הכרומטין Assay immunoprecipitation עבור גנים ספציפיים רקמות באמצעות שלבים מוקדמים של עוברי עכברים

Summary

אנו מדגימים immunoprecipitation הכרומטין (שבב) שיטה לזהות אינטראקציות גורם ספציפי על רקמות גנים במהלך או לאחר הופעת ביטוי גנים ברקמות ספציפיות ברקמות עובריים בעכבר. פרוטוקול זה צריך להיות רלוונטי נרחב לחקר ההפעלה רקמות ספציפיות גן כפי שהיא מתרחשת במהלך ההתפתחות העוברית נורמלי.

Abstract

הכרומטין immunoprecipitation (שבב) הוא כלי רב עוצמה כדי לזהות חלבונים: אינטראקציות הכרומטין המתרחשים בהקשר של תאים חיים ^1-3. טכניקה זו נוצלה נרחב תאים בתרבית רקמה, ובמידה פחותה ברקמות העיקרי. היישום של שבב לרקמות מכרסם עובריים, במיוחד בזמנים המוקדמים של הפיתוח, הוא מסובך ידי כמות מוגבלת של רקמות ואת ההטרוגניות של התא סוגי רקמות בעובר. כאן אנו מציגים שיטה לבצע באמצעות שבב ביום עובריים ניתק 8.5 (E8.5) העובר. הכרומטין גזוז מעובר אחד E8.5 ניתן לחלק עד חמישה aliquots, המאפשר החוקר חומר מספיק בקרות לחקירה של חלבון מסוים: אינטראקציות הכרומטין.

יש לנו שימוש בטכניקה זו כדי להתחיל לתעד חלבון: אינטראקציות הכרומטין במהלך המפרט של רקמות ספציפיות תוכניות ביטוי גנים. ההטרוגניות של סוגי תאים בעובר בהכרח מגביל את היישום של טכניקה זו, כי התוצאה היא גילוי של חלבון: אינטראקציות הכרומטין בלי להבחין אם האינטראקציות מתרחשות כל, קבוצת משנה של, או סוג תא בודד (ים). עם זאת, בדיקה של רקמות ספציפיות גנים במהלך או לאחר תחילת ביטוי גנים ברקמות ספציפיות אינו ריאלי משתי סיבות. ראשית, immunoprecipitation גורמים רקמות ספציפיות בהכרח מבודד הכרומטין מסוג התא שבו הגורם המתבטא. שנית, immunoprecipitation של coactivators ו ההיסטונים המכיל שלאחר translational שהשינויים הקשורים להפעלת הגן צריך רק למצוא את הגנים רצפים רגולטוריים הגן בסוג התא שבו הגן הוא להיות או הופעל. הטכניקה צריכה להיות ישימה המחקר של רוב רקמות ספציפיות הפעלת גן אירועים.

בדוגמה להלן, השתמשנו E8.5 E9.5 ואת עוברי עכבר לבחון גורם מחייב את מקדם שרירי השלד גן ספציפי. Somites, שהן רקמות מבשר שממנו שרירי השלד של המטען והגפיים יהוו, נוכחים E8.5 ^9.5-4.5. Myogenin הוא גורם הרגולציה הנדרשים בידול שרירי השלד ^6-9. הנתונים מראים כי myogenin קשורה האמרגן משלה E8.5 E9.5 ועוברים. מכיוון myogenin מתבטאת רק somites בשלב זה של התפתחות ^6,10, הנתונים מצביעים על כך myogenin אינטראקציות עם האמרגן שלה התרחשו כבר מבשר לתאי שריר השלד ב E8.5 עוברים.

Protocol

1. בידוד של עוברים

הערה: כל הפעולות הקשורות עכברים צריכה להתבצע בהתאם לטיפול בבעלי חיים מתאימים מדיניות שימוש ופרוטוקולים

1. בדוק נוכחות של תקע ההזדווגות בעכבר הנשי בבוקר לאחר ההזדווגות נפרדים הנקבות הזדווגו מן הזכרים הרבעה ידי הצבת אותם בכלוב אחר. בצהרי היום כי התוספת ההזדווגות הוא ציין נחשב יום עובריים 0.5 (E0.5) של פיתוח.
2. בשלב E8.5, (או השלב הרצוי, אם שונה), להקריב את העכבר באמצעות פרוטוקול שאושר.
3. להרטיב את הבטן של החיה מורדמים עם אתנול 70% ולפתוח את חלל הבטן. אתרי ההשתלה המציין את נוכחותם של עוברי בפיתוח נתפסים "חרוזים על חוט" הסדר לאורך כל קרן הרחם (איור 1A). באמצעות מספריים, יש להסיר גם את הקרניים הרחם, לחתוך כל אתר בנפרד כדי להפריד ההשתלה (איור 1B) ומכניסים אותם צלחת פטרי המכילה 100 מ"מ בטמפרטורת החדר (RT) דיסקציה בינוני (DMEM, 10% בסרום שור עוברית, 20 mM HEPES pH 7.4 , 60 מיקרוגרם / מ"ל ​​לפניצילין, סטרפטומיצין 2 mM).
4. בעזרת מלקחיים, להסיר כל העובר ואת הקרומים המקיפים מרקמת הרחם (תרשים 1C) ולמקם אותם במדיום לנתיחה טריים.
5. לבודד את העוברים בודדים תחת מיקרוסקופ לנתח באמצעות מלקחיים. בשלב זה בפיתוח, העוברים מוקפים הקודקודית שק חלמון, אשר קשר את רקמת deciduum, שק החלמון הקרביים ואת amnion. Amnion היא קרום שקוף כי הוא בקשר ישיר עם העובר. שק החלמון הקרביים ממוקם בין amnion ואת שק החלמון ואת הקודקודית נבדל בקלות על ידי נוכחות של כלי הדם הבולטים לטפח את העובר ב-E8.5 E9.5 עוברים. הסר כל העובר מן הקרומים המקיפים שלה ולהעביר בנפרד לתוך צלחת חדשה המכילה התקשורת לנתיחה כדי להסיר דם עודף. השלב ההתפתחותי יכול להשתנות מעובר לעובר בין המלטות; נציג E8.5 עוברים עובר E9.5 נציג מוצגים 1D איור.
6. העברת כל העובר על צינור 1.5 Eppendorf מ"ל המכיל 200 μl של התקשורת דיסקציה (המתואר בשלב 4 לעיל).

2. Homogenization העובר מבודדת

1. הוספת 20 יחידות של collagenase מסוג II בנפח של ul 200 (בדילול מלא פוספט 1X של Dubbecco שנאגרו מלוחים; DPBS) על צינור אחד Eppendorf.
2. נערו בעדינות דגימות 37 ° C שייקר בסל"ד 100 עבור 20 דקות.
3. Resuspend היטב על ידי pipetting לשבש גושים של תאים.
4. החל את ההשעיה על התא העליון של מסננת תא סטרילי (40 רשת בגודל מיקרומטר) הניח על צינור Eppendorf 1.5 מ"ל.
5. מיד להחיל 600 μl של בטמפרטורת החדר 1X DPBS על גבי מסננת התא כדי להשלים את ההפרדה. בטל מסננת.
6. צנטריפוגה דגימות 4 ° C XG ב 4000 עבור 5 דקות.
7. בטל supernatant.
8. Resuspend גלולה ב 1 מ"ל של DPBS RT 1X.
9. צנטריפוגה דגימות XG ב 4000 דקות 1 ב RT.
10. בטל supernatant.
11. Resuspend גלולה ב 200 μl של התקשורת RT לנתיחה.
12. ספירת תאים עובריים. קיים העובר הממוצע 3-5 x 10 ⁶ cells/E8.5.

3. חוצה קישור הכרומטין

1. הוספת 5.6 μl של פורמלדהיד 37% ל 200 דגימות μl ריכוז סופי של פורמלדהיד 1%.
2. דגירה דגימות עבור 10 דקות ב RT.
3. צנטריפוגה דגימות ב 4 ° C XG ב 4000 דקות 3.
4. בטל supernatant.
5. Resuspend התאים עם 1X DPBS קר המכיל 80 μl / מעכב פרוטאז מ"ל קוקטייל (PIC).
6. צנטריפוגה דגימות 4 ° C XG ב 4000 דקות 3.
7. בטל supernatant. בשלב זה, את הדוגמאות אפשר להקפיא ב -80 ° C. קפוא, דגימות crosslinked יציבים במשך כמה חודשים.

4. Sonication

1. Resuspend התא גלולה ב 100 μl של RT SDS תמוגה חיץ (50 mM טריס-HCl (pH 8.1), 10 mM EDTA ו - 1% SDS עם PIC הוסיף טרי בווליום 1 PIC/800 μl סך μl). כאשר resuspended, להוסיף ul נוסף של 100 חיץ תמוגה SDS RT לקדם resuspension. מערבבים היטב על ידי pipetting ו ההיפוך.
2. לדגור על השעיית התא על קרח דק '10.
3. Sonicate תאים lysed ל-DNA גזירה על בין 200 ל 500 basepairs באמצעות Bioruptor Diagenode ™ UCD200 (5 דק 'x 8 פעמים: הגדרה משרעת של 30 שניות on/30 שניות הנחה על כוח (320 וואט) גבוהה). דגימות צריך להיות מוקף slurry קרח. אין לאפשר דגימות כדי לחמם מעל 4 מעלות צלזיוס או להקפיא. ישנם סוגים רבים של sonicators זמין. התנאים Sonication צריך להיות מותאם לכל sonicator לגרום הגז של ה-DNA צולבים לאורך של כ -500 נ"ב.
4. צנטריפוגה דגימות sonicated ב 4 ° C על XG 14,000 עבור 10 דקות.
5. Transfer supernatant לתוך צינור Eppendorf טרי מקורר מראש על הקרח.
6. מחלקים את המדגם sonicated לתוך למקסימום של 5 aliquots. יש לנו נקבעים אמפירית כי אחד E8.5 העובר ניתן לחלק 5 aliquots. גודל מדגם קטן או גדול וניתן לשנותם בהתאם. בשלב זה, המדגם יכול להיות מאוחסן ב -80 ° C עד לשימוש נוסף.
7. שמורת one aliquot לשימוש כקלט ולאחסן ב -20 ° C עד שלב 6 כאשר חוצה קישורים יהיה הפוך. לדלל את aliquots אחרים של פי 10 במאגר דילול שבב (16.7 mM טריס-HCl (pH 8.1), 1.2 mM EDTA, 1.1% Triton X-100, 167 mM NaCl ו SDS 0.01%) המכיל PIC הוסיף טרי ב 1 μl/800 μl חיץ.

5. טרום סליקה immunoprecipitation

1. טרום לנקות את supernatant מדולל עם 75 μl של ה-DNA סלמון, הזרע / או חלבון G slurry agarose-50% ב 4 ° C, עם רוטציה, במשך שעה 1. שימוש או חלבון או חלבון G חרוזים צריך להיקבע על ידי הנוגדן לשמש השבב. לדוגמה, חרוזים חלבון מומלץ נוגדנים ארנב, ואילו חלבון G חרוזים מומלץ נוגדנים עזים או עכבר נוגדנים IgG _1. לקבלת מידע מפורט יותר, לראות את המלצות היצרן חרוז.
2. צנטריפוגה ב 4 ° C XG ב 2500 דקות 1.
3. מעבירים את supernatant אל צינור חדש, Eppendorf מראש מקורר.
4. הוסף נוגדן (4 מיקרוגרם / לדוגמה) כדי aliquot מראש פינה ועל דגירה לילה בשעה 4 ° C עם רוטציה.

6. כביסה מתחם הכרומטין לחלבון-חרוז

1. הוסף 60 μl של זרע סלמון DNA / או חלבון G agarose slurry לתוך בקבוקון כל דגירה על 4 מעלות עם סיבוב 1 שעה. השתמש בסוג חרוז זהה המשמשים מראש ניקוי בשלב 3 לעיל.
2. צנטריפוגה ב 4 ° C XG ב 1000 דקות 1.
3. הסר בזהירות את supernatant וזורקים. שמור את ה-DNA מורכב חלבון חרוז על הקרח.
4. Resuspend לשטוף את הכדור כמצוין להלן עם מאגרים לשטוף 1, 2, 3 ו 4. לשטוף מאגרים 1-3 צריך להיות צונן עד 4 ° C ושוטף עם מאגרים אלה צריכה להתבצע על 4 ° C. לשטוף חיץ 4 צריך להיות בטמפרטורת החדר שוטף עם חוצץ זה צריך להתבצע בטמפרטורת החדר. לשטוף כל 5 דקות עם סיבוב בטמפרטורה המתאימה. בעקבות צנטריפוגות כל לשטוף, ב 4 מעלות צלזיוס (טמפרטורת החדר עבור חיץ לשטוף 4 שוטף) בשעה XG 1000 דקות 1, אז בזהירות לשאוב או להסיר את supernatant.

הצפת 1: מלח נמוכה לשטוף חיץ (20 mM טריס-HCl (pH 8.1), 2 mM EDTA, טריטון 1% X-100,
150 mM NaCl ו - SDS 0.1%), 1 מ"ל x 2 שוטף.
חוצץ 2: מלח גבוהה לשטוף חיץ (20 mM טריס-HCl (pH 8.1), 2 mM EDTA, 1% Triton X-100,
500 mM NaCl ו - SDS 0.1%), 1 מ"ל x 2 שוטף.
חוצץ 3: לשטוף LiCl מלח חיץ (10 mM טריס-HCl (pH 8.1), 1 mM EDTA, 1% IGEPAL-CA630,
0.25 מ LiCl וחומצה deoxycholic 1% (מלח נתרן)), 1 x 1 מ"ל לשטוף.
מאגר 4: TE חיץ (10 mM טריס-HCl (pH 8.1), 1 mM EDTA), 1 מ"ל x 2 שוטף.

7. Elution של קומפלקס הכרומטין-הנוגדן

1. Resuspend המורכב שטף הכרומטין לחלבון-חרוז μl 250 של חיץ טרי elution מוכן (1% SDS, 0.1 מ 'NaHCO _3). בתוקף המערבולת מדגם במשך 5 שניות, דגירה אז במשך 15 דקות עם סיבוב ב RT.
2. צנטריפוגה XG ב 2500 דקות 1 ב RT ולהעביר את eluate לתוך צינור חדש Eppendorf.
3. חזור על שלבים 1 ו 2 ו לשלב את eluates בצינור Eppendorf אותו. Eluates יש לשמור בטמפרטורת החדר. עם השלמת שלב זה, eluates ניתן לאחסן -20 ° C עד לשימוש נוסף.

8. הפוך חוצה הקישור שחזר DNA

1. הוסף 20 μl 5 M NaCl עבור eluate 500 μl (40 μl / ml שליטה קלט).
2. מחממים את eluates על 65 מעלות צלזיוס באמבט מים במשך שעה 4 עד לילה.
3. 10 μl של כל דגימה (כולל בקרת קלט) ניתן להריץ על ג'ל agarose 2% לצד סמנים גודל פורש 0.1-1 kbp כדי לבדוק את גודל שבר דנ"א. ה-DNA יופיע ככתם ולא להקה חדה. שאר הדגימות ניתן שמאלה 65 מעלות צלזיוס בזמן הג'ל פועל.
4. לשחזר את ה-DNA מכל מדגם באמצעות ג'ל QIAquick הפקת Kit (Qiagen). הוסף חוצץ QG 600 μl (מסופק בערכה) כדי לייעל את ה-DNA ספיחה עם קרום סיליקה בעמודה ספין QIAquick ו 200 μl isopropanol לתוך מדגם 500 μl. שים לב חיץ QG מכיל אינדיקטור pH המאפשר קביעת קל של ה-pH של המדגם. אם צבע של המדגם הופך מצהוב סגול (pH> 7.5) לאחר ערבוב, להוסיף 10 μl של NaAcetate M 3 (pH 5.2) המדגם ומערבבים. פעולה זו מפחיתה את ה-pH של התערובת על מנת למקסם את ה-DNA מחייבת את החרוזים בעמודה.
5. לפני טעינת עמוד, לבדוק את התערובת כדי לקבוע אם כל המשקע SDS הוא ההווה. אם SDS משקעים התרחש, במדגם יש לחמם ב42 ° C אמבט מים עד המשקע נעלם.
6. טען 700 μl של התערובת לתוך עמוד ספין QIAquick (טור סגול בערכה) ו צנטריפוגות ב RT ב XG 14000 דקות 1. מחק את הזרימה דרך מהעמודה לפני שתמשיך וחזור על שלב זה עם שאר המדגם.
7. הוסף 500 μl חיץ QG לשטוף את העמודה. צנטריפוגה ב RT ב XG 14000 דקות 2. מחק את הזרימה דרך מהעמודה לפני שתמשיך.
8. לשטוף את העמודה עם 700 μl של PE לשטוף חיץ (מסופק בערכה) אשר אתנול נוספה כפי שהורה על ידי היצרן. צנטריפוגה ב RT ב XG 14000 דקות 1. מחק את הזרימה דרך מהעמודה לפני שתמשיך.
9. חזור על השלב צנטריפוגה להסיר לחלוטין את שארית למאגר PE מהעמודה. מחק את הזרימה דרך צינור איסוף.
10. Elute DNA מהעמודה לתוך צינור Eppendorf טרי ידי הוספת 60 μl חיץ EB (חיץ elution מסופק בערכה).
11. צנטריפוגה בטמפרטורת החדר בבית XG 14000 דקות 1. הדנ"א eluted ניתן לאחסן -20 ° C עד לגילוי. ₂₆₀ קריאות של החומר התאושש בדרך כלל מצביעים על ריכוזים של 90-120 ng / ul, החלמה הכולל של UG 6-7 ~ לכל aliquot. עם זאת, _260/280 יחס של דגימות אלה הוא בדרך כלל> 1.8, מה שמראה כי קיים RNA במדגם. לפיכך, הסכום המדויק של ה-DNA התאושש עשוי להיות נמוך יותר.

9. ניתוח ה-DNA ששוחזרו

1. SDS יכול להפריע לפעילות של פולימראז תקי PCR. SDS יש להסיר לחלוטין לפני ביצוע PCR. דגירה ה-DNA על הקרח כדי לזרז כל SDS שיורית ו צנטריפוגות ב 4 ° C על XG 14000 דקות 1. מעבירים את supernatant כדי צעד חדש tube.This Eppendorf מומלץ מאוד.
2. Eluates ה-DNA ניתן לאתר באמצעות PCR קונבנציונאלי או כמותי בזמן אמת PCR (Q-PCR) עם פריימרים ספציפיים עבור כל רצף להיות מנותח. Μl 50-10 מ eluate DNA הכולל עשוי לשמש אחד PCR או ש-PCR התגובה. PCR עם שליטה הקלט יכול להתבצע עם דילול פי 5-10 של ה-DNA, בהשוואה לסכום של דגימות אחרות. PCR ו-Q-PCR התנאים ישתנו, לעומת זאת, כמות מוגבלת של חומר המוצא דורש נוספים מחזורי PCR. לגילוי PCR קונבנציונאלי, אנו ממליצים להתחיל עם 40 מחזורים והתאמת כנדרש.

10. נציג תוצאות

השתמשנו בפרוטוקול זה לבצע CHIP משני E8.5 E9.5 ועוברים (איור 2). התוצאות מראות כי קיים myogenin על האמרגן myogenin ב E8.5 E9.5 ועוברים. CHIP DNAs מטוהרים נותחו על ידי ה-PCR קונבנציונאלי (איור 2 א) ועל ידי כמותי בזמן אמת PCR (תרשים 2B). לעומת זאת, אין אינדיקציה myogenin מחייב האמרגן myogenin את שק החלמון, שם myogenin לא בא לידי ביטוי. אינטרפרון-γ (IFNγ) האמרגן, אשר מכיל רצפים התאמת האתר מחייב myogenin, שימש לשלוט רצף שלילי. כצפוי, myogenin לא היה מחויב האמרגן IFNγ בכל אחד דגימות רקמה נבדק. ב E8.5 ו 9.5 עוברים, myogenin באה לידי ביטוי במיוחד ב somites (איור 3: ^6,10), אשר הם מקדימים שרירי השלד. לפיכך התוצאות מצביעות על כך myogenin חייב האמרגן myogenin ב somites ב E8.5 E9.5 ו.

באיור 1. E8.5 לנתיחה העובר. (א) קרן מבודד הרחם (הפאנל העליון; הגדלה גבוהה המוצג בלוח התחתון). (ב) הרחם קרן לגזור במספריים כדי להפריד בין אתרי ההשתלה בודדים המכיל עוברי אדם. (ג) עוברים בולטות מרקמת הרחם במהלך הניתוח. חצים סימן עוברי עדיין מכוסים ברקמה חוץ עובריים. (ד) שני E8.5 עוברים מן החול את אותו הדבר. העובר בצד שמאל לא החלה את תהליך הפיכת. העובר על הזכות עוברת מפנה. הימין הקיצוני - נציג העובר E9.5.

איור 2. CHIP assay הוכחת myogenin מחייב האמרגן myogenin ב E8.5 E9.5 ועוברים. (למעלה) ניתוח קונבנציונלי PCR של ul 5 של ה-DNA מטוהרים מניסויים CHIP באמצעות נוגדן myogenin או הלא ספציפית IgG בוצע primers כי להגביר חלק האמרגן myogenin מ -79 עד 69 יחסית לאתר תחילת שעתוק כי מכיל אתר קשירה myogenin הממוקם -12 או להגביר primers כי חלק האמרגן IFNγ המכיל רצף התאמת האתר מחייב myogenin ממוקם ~ 1075 bp במעלה הזרם של האתר ולהתחיל שעתוק. פריימר IFNγ רצפים היו בשימוש 5'-GCT GAC TCA AGA CCC CGA GGC-3 'ו 5'-TGA GGA TGG GGC AGG AGG CC-3 ". (התחתון) כמותי בזמן אמת PCR ניתוח של דגימות אותו בשימוש (A).הנתונים הם זממו כמו% של תשומה + / - סטיית התקן.

איור 3. Myogenin מתבטאת במיוחד ב somites של E8.5 E9.5 ועוברים. הר שלמים הכלאה באתרו של myogenin מראה ביטוי mRNA ספציפי somites. גודל הבר בתמונה E8.5 - 200 מיקרומטר. גודל הבר E9.5 תמונה - 500 מיקרומטר.

Discussion

בפרוטוקול CHIP שתואר, אנו מראים כי myogenin הרגולטור myogenic קשורה האמרגן myogenin ברקמת שריר השלד מבשר נוכח E8.5 E9.5 יחיד עוברים. מחקרים קודמים מאופיין בהרחבה myogenin מחייב תיבת דואר המכיל רצפים, החל הראשונית בניסויים במבחנה ג'ל משמרת שימוש ב-DNA במבחנה מתורגם או מיוצר bacteriall...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
ChIP Assay Kit	Upstate, Millipore	17-295
Collagenase Type II	Invitrogen	17101015	Dilution by 1 x PBS
Dulbecco’s modified eagle medium (DMEM)	GIBCO, by Life Technologies	12100-061	High glucose content
Dulbecco’s phosphate buffered saline 1X (DPBS)	GIBCO, by Life Technologies	14190-144	Calcium chloride free, Magnesium chloride free
Fetal bovine serum (FBS)	Mediatech, Inc.	35-010-CV
Gel extraction kit	QIAquick	28704	50 reaction kit
Penicillin/streptomycin stock solution	GIBCO, by Life Technologies		5000 μg/ml concentration
Protease Inhibitor Cocktail	Sigma-Aldrich	P8340
Salmon sperm DNA /Protein A agarose	EMD Millipore	16-157
myogenin antibody	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	sc-576
Normal rabbit IgG	EMD Millipore	12-370
Platinum PCR Supermix	Invitrogen	11306-016
GoTaq Q-PCR master mix	Promega Corp.	A6001