Опорно-двигательного опробование, обучение и память Дефицит Drosophila Модели нейродегенерации

Резюме

Поведение тесты для измерения опорно-двигательной функции, обучения и памяти, способности в Drosophila.

Аннотация

Достижения в области генетических методов позволило изучение генов, участвующих в человеческом нейродегенеративных заболеваний с использованием дрозофилы как модельной системы ^1. Большинство из этих заболеваний, включая болезнь Альцгеймера, Паркинсона и болезнь Хантингтона характеризуются возрастных ухудшения в процессе обучения и памяти, функций и координацию движений ^2. Здесь мы используем поведенческие тесты, в том числе отрицательный анализ geotaxis ³ и отвращение phototaxic анализа подавления (APS анализа) ^4,5, чтобы показать, что некоторые из поведения характеристик, связанных с человеческим нейродегенерации могут быть обобщены в мух. В отрицательном анализе geotaxis, естественная тенденция мух двигаться против силы тяжести, когда взволнованный используется для исследования генов или условия, которые могут помешать опорно-двигательной способности. В анализе APS, обучения и памяти функции тестируются в положительно phototactic мухи обучение связать свет с неприятным горьким вкусом и, следовательно, избежать этого, в противном случае естественная тенденция двигаться к свету. Тестирование этих обученных мух 6 часов после обучения используется для оценки функции памяти. С помощью этих анализов, вклад какого-либо генетических или экологических факторов по отношению к развивающимся нейродегенерации может быть легко учился в мух.

протокол

1. Введение

В этом видео мы продемонстрируем два поведенческих тестов использованием дрозофилы, чтобы продемонстрировать измерения движения и обучения и памяти функции, которые оказываются под угрозой в нейродегенеративных расстройств. Во-первых, мы покажем, как опорно-двигательного поведения может быть измерена с помощью отрицательного анализа geotaxis. Во-вторых, мы проведем оценку обучения и памяти, способности использованием положительно phototactic мух, которые обучаются ассоциировать света с неприятным горьким вкусом, а затем протестированы через 6 часов для оценки функций памяти. Наконец, мы будем обсуждать последствия и ограничения этих поведение анализов.

2. Оборудование и реактивы

1. Fly работы
   • Стерео область (Zeiss)
   • Малые кисти для толкания мух
   • Дрозофилы углекислого газа (CO _2), наркозный аппарат (Geneseesci, Inc)
2. Отрицательные Пробирной Geotaxis
   • 28,5 х 95 мм Полистирол флакон (Capitol флакон, Inc)
   • Мини-Alarm Таймер / Секундомер (VWR International)
   • Sharpie ручки
   • Скотч
3. Отвращение Фототаксис борьбе Пробирной
   • Хинин гидрохлорид (Sigma Aldrich, CAS номер: 6119-47-7)
   • Дистиллированная вода
   • Цифровая измерительная шкала для точного разбавления по весу
   • Быстрый Отсоедините разъемы, полиэтилен высокой плотности (Nalgene VWR Каталог номер 62868-021)
   • 15 мл Центрифуга Тюбе (VWR International), разрезать на 2 мл знаком с закрытым концом, чтобы соответствовать с быстрой адаптер Разъем для Отключите источник света
   • Одноканальный 200 мкл pipetter загрузить хинин раствор на фильтровальной бумаге подкладка камеры
   • Т-Maze (простой поведенческой системы; Рисунок 1)
   • Алюминиевая фольга
   • Источник света (Zeiss)
   • Лампу с красным светом.
   • Фильтровальная бумага
   • Мини-Alarm Таймер / Секундомер (VWR International)

3. Подготовка мух

• Мухи ведутся на стандартных фуражное зерно-агар-патоки-дрожжевой среде при 25 ° С на 12 ч свет / темно-цикла.
• Девы мухи изолированы под наркозом углекислого газа в день eclosion. Для старения, мух ведутся в группах по двадцать на флакон и переданы в свежем флакон каждые 3 дня. Важно использовать родной брат летает из той же родительской кресте за старения, чтобы свести к минимуму различия, связанные с генетическими фонов.
• Для обоих тестов, мухи сексуальны и поддерживается группами по десять мух на флакон. Гендерных различий на поведение является значительным и желательно не смешивать мужские и женские мухи в исследовании как данные могут быть трудно интерпретировать и воспроизводить ^6.
• При отрицательном анализе geotaxis, мух разбиты на группы по десять на флакон и испытаны в течение часа после наркоза. Важно, чтобы мухи восстановить полностью из наркоза, поскольку это может оказать влияние на опорно-двигательной деятельности.
• Для анализа APS, мух каждой группы помещаются в пустой флакон полистирола с водой смоченной фильтровальной бумаги в течение шести часов до анализа не производится. Это гарантирует, что мухи от голода до анализа и будет наиболее восприимчив к неприятным вкусом. Перед анализ проводится, каждый летать из группы десяти помещается в пустую 15 мл центрифужную пробирку, которую затем ограничен свободно, чтобы не убежать.

4. Отрицательные Пробирной Geotaxis

• Geotaxis обычно измеряется в течение десяти до двадцати групп из десяти особей того же генотипа или лечения (100-200 мух итог для каждого генотипа / лечение) ^7. Сортировать группы из десяти женщин или мужчин летает на CO ₂ аппарата анестезии и место каждой группы в отдельную пробирку. Позвольте по крайней мере, один час для мух, чтобы оправиться от наркоза.
• Подготовка восхождения аппарата для каждой группы, так, что два пустых флаконов полистирола вертикально соединены лентой лицом друг к другу. Важно, чтобы убедиться, что отверстия флаконы идеально ровные друг с другом, чтобы обеспечить даже восхождение поверхность для мух.
• Для нижней флакон, измерять расстояние по вертикали от 8 см выше поверхности дна и пометить каждый флакон, нарисовав окружность вокруг всей окружности флаконе.
• Передача группу из десяти летит в нижний флакона тщательно предотвращения побега любой летать. Немедленно закрыть нижнюю флакон с верхней флакон и ленты надежно возле связавшись отверстия. Разрешить мух для адаптации к новой настройки в течение 1 минуты до проведения анализа.
• Аккуратно нажмите летит вниз на дно флакона и измерить количество мух, которые могут подняться выше 8-см знака через 10 секунд после крана.
• Повторите этот тест для той же группы в десять раз, что позволяет в течение 1 минуты период отдыха между каждой попытке.
• Запись количества мух в группе, которая прошла 8-см пометить какПроцент от общего числа мух.

5. Отвращение Фототаксис борьбе анализ (APS Пробирной)

Изначально взято из Ле Бур и Бюхер (2002) ^4, этот анализ подвиги положительное поведение phototactic у мух, чтобы обучить их, чтобы связать свет с стимулы отвращение (в данном случае, горький вкус хинина). После обучения / кондиционирования фазы, диких мух типа смогут ассоциировать освещенной зоне со вкусом отвращение и избегать его. Мухи с ослабленной возможности обучения будет не в состоянии сделать этого объединения. Кроме того, анализ APS может также использоваться для измерения краткосрочных функцией памяти мух ^5, подвергая уже подготовленных летит в тот же тест 6 часов после кондиционирования проверить свои способности в запоминании узнал задачи.

1. Подготовка Хинин решения
   • Растворите хинина гидрохлорида в дистиллированной воде, чтобы сделать 0,1 М раствора акций (1.98g в 50 мл дистиллированной воды). Маточный раствор можно хранить при температуре -20 ° С до года в небольших аликвот
   • Подготовка рабочего раствора 1 мкМ путем разбавления исходного раствора в дистиллированной воде.
2. Подготовка Т-Maze
   • Т-лабиринт состоит из центральной колонки с люк и два независимых камер, "темный" камеры и "засветившихся" камеры (рис. 1).
   • Палата приготовления: взять две 15 мл пластиковые пробирки центрифуги и сократить в 2 мл знаком со дна закрытым концом с ручной пилой. Установите разъем адаптера на каждом конце, и печатью связи с парафильмом. Адаптер на конце трубки служит входной разъем для источника света гусиная шея. Подключите один трубку с источником света и эта трубка будет "засветившихся" камеры. Оберните другую трубу с алюминиевой фольгой, чтобы служить в качестве «темной» камеры.
   • Добавить 180uL либо дистиллированную воду или хинин решение фильтровальную бумагу и поместите в свет камеры.
   • Соберите Т-образном лабиринте при помощи винтов освещенных и темных камерах с каждой стороны от центральной колонки, с люком в середине закрытых (рис. 1).
   • Вставьте источник света на освещенную камеру.
3. Обучение мухи, чтобы подавить фототаксис с отвращение стимулы
   • Отвинтите темной камере от Т-образном лабиринте и передачи одного летать в эту камеру и сразу же винт темно трубку обратно в лабиринт.
   • Выключите свет в комнате и включить красный фонарь.
   • Разрешить летать, чтобы акклиматизироваться в темной камере в течение 30 секунд и медленно включите источник света освещает освещенной камере. Медленно откройте люк, который отделяет две камеры.
   • Если лететь идет к освещенной камере в течение 10 секунд, он считается положительно phototactic и готов быть обучены для анализа. Неудача в фототаксис указывает на проблемы в зрительной системе и летит с отрицательным фототаксис должны быть исключены из анализа.
   • Для отвращение Фототаксис борьбе (APS), обучение, нажмите летать, которые продемонстрировали положительный фототаксис обратно в темную комнату, закройте люк и выключить свет. Разрешить 30 секунд акклиматизации. За это время положить фильтровальную бумагу с хинином раствора в освещенную камеру. Медленно откройте люк и включите свет. Разрешить летать ходить в хинин покрытием освещенной камере. Через одну минуту, нажмите лететь обратно в темную камеру и повторите это еще 9 раз. (Как правило, дикого типа мухи избежать освещенной камере после 3-х до 5 испытаний обучения.)
   • Сразу же после тренировки, пять испытаний тест будет проводиться. В каждом тесте суда, позволит через 10 секунд после свет включается на обучение летать ходить на освещенную камеру. Отказ идти к освещенному флакон будет записан как "Pass", которое эквивалентно "Задача, извлеченные в ходе подкрепление". Проходной балл в течение пяти последовательных испытаний записывается и показано на рисунке 2, как PC0 (0 ч после кондиционирования).
4. Оценка кратковременной памяти Функция в Мухи
   • После обучения и начальной PC0 записей, каждая муха помещены обратно в исходное флакон пищи и держали в стороне в течение шести часов.
   • Шесть часов после подготовки, с учетом каждого лететь в 5 испытаниях снова таким же образом, как и прежде, и записывать, сколько раз летать избегает (пропуск) или переходит в (провал) освещенные флаконе. Это проходной балл, отражается в качестве PC6 (6 часов после кондиционирования), который является показателем кратковременной памяти.

6. Интерпретация данных и статистический анализ

1. Отрицательные Пробирной Geotaxis
   • Сырые данные, полученные из этого анализа представляет собой количество мух пересечении 8-см отметку в 10 секунд в каждой группе. Преобразование это процент и вычислить среднюю скорость передачи для каждой группы в течение 10 сессий.
   • Данные представлены графически в виде среднем пропуск на группу (генотип, лечение и т.д.) с стандартная ошибка среднего (SEM).
   • Различия между группамиможет быть определена как статистически значимые или не использования студенческих Т-тест или ANOVA.
2. Отвращение Фототаксис борьбе Пробирной
   • Необработанные данные из этого анализа представляется как число выступлений каждого летать избегает освещенных камеры в пяти последовательных испытаний. Пройти курс рассчитывается как процент успешных испытаниях избежание более общего исследования. Рассчитать среднюю скорость передачи таким образом, в течение минимум 15 мух на группы.
   • Данные графически представлены как средняя скорость передачи PC0 (сразу после кондиционирования; "обучения" индикатор) или средней скорости передачи PC6 (6 часов после кондиционирования; «память» индикатор) с соответствующими SEM.
   • Обучение и память индексы сравниваются между группами и с диким типом и "генетически манипулировали-доброкачественная" группу (например, GFP гиперэкспрессией мух) соответственно.

7. Представитель Результаты

В этом видео-эксперимент, мы оцениваем обучения и памяти и моторных дефицитов у мух гиперэкспрессией человека Тау в центральной нервной системе и сравнение их эффективности с тех мух гиперэкспрессией GFP. Нейронные гиперэкспрессия человека Тау у дрозофилы было показано, что причиной тяжелых вакуолизация в головном мозге ⁸ и привести к значительному дефициту в процессе обучения и памяти функции ^9. Как показано на рисунке 2А, ​​10 день старого мужчины или женщины мухи гиперэкспрессией человека Тау имеют значительный дефицит двигательной по сравнению с подобранных по возрасту GFP гиперэкспрессией мух. Кроме того, эти мухи не удалось связать свет с горьким вкусом, как показано на PC0 проходной балл по сравнению с контрольной группой, а также не вспомнить эту ассоциацию как показали снижение PC6 проходной балл (рис. 2В). Этот эксперимент подтверждает, что дальнейшее дрозофилы модели могут быть использованы для изучения человеческих нейродегенеративных заболеваний и сводный некоторые поведенческие фенотипы наблюдается у человека и млекопитающих.

Рисунок 1. Т-Maze установки для отвращение Пробирной борьбе Фототаксис. A. Общей экспериментальной установки для эксперимента APSA с источником света связано с "засветившихся" Сокол трубки с подкладкой из фильтровальной бумаги и "темная" труба слева (покрыта фольгой), разделенных люк. Б. Во время фазы обучения и тестирования, муха в темной камере и люк открыт после свет включен в освещенную камеру.

Рисунок 2. Представитель результаты отрицательные geotaxis и APS эксперимент с использованием мухи гиперэкспрессией GFP или Тау с пан-нейронов водителя. A. В отрицательном анализе geotaxis, 10-дневный летний мужчина (синий столбец) или женский (красный столбец) мухи гиперэкспрессией GFP показали более высокие восхождение активность, чем Тау с гиперэкспрессией мух. B. 20-дневных самок гиперэкспрессией GFP показал лучшее обучение (PC0) и памяти (PC6) функций, чем Тау гиперэкспрессией мух.

Обсуждение

Оба отрицательных geotaxis и APS анализы надежную поведенческие тесты для измерения изменений в опорно-двигательной или обучения и оперативной памяти, связанных с генетическими или экологическими манипуляции. Однако Есть некоторые недостатки этих анализов, которые ожидают дальнейшей оптимизации.

В отрицательном анализе geotaxis, мутации в определенных генах могут оказать тяжелой дисфункции двигателя в мух. В таких случаях, мухи вряд ли лезть на стену в ответ на гравитацию на агитацию. Другие анализы поведения, которые непосредственно измерить движение может быть более подходящим. Эти анализы включают рефлекса поведения, что меры, паралич и захват ¹⁰ и ¹¹ оптомоторных поведения, которая записывает потеря координации движений.

В анализе APS, первым препятствием может быть мухи случайно остановки у входа в освещенную камеру, не двигаясь вперед. Это становится тем более важной проблемой, если старение является одним из условий изучены, так как пожилые мухи менее активны в целом и, как правило, остановитесь и отдохните в течение длительных периодов времени. В этом случае экспериментатор должен предоставить механические стимулы, чтобы способствовать движению, которое не всегда эффективны. Во-вторых, можно утверждать, что отказ ехать в освещенной камере результаты от потери положительный фототаксис. Это редкий случай, так как предыдущие исследования показали, что мухи вернуться к свету отзывчивость раз отрицательный укрепить удаляется ^4. В-третьих, продолжительность контакта с раздражителем отвращение могут варьироваться в зависимости от испытания к испытанию. Это изменение, как правило, уменьшается на окружающих внутренней стенке камеры с пропитанной фильтровальной бумаги, чтобы предотвратить мух от избегая хинина. Кроме того, экспериментатор может гарантировать, что каждый летать проводят достаточно времени в контакте с фильтровальной бумаги, увеличивая количество времени, проведенное в камере от иное 1 минуту.

Таким образом, отрицательное geotaxis и APS анализы быстро и простых способов оценки поведенческих дефицитов и количественно указывают и опорно-двигательного обучения и памяти, способности у дрозофилы. Эти анализы особенно полезны при моделировании нейродегенеративных заболеваний человека у дрозофилы.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Материалы	Компания	Номер в каталоге	Комментарий
Полистирол флакон	Капитолий флакон, Inc	28Fly	28,5 х 95 мм Полистирол флакон, качество материала важно, плохо, если слишком скользким для мух, чтобы подняться.
Пройдя через стереоскоп	Zeiss	000000-1432-979	2 филиала гусиная шея световода (12V/30W)
Хинин гидрохлорид	Sigma Aldrich	6119-47-7	Растворите в дистиллированной воде.
Быстрый Отсоедините разъемы	Nalgene (VWR)	62868-021	Полиэтилен высокой плотности
Т-Maze	Простые Поведенческие системы
Одноканальная пипетка 200 мкл	Эппендорф	022443305