에 6 시간 동안 필터 종이 moistened 물로 빈 폴리스티렌 약병에 배치됩니다. 이것은 파리가 분석되기 전에 굶어 죽고 있으며 aversive의 맛을 더 통찰력 수 있도록합니다. 분석이 수행되기 전에, 열 그룹에서 각 비행기는 다음 탈출을 피하기 위해, 느슨하게 났고요 빈 15mL 원심 튜브에 배치됩니다.

4. 부정 Geotaxis 분석

• Geotaxis는 일반적으로 동일한 유전자형이나 치료 (각 유전자형 / 치료를 위해 총 100-200 파리) ⁷ 십 개인의 10-20 그룹에 대한 측정됩니다. 별도의 약병에 각 그룹 CO ₂ 마취 장치 및 장소에 만불 여성이나 남성 파리 정렬 그룹. 마취에서 회복하기 위해 파리에 대해 최소한 하나 시간을 허용합니다.
• 이 빈 폴리스티렌 튜브가 수직으로 서로를 마주 테이프에 합류하는 등 각 그룹에 대한 등반 장치를 준비합니다. 튜브의 구멍이 완벽하게 파리에 대한도 등반 표면을 제공하기 위해 서로 정렬되어 있는지 확인하는 것이 중요합니다.
• 낮은 유리병은 바닥 표면 위에 8cm의 수직 거리를 측정하고 유리병의 전체 둘레 주위에 원을 그리는 각 유리병을 표시합니다.
• 신중하게 모든 비행의 탈출을 방지 낮은 유리병에 열 파리의 그룹을 전송합니다. 즉시 안전하게 접촉 구멍 상단 유리병과 테이프로 낮은 병을 커버. 파리 분석을 실시하기 전에 1 분 새로운 설정으로 순응 수 있습니다.
• 부드럽게 유리병의 바닥에 파리를 누르고 탭시 10 초 8 cm 표시 위에 올라갈 수있는 파리의 수를 측정합니다.
• 각 시험 사이 일분 나머지 기간 동안 수 있도록, 같은 그룹에 열번이 분석을 반복합니다.
• 로 8 cm 마크를 통과 그룹당 파리의 개수를 기록총 파리 비율입니다.

5. Aversive Phototaxis 억제 분석 (APS 어세이)

원래 르 부르그 및 Buecher (2002 년) ⁴ 적응이 분석은 aversive의 자극 (이 경우, 말라리아의 쓴맛)와 빛을 연결할 그들을 훈련하기 위해 파리에있는 긍정적인 phototactic 동작을 악용. 교육 / 에어컨 위상 후, 야생 입력 파리 aversive 맛이있는 조명 영역을 연결하고 그것을 피할 수있게 될 것입니다. 손상된 학습 용량 파리는이 협회를 만들기 위해 실패합니다. 또한, APS 분석도의 단기 기억 기능을 측정하는 데 사용할 수있는 것은 배운 작업을 기억 능력을 테스트하는 동일한 테스트 6시간 포스트 컨디셔닝에 이미 훈련 파리를 쓰는하여 ⁵ 날아.

1. 퀴나인 솔루션을 준비
   • 0.1M 주식 솔루션 (50mL 증류수에 1.98g)하기 위해 증류수에 말라리아 염산염을 디졸브. 주식 솔루션은 작은 aliquots에 년 -20 ° C에서 최대 유지 수 있습니다
   • 증류수의 재고 솔루션을 diluting 약 1 μm의의 작업 솔루션을 준비합니다.
2. T - 미로를 준비
   • T - 미로에서 출구와 두 개의 독립적인 회의소, "어둠"의 챔버와 "조명"챔버 (그림 1)와 센터 컬럼으로 구성되어 있습니다.
   • 상공 회의소 준​​비는 두 15mL 플라스틱 원심 분리기 튜브를 타고 아래에서 2 ML 표시에 절단 설명서 끝부분을 폐쇄 보았다. 각 끝에있는 커넥터 어댑터를 맞춤하고, parafilm와 연결을 밀봉. 튜브의 끝에 어댑터 구스넥 광원에 대​​한 입력 슬롯 역할을합니다. 광원과 하나가 튜브를 연결하고 튜브는 "조명"챔버 것입니다. "어둠"의 챔버 역할을 다른 튜브 알루미늄 호일로 감싸주세요.
   • 증류수 또는 조명 챔버의 종이와 장소를 필터링하는 말라리아 솔루션 중 하나 180uL을 추가합니다.
   • 중간 폐쇄 (그림 1)에서 트랩 도어와 센터 컬럼의 각 측면에 조명과 어두운 회의소 바람을 피우고하여 T - 미로를 조립.
   • 조명 챔버에 광원을 넣습니다.
3. 교육 aversive 자극과 phototaxis을 억제하기 위해 날아
   • 돌려서는 어둠 T - 미로에서 실이 챔버에 하나의 비행기를 전송하고 즉시 미로로 다시 어둠의 튜브를 나사.
   • 방에 불을 끄고 적색 램프를 켭니다.
   • 파리가 30 초 동안 어둠 챔버에 순응 천천히 조명 챔버 조명 광원을 설정하도록 허용합니다. 천천히 두 방을 분리 트랩도어를 엽니다.
   • 파리가 10 초 이내에 조명 챔버에 산책하면, 그것은 긍정적 phototactic 간주하고 분석을 위해 훈련 준비입니다. phototaxis에 실패 시각 시스템에 문제를 지적하고 부정 phototaxis은 분석에서 제외해야 함께 날아.
   • Aversive Phototaxis 억제 (APS) 교육 들어, 어두운 챔버로 긍정적인 phototaxis을 보여준 플라이를 누르고 트랩 도어를 닫고 불을 끕니다. acclimatizing 30 초 수 있습니다. 이 시간 동안 조명 챔버에 말라리아 솔루션 필터 종이를 넣어. 천천히 트랩 문을 열고 불을 켭니다. 말라리아 코팅 조명 챔버에 파리 산책을 허용합니다. 일분 후, 어둠의 챔버에 다시 파리를 탭이 9 번 이상 반복합니다. (일반적으로 야생 유형 3-5 훈련 재판 후 조명 챔버를 피하기 날아.)
   • 즉시 훈련 후 다섯 테스트 실험이 실시됩니다. 각 시험 재판에서 빛이 조명 실로 걸어 훈련 비행을 위해 켜져 10 초 후 수 있습니다. 조명 유리병에 도보로 실패는 "보강을 통해 배운 과제"와 동일합니다 "패스"로 기록됩니다. 다섯 경기를 연속으로 시련을 통해 패스 요금은 기록하고 PC0 (0 HR 게시물 금고) 그림 2 아래와 같습니다.
4. 파리의 단기 기억 기능을 평가
   • 교육 및 초기 PC0 녹음 후, 각 비행기는 원래 음식 약병에 다시 배치하고 6 시간 동안 따로 보관.
   • 여섯 시간 포스트 훈련, 주제 각 비행을 이전과 같은 방식으로 다시 다섯 재판하고, 횟수, 파리가 (실패) 조명 병을 방지 (합격) 또는에 간다를 기록합니다. 이 패스 속도는 단기 기억의 지표 PC6 (6 시간 게시물 컨디셔닝)로 기록됩니다.

6. 데이터 해석 및 통계 분석

1. 부정 Geotaxis 분석
   • 이 분석에서 생성된 원시 데이터는 각 그룹에서 10 초 8 cm 표시를 건너 파리의 수를 나타냅니다. 비율이 변환 10 세션이 지남에 따라 각 그룹에 대한 평균 통과 속도를 계산합니다.
   • 데이터는 의미의 표준 오차 (SEM)과 그룹당 평균 통과 속도 (유전자형, 치료 등) 그래픽 표시됩니다.
   • 그룹 간의 차이점다음 통계적으로 의미가 또는 학생 T - 테스트 또는 ANOVA를 사용하지 않는 것으로 결정하실 수 있습니다.
2. Aversive Phototaxis 억제 분석
   • 이 분석에서 원시 데이터는 각 비행 다섯 연속 시련의 조명 챔버를 방지 횟수로 표현된다. 통과 율은 전체 시련을 통해 성공적인 회피 실험의 비율로 계산됩니다. 그룹 당 15 파리 최소이 방법으로 평균 통과 속도를 계산합니다.
   • 또는 평균 통과 속도 PC6 (6 시간 이후 헤어드라 이어, "메모리"표시기) 각각 SEM과 함께, 데이터를 그래픽으로 평균 통과 속도 PC0 ( "학습"표시기가 바로 에어컨 후)로 표현된다.
   • 학습 및 메모리 인덱스는 야생 입력하고 "유전 - 조작 - 양성"그룹 (예 : GFP overexpressing가 날아 등) 적절하게 모두 그룹 간의 비교입니다.

7. 대표 결과

이 비디오 실험에서, 우리는 중추 신경계에 날아 overexpressing 인간 타우의 학습 및 메모리와 모터 적자를 평가하고 파리 overexpressing GFP의 그 자신의 성능을 비교. Drosophila 인간의 타우의의 연결 overexpression은 뇌 ⁸ 심각한 vacuolization 원인과 학습 및 메모리 기능 ⁹ 상당한 적자로 이어질을 보여줘왔다. 그림 2A와 같이, 십일 오래된 남성 또는 여성이 overexpressing 인간의 타우가 날아 연령 일치하는 GFP overexpressing에 비해 상당한 운동력이있는 사람의 결손을 날아. 또한, 이러한 파리 컨트롤 그룹에 비해 PC0 통과 속도에 의해 그림과 같이 쓴맛과 조명을 연결하는 데 실패뿐만 아니라, PC6 통과 속도 (그림 2B)의 감소에 의해 그림과 같이 해당 협회를 기억하지 못합니다. 이 실험은 더욱 Drosophila 모델 인간 neurodegenerative 조건을 공부하고 인간과 포유류의 관찰 행동 phenotypes의 일부를 recapitulating 사용할 수있는 것을 확인합니다.

그림 1. Aversive Phototaxis 억제 분석을위한 T - 메이즈 설치합니다. A.이 트랩도어로 구분하여 왼쪽 (호일로 덮여)에 필터 종이와 "어둠"의 튜브로 늘어선 "조명"팔콘 튜브,에 연결된 광원과 APSA 실험에 대한 전반적인 실험 설정. B.는 교육 및 시험 단계 동안, 파리가 어둠 챔버에 있으며 표시등이 조명 챔버에서 설정 후 트랩 문이 열렸어.

그림 2. 사용하여 부정 geotaxis와 APS의 실험에서 결과는 대표 팬의 연결 드라이버 overexpressing GFP 또는 타우를 파리. 답변 부정 geotaxis 분석에서, 10 일 된 남자 (블루​​ 열) 또는 여성 (빨간색 열) overexpressing GFP는 타우 - overexpressing은 파리보다 높은 등반 활동을 보여주 날아. B. 20 일 된 암컷은 overexpressing GFP가 타우 overexpressing가 파리보다 (PC6) 함수 더 나은 학습 (PC0)와 메모리를 보여주 날아.

토론

부정 geotaxis와 APS의 assays 모두 운동력이있는 사람이나 학습과 유전 또는 환경 조작에서 발생하는 메모리 용량의 변화를 측정하기 위해 강력한 행동 assays 있습니다. 그러나, 더 최적화를 기다리고 이러한 assays 몇 가지 단점이 있습니다.

부정 geotaxis 분석에서 특정 유전자의 돌연변이 파리에 심각한 모터 장애를 렌더링 수 있습니다. 이러한 경우에는, 파리는 거의 선동에 따라 중력에 대응 벽면을 타고 수 없습니다. 직접 움직임을 측정하는 다른 행동 assays가 더 적절한 수 있습니다. 이러한 assays 마비가와 압류 ^10, 및 운동 조정의 손실을 기록 optomotor 행동 ¹¹ 대책 righting 반사 행동을 포함합니다.

APS의 분석에서, 최초의 방해가 무작위로 전진하지 않고 조명 챔버의 입구에서 막는 파리하실 수 있습니다. 이전 파리 일반적으로 덜 활성과 오랜 기간 동안 중지하고 휴식하는 경향이 이후 노화가 공부 조건 중 하나에있는 경우이 문제가 더된다. 이 경우에는 실험자 항상 유효하지 않습니다 움직임을 촉진하기 위해 기계적 자극을 제공한다. 둘째, 하나는 논쟁 수도 긍정 phototaxis의 손실에서 조명 챔버 결과로 이동 실패. 이전 작업 보강 부정은 ^4를 제거되면 파리는 빛의 반응을 되돌릴 것으로 나타났습니다 때문에 이것은 거의 경우 않습니다. 셋째, aversive의 자극과 접촉의 기간은 재판에서 재판에 따라 다를 수 있습니다. 이 변화는 일반적으로 말라리아를 피하에서 파리를 방지하기 위해 절어 필터 종이 챔버의 내부 벽 encircling으로 줄일 수 있습니다. 또한, 실험자 각 플라이는 별도의 언급이 일분의 챔버에서 보낸 시간의 양을 늘림으로써 필터 종이와 접촉에 충분한 시간을 보낼 수 있도록 수 있습니다.

요약, 음성 geotaxis와 APS의 assays 행동 결손을 평가 빠르고 간단한 방법이며, 양적 운동력이있는 사람과 Drosophila의 학습과 기억 능력을 나타냅니다. 이러한 assays은 Drosophila 인간의 neurodegenerative 조건을 모델링 특히 유용합니다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
자료	회사	카탈로그 번호	논평
폴리스티렌 비알	캐피톨 여사님, 주식 회사	28Fly	28.5 X 95mm의 폴리스티렌 여사님, 소재의 품질 중요한 나쁜 파리 등산하기 너무 미끄러워 경우.
입체경를 해부	자이스 혈구	000000-1432-979	두 가지 거위 목 라이트 가이드 (12V/30W)
퀴나인 염산염	시그마 알드리치	6119-47-7	증류수에 용해.
빠른 연결 해제 커넥터	Nalgene (VWR)	62868-021	고밀도 폴리에틸렌
T - 메이즈	간단한 동작 시스템
단일 채널 200 μL 피펫	Eppendorf	022443305