Locomotor ensaio, Aprendizagem e Memória Os déficits no Drosophila Modelos de neurodegeneração

Resumo

Ensaios de comportamento para as funções de medição de locomoção, aprendizado e habilidades de memória em Drosophila.

Resumo

Avanços nos métodos de genética têm permitido o estudo dos genes envolvidos em doenças neurodegenerativas humanas utilizando Drosophila como um sistema modelo ^1. A maioria dessas doenças, incluindo Alzheimer, Parkinson e doença de Huntington são caracterizados por idade-dependente deterioração na aprendizagem e memória funções e coordenação do movimento ^2. Aqui usamos os testes comportamentais, incluindo o ensaio geotaxis negativo ³ e do ensaio de supressão phototaxic aversivo (APS ensaio) ^4,5, para mostrar que algumas das características de comportamento associado a neurodegeneração humano pode ser recapitulada em moscas. No ensaio geotaxis negativo, a tendência natural de moscas para mover contra a gravidade, quando agitada é utilizado para estudar genes ou condições que possam prejudicar a capacidade locomotora. No ensaio de APS, as funções de aprendizagem e memória são testadas em positivamente fototáxico-moscas treinados para associar luz com sabor amargo aversivo e, portanto, evitar essa tendência de outra forma natural de mover em direção a luz. Testar estes treinados voa 6 horas pós-treino é utilizado para avaliar as funções de memória. Com estes ensaios, a contribuição de qualquer fatores genéticos ou ambientais para a neurodegeneração em desenvolvimento podem ser facilmente estudada em moscas.

Protocolo

1. Introdução

Neste vídeo, vamos demonstrar dois ensaios comportamentais utilizando Drosophila para demonstrar a medição de locomoção e funções de aprendizagem e de memória que estão comprometidos em doenças neurodegenerativas. Primeiro, vamos mostrar como o comportamento locomotor pode ser medida utilizando o ensaio geotaxis negativo. Em segundo lugar, iremos avaliar o aprendizado ea memória habilidades usando moscas positivamente fototáxico que são treinados para associar luz com um sabor amargo aversivo e depois testados seis horas mais tarde para avaliar as funções de memória. Finalmente, discutiremos as implicações e limitações destes ensaios comportamento.

2. Equipamentos e reagentes

1. Fly trabalho
   • Âmbito estéreo (Zeiss)
   • Pequenos pincéis para empurrar moscas
   • Drosophila dióxido de carbono (CO ₂₎ aparelho de anestesia (Geneseesci, Inc)
2. Ensaio Geotaxis negativo
   • 28,5 x 95 Vial Poliestireno mm (Vial Capitol, Inc.)
   • Mini Alarme-Timer / Cronômetro (VWR International)
   • Canetas Sharpie
   • Fita adesiva
3. Aversivo Assay Supressão fototaxia
   • Cloridrato de quinino (Sigma Aldrich; CAS Number: 6119-47-7)
   • Água destilada
   • Escala de medição digital para diluição precisos em peso
   • Quick Disconnect Connectors, polietileno de alta densidade (Nalgene VWR Catalog No. 62868-021)
   • 15 tubo de centrifugação mL (VWR International), corte na marca de 2 mL da extremidade fechada para se encaixar com o adaptador Rápida Conector Disconnect para fonte de luz
   • Single-channel pipeta 200 mL de solução de quinino carga em papel filtro de revestimento da câmara
   • T-Maze (Simple Sistemas comportamental; Figura 1)
   • Folha de alumínio
   • Fonte de luz (Zeiss)
   • Uma lâmpada com luz vermelha.
   • Papel de filtro
   • Mini Alarme-Timer / Cronômetro (VWR International)

3. Preparando o Flies

• Moscas são mantidos em meio ágar-fubá-melaço de levedura-padrão a 25 ° C em um 12 hr ciclo claro / escuro.
• Moscas virgem são isolados sob anestesia de dióxido de carbono no dia da eclosão. Para estudos de envelhecimento, as moscas são mantidos em grupos de vinte por frasco e transferido para um frasco de doce a cada 3 dias. É importante o uso de moscas irmão da cruz mesmo dos pais para os estudos de envelhecimento, para minimizar as diferenças decorrentes da base genética.
• Para ambos os ensaios, as moscas são sexados e mantidos em grupos de dez moscas por frasco. A diferença de gênero no comportamento é significativo e é aconselhável não misturar as moscas macho e fêmea em um estudo de como os dados podem ser difíceis de interpretar e reproduzir ^6.
• Para o ensaio geotaxis negativo, as moscas são classificados em grupos de dez por frasco e testado uma hora após a anestesia. É importante para moscas para recuperar totalmente da anestesia, pois isso pode ter um efeito sobre as atividades locomotor.
• Para o ensaio APS, moscas de cada grupo são colocadas em um tubo de poliestireno vazio com água papel de filtro umedecido para seis horas antes do ensaio é realizado. Isso garante que as moscas estão famintos antes do ensaio e será mais perceptiva ao gosto aversivo. Pouco antes de o ensaio é realizado, cada voar a partir de um grupo de dez é colocado em um tubo de centrífuga de 15mL vazio, que é então tampado frouxamente, para evitar a fuga.

4. Ensaio Geotaxis negativo

• Geotaxis geralmente é medido para 10-20 grupos de dez indivíduos de mesmo genótipo ou tratamento (100-200 moscas total para cada genótipo / tratamento) ^7. Classificar grupos de dez moscas feminino ou masculino em um aparelho de anestesia CO ₂ e colocar cada grupo em um frasco separado. Permitir que pelo menos uma hora para as moscas para recuperar da anestesia.
• Prepare o aparelho de escalada para cada grupo, tanto que dois frascos de poliestireno vazias são unidos por fita vertical frente para o outro. É importante certificar-se que as aberturas dos frascos estão perfeitamente alinhados entre si para fornecer uma superfície uniforme escalada para as moscas.
• Para a parte inferior do frasco, medir uma distância vertical de 8 cm acima da superfície do fundo e marcar cada frasco desenhando um círculo ao redor de toda a circunferência do frasco.
• Transferência de um grupo de dez moscas no menor frasco com cuidado evitando a fuga de qualquer voar. Cobrir imediatamente o menor com o frasco superior e fita de segurança perto da aberturas de contato. Permitir que as moscas que se acostumar com o novo cenário para um minuto antes de realizar o ensaio.
• Bata suavemente as moscas até o fundo do frasco e medir o número de moscas que pode subir acima da marca de 8 cm em 10 segundos após o toque.
• Repita este teste para o mesmo grupo de dez vezes, permitindo um período de descanso de minutos entre cada teste.
• Registrar o número de moscas por grupo que ultrapassou a marca de 8 cm, comopercentual de moscas total.

5. Aversivo Assay Supressão fototaxia (APS Assay)

Originalmente adaptado de Le Bourg e Buecher (2002) ^4, este ensaio explora o comportamento positivo em fototáxico voa para treiná-los para associar luz com estímulos aversivos (neste caso, gosto amargo do quinino). Após uma fase de formação / condicionado, as moscas do tipo selvagem será capaz de associar a área iluminada com sabor aversivo e evitá-lo. Voa com capacidades de aprendizagem comprometido vai deixar de fazer essa associação. Além disso, o ensaio APS também pode ser usado para medir a função de memória de curto prazo de moscas ⁵ submetendo já voa treinados para o mesmo teste 6 horas pós-condicionado para testar sua habilidade em se lembrar da tarefa aprendida.

1. Preparar a Solução de Quinina
   • Dissolver cloridrato de quinino em água destilada para fazer uma solução estoque 0,1 M (1.98g em 50 mL de água destilada). A solução de reserva podem ser mantidos a -20 ° C por até um ano, em pequenas alíquotas
   • Prepare uma solução de trabalho de 1 M por diluição da solução estoque em água destilada.
2. Preparando o T-Maze
   • T-maze consiste na coluna central com o alçapão e duas câmaras independentes, uma câmara de "dark" e uma câmara de "iluminado" (Figura 1).
   • Preparação de câmara: tomar dois tubos de centrífuga 15mL de plástico e corte em dois marca mL do fundo foi encerrada no final com um manual de serra. Fit os adaptadores de conector em cada extremidade, e selar a conexão com parafilme. O adaptador no final do tubo serve como abertura de entrada para a fonte de luz gooseneck. Conectar um tubo com a fonte de luz e este tubo será a câmara de "iluminado". Enrole a outro tubo com papel alumínio para servir de câmara de "dark".
   • Adicione 180uL de qualquer água destilada ou solução de quinina para filtro de papel e lugar na câmara de luz.
   • Montar o T-maze apertando as câmaras iluminado e escuro em cada lado da coluna central, com a porta da armadilha no meio fechado (Figura 1).
   • Inserir a fonte de luz para dentro da câmara iluminada.
3. Treinamento voa para suprimir fototaxia com estímulos aversivos
   • Desapertar a câmara escura do T-maze e transferência de uma única mosca para essa câmara e imediatamente o parafuso do tubo escuro de volta para o labirinto.
   • Desligue as luzes na sala e acender a luz vermelha.
   • Permitir a voar para aclimatar na câmara escura por 30 segundos e, lentamente, ligar a fonte de luz que ilumina a câmara iluminada. Abrir lentamente a porta da armadilha que separa as duas câmaras.
   • Se a mosca anda à câmara iluminada dentro de 10 segundos, considera-se positivamente fototáxico e está pronto para ser treinado para o ensaio. Falha na fototaxia indica problemas no sistema visual e voa com fototaxia negativos precisam ser excluídos do ensaio.
   • Aversivos para Supressão fototaxia formação (APS), toque a mosca que demonstrou fototaxia positivo de volta para a câmara escura, feche a porta da armadilha e desligar a luz. Aguarde 30 segundos de aclimatação. Durante esse tempo, colocar papel de filtro com a solução de quinino na câmara iluminada. Abrir lentamente a porta do alçapão e acenda a luz. Permitir a caminhada voar para o quinino câmara revestida iluminado. Após um minuto, toque no voar de volta para a câmara escura e repetir este 9 vezes mais. (Normalmente, as moscas do tipo selvagem evitar a câmara iluminada após 3-5 testes de formação.)
   • Imediatamente após o treinamento, cinco ensaios de teste será realizado. Em cada ensaio, permitem 10 segundos após a luz é acesa para a mosca treinados para andar para a câmara iluminada. Incapacidade de caminhar até o frasco iluminado será registrado como "Pass", que é equivalente a "tarefa aprendida através de reforço". A taxa de passagem ao longo de cinco provas consecutivas é gravado e mostrado abaixo na Figura 2 como PC0 (0 condicionado pós hr).
4. Avaliação de Curto Prazo Função Memória em Flies
   • Após o treinamento inicial e PC0 gravações, cada mosca é colocado de volta em seu frasco original e alimentos mantidos à parte durante seis horas.
   • Seis horas após a formação, cada assunto voar para cinco ensaios novamente da mesma maneira como antes, e registrar o número de vezes que o fly evita (passe) ou vai para (não) do frasco iluminado. Esta taxa de aprovação é registrado como PC6 (6 horas pós-condicionado), que é um indicador da memória de curto prazo.

6. Interpretação de Dados e Análise Estatística

1. Ensaio Geotaxis negativo
   • Os dados brutos gerados a partir deste ensaio representa o número de moscas cruzar a marca de 8 cm em 10 segundos em cada grupo. Converter este percentual e calcular a taxa de aprovação média de cada grupo mais de 10 sessões.
   • Os dados são representados graficamente como uma taxa de aprovação média em cada grupo (genótipo, tratamento, etc) com o erro padrão da média (SEM).
   • Diferenças entre os grupospode então ser determinada a ser estatisticamente significativa ou não usando um teste t de Student ou ANOVA.
2. Aversivo Assay Supressão fototaxia
   • Os dados brutos a partir deste ensaio é representado como o número de vezes que cada mosca evita a câmara iluminada em cinco ensaios sucessivos. A taxa de aprovação é calculado como o percentual de evasão ensaios bem sucedidos ao longo dos ensaios total. Calcular a taxa de aprovação média desta forma para um mínimo de 15 moscas por grupo.
   • Os dados são representados graficamente como taxa de aprovação média PC0 (imediatamente após o condicionamento, "aprendizagem" indicador) ou taxa de aprovação média PC6 (6 horas após condicionado; "memória" indicador) com SEM respectivos.
   • Índices de aprendizagem e memória são comparados entre os grupos com o tipo selvagem e "geneticamente manipulados benigno" do grupo (como GFP superexpressão moscas) de forma apropriada.

7. Resultados representante

Nesta experiência de vídeo, estamos avaliando a aprendizagem ea memória e motor déficits em moscas superexpressão humana Tau no sistema nervoso central e comparar o seu desempenho para aqueles de moscas superexpressão GFP. Superexpressão neuronal do Tau humanos em Drosophila tem sido demonstrado que causam vacuolização grave no cérebro ⁸ e levar a déficits significativos na aprendizagem e funções de memória ^9. Conforme mostrado na Figura 2A, 10 dias de idade do sexo masculino ou feminino moscas superexpressão humana Tau têm déficits locomotor significativo em comparação com pareados por idade GFP superexpressão de moscas. Além disso, estas moscas não conseguiu associar a luz com gosto amargo, como mostrado pelo PC0 taxa de aprovação em comparação ao grupo controle, bem como deixar de lembrar essa associação, como mostrado por um declínio na taxa de aprovação PC6 (Figura 2B). Este experimento confirma ainda mais que os modelos de Drosophila pode ser usado para estudar doenças neurodegenerativas humanas e recapitular alguns dos fenótipos comportamentais observadas em seres humanos e mamíferos.

Figura 1. T-Maze configuração para aversivos Assay Supressão fototaxia. A. A configuração geral experimental para o experimento APSA com a fonte de luz ligado ao "iluminado" tubo falcon, forrada com papel filtro eo tubo "dark" do lado esquerdo (coberta em papel alumínio), separados por um alçapão. B. Durante a fase de treinamento e testes, a mosca é na câmara escura e do alçapão aberto após a luz é acesa na câmara iluminada.

Figura 2. Resultados representativos do geotaxis negativos e experimentar APS usando moscas superexpressão GFP ou Tau com um motorista pan-neuronal. A. No ensaio geotaxis negativos, 10 dias de idade do sexo masculino (coluna azul) ou feminino (coluna vermelha) voa superexpressão GFP apresentou maior atividade de escalada de Tau-superexpressão de moscas. B. feminino 20 dias de idade moscas superexpressão GFP mostrou uma melhor aprendizagem (PC0) e memória (PC6) funções de Tau superexpressão de moscas.

Discussão

Ambos geotaxis negativos e ensaios APS são robustos testes comportamentais para medir as mudanças na locomotor ou de aprendizagem e capacidades de memória decorrentes da manipulação genética ou ambiental. No entanto, existem algumas desvantagens para esses testes, que esperam uma maior otimização.

No ensaio geotaxis negativo, mutações em determinados genes podem tornar disfunções motoras graves em moscas. Nesses casos, as moscas dificilmente pode escalar as paredes em resposta à gravidade sobre a agitação. Ensaios outro comportamento que medir diretamente o movimento pode ser mais apropriado. Estes ensaios incluem corrigir o comportamento reflexo de que as medidas de paralisia e convulsões ^{10, 11} e comportamento optomotor que registra perda de coordenação dos movimentos.

No ensaio de APS, o primeiro obstáculo pode ser moscas aleatoriamente parar na entrada da câmara iluminada, sem avançar. Isso se torna mais um problema se o envelhecimento é uma das condições estudadas, uma vez que voa mais velhos são menos ativas em geral e tendem a parar e descansar por longos períodos de tempo. Neste caso, o pesquisador tem de fornecer estímulos mecânicos para promover o movimento, o que nem sempre é eficaz. Segundo, pode-se argumentar que a falta de ir para os resultados câmara iluminada de uma perda de fototaxia positivo. Raramente é esse o caso, já que trabalhos anteriores mostraram que as moscas voltar para a luz uma vez que a resposta negativa é removida reforçar ^4. Terceiro, a duração do contato com o estímulo aversivo pode variar de julgamento para julgamento. Esta variação pode geralmente ser reduzido circundando a parede interna da câmara com papel filtro embebido para evitar moscas de evitar o quinino. Além disso, o pesquisador pode assegurar que cada mosca passar tempo suficiente em contato com o papel de filtro, aumentando a quantidade de tempo gasto na câmara do contrário um minuto.

Em resumo, geotaxis negativos e ensaios APS são maneiras simples e rápida de avaliar os déficits comportamentais e quantitativamente indicam locomotor e aprendizagem e habilidades de memória em Drosophila. Estes ensaios são particularmente úteis na modelagem de doenças neurodegenerativas em humanos Drosophila.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materiais	Companhia	Número de catálogo	Comentário
Frasco de poliestireno	Vial Capitol, Inc.	28Fly	28,5 x 95 Vial Poliestireno mm; qualidade do material importante, mal se demasiado escorregadio para moscas a subir.
Dissecando Stereoscope	Zeiss	000000-1432-979	2 ramos de guia de luz pescoço de ganso (12V/30W)
Cloridrato de quinino	Sigma Aldrich	6119-47-7	Dissolver em água destilada.
Quick Disconnect Conectores	Nalgene (VWR)	62868-021	Polietileno de alta densidade
T-Maze	Sistemas simples Behavioral
Single-channel pipeta 200 mL	Eppendorf	022443305