Saggio di immunoprecipitazione della cromatina per geni tessuto-specifici utilizzando nella fase iniziale di embrioni di topo

Riepilogo

Ci mostrano una immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) metodo per identificare interazioni tra fattori di geni tessuto-specifici durante o dopo l'insorgenza di tessuto-specifica dell'espressione genica nei tessuti embrionali di topo. Questo protocollo dovrebbe essere ampiamente applicabile per lo studio di tessuto-specifica l'attivazione del gene, come si verifica durante il normale sviluppo embrionale.

Abstract

Immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) è un potente strumento per identificare le proteine: interazioni della cromatina che avvengono nel contesto delle cellule viventi ^1-3. Questa tecnica è stata ampiamente sfruttato nelle cellule colture di tessuti, e in misura minore, nel tessuto primario. L'applicazione di ChIP al tessuto embrionale di roditori, soprattutto nei momenti iniziali dello sviluppo, è complicata dalla limitata quantità di tessuto e l'eterogeneità dei tipi di cellule e tessuti nell'embrione. Qui vi presentiamo un metodo per eseguire ChIP con una giornata dissociata embrionale 8,5 (E8.5) degli embrioni. Cromatina tosata da un unico embrione E8.5 possono essere suddivisi in fino a cinque aliquote, che permette di materiale sufficiente l'investigatore per i controlli e per lo studio di proteine ​​specifiche: le interazioni della cromatina.

Abbiamo utilizzato questa tecnica per iniziare a documentare proteine: interazioni della cromatina durante la specificazione dei programmi di geni tessuto-specifica espressione. L'eterogeneità dei tipi di cellule in un embrione limita necessariamente l'applicazione di questa tecnica perché il risultato è l'individuazione di proteine: interazioni della cromatina senza distinguere se le interazioni avvengono in tutto, un sottoinsieme di, o un tipo di cellula (s). Tuttavia, l'esame dei geni tessuto-specifici durante o dopo la comparsa di tessuto-specifica dell'espressione genica è fattibile per due motivi. In primo luogo, immunoprecipitazione di fattori specifici del tessuto isola necessariamente cromatina dal tipo di cellula in cui si esprime il fattore. In secondo luogo, immunoprecipitazione di coattivatori e istoni contenente modificazioni post-traduzionali che sono associati con l'attivazione del gene deve essere trovata solo a geni e sequenze regolatrici del tipo di cellula in cui il gene è o è stato attivato. La tecnica dovrebbe essere applicabile allo studio degli eventi più geni tessuto-specifici di attivazione.

Nell'esempio descritto di seguito, abbiamo utilizzato embrioni di topo E8.5 e E9.5 per esaminare fattore vincolante ad un muscolo scheletrico promotore del gene specifico. Somiti, che sono i tessuti precursore da cui i muscoli scheletrici del tronco e degli arti si formano, sono presenti E8.5-9.5 ^4,5. Myogenin è un fattore normativo necessario per la differenziazione del muscolo scheletrico ^6-9. I dati dimostrano che miogenina è associato proprio promotore di E8.5 e E9.5 embrioni. Perché miogenina è espresso solo in somiti in questa fase di sviluppo ^6,10, i dati indicano che le interazioni con miogenina proprio promotore si sono già verificati nelle cellule precursori del muscolo scheletrico in E8.5 embrioni.

Protocollo

1. Isolamento di embrioni

Nota: tutte le operazioni che coinvolgono i topi devono essere eseguite conformemente alla cura degli animali appropriati e politiche di utilizzo e protocolli

1. Verificare la presenza di una spina di accoppiamento nel topo femmina la mattina dopo l'accoppiamento e separare le femmine accoppiate dalla stalloni mettendoli in una gabbia diversa. Mezzogiorno del giorno che la spina di accoppiamento è osservato è considerato giorno embrionale 0,5 (E0.5) dello sviluppo.
2. A E8.5, (o la fase desiderata, se diversa), il sacrificio il mouse utilizzando un protocollo approvato.
3. Bagnare il ventre dell'animale eutanasia con il 70% di etanolo e aprire la cavità addominale. I siti di impianto che indica la presenza di embrioni di sviluppo sono viste come un "grani di un rosario" sistemazione lungo la lunghezza di ogni corno uterino (figura 1A). Utilizzando le forbici, rimuovere entrambi i corni uterini, tagliare ogni sito a separare l'impianto individualmente (Figura 1B) e metterli in un piatto da mm 100 petri contenenti temperatura ambiente (RT) dissezione medio (DMEM, 10% di siero fetale bovino, 20 mM pH 7,4 HEPES , 60 mg / ml di penicillina, 2 mM streptomicina).
4. Utilizzando pinze, rimuovere ogni embrione e membrane che circondano dal tessuto uterino (figura 1C) e metterli in media dissezione fresco.
5. Isolare gli embrioni individuale sotto un microscopio da dissezione con pinze. In questa fase di sviluppo, gli embrioni sono circondati dalla parietale sacco vitellino, che contatti il ​​tessuto deciduum, il viscerale sacco vitellino e il sacco amniotico. L'amnios è una membrana trasparente che è in diretto contatto con l'embrione. Il viscerale sacco vitellino si trova tra l'amnios e il sacco vitellino parietale ed è facilmente distinguibili in E8.5-E9.5 embrioni per la presenza di vasi sanguigni importanti che alimentano l'embrione. Rimuovere ciascun embrione dalla sua membrane che circondano e trasferire singolarmente in una nuova piastra contenente i media dissezione per rimuovere il sangue in eccesso. La fase di sviluppo può variare da embrione a dell'embrione e tra cucciolate; rappresentante E8.5 embrioni e un embrione rappresentante E9.5 sono mostrati in Figura 1D.
6. Trasferimento di ogni embrione in una provetta eppendorf da 1,5 ml contenente 200 ml di dissezione dei media (come descritto al punto 4).

2. Omogeneizzazione dei Embryo isolati

1. Aggiungere 20 unità di Collagenasi di tipo II in un volume di 200 ul (diluito in fosfato 1X Dubbecco di Buffered Saline; DPBS) ad ogni provetta Eppendorf.
2. Scuotere campioni a 37 ° C shaker a 100 rpm per 20 min.
3. Risospendere bene pipettando di interrompere grumi di cellule.
4. Applicare la sospensione cellulare sulla parte superiore della cella di filtro sterile (40 maglie micron) posto sopra un tubo eppendorf da 1,5 ml.
5. Applicare immediatamente 600 ml di temperatura ambiente 1X DPBS sulla parte superiore della cella di filtro per completare la separazione. Gettare il filtro.
6. Centrifugare i campioni a 4 ° C a 4000 xg per 5 min.
7. Scartare il surnatante.
8. Risospendere il pellet in 1 ml di RT DPBS 1X.
9. Centrifugare i campioni a 4000 xg per 1 minuto a temperatura ambiente.
10. Scartare il surnatante.
11. Risospendere il pellet in 200 ml di mezzi dissezione RT.
12. Contare le cellule embrionali. C'è una media 3-5 x 10 ⁶ cells/E8.5 embrione.

3. Cross-link cromatina

1. Aggiungere 5,6 ml di formaldeide al 37% al 200 campioni microlitri per una concentrazione finale di 1% di formaldeide.
2. Incubare i campioni per 10 minuti a temperatura ambiente.
3. Centrifugare i campioni a 4 ° C a 4000 xg per 3 min.
4. Scartare il surnatante.
5. Risospendere le cellule con il freddo 1X DPBS contenente 80 microlitri / ml di cocktail di inibitori della proteasi (PIC).
6. Centrifugare i campioni a 4 ° C a 4000 xg per 3 min.
7. Scartare il surnatante. A questo punto, i campioni possono essere congelati a -80 ° C. Il congelati, i campioni reticolati sono stabili per diversi mesi.

4. Sonicazione

1. Risospendere il pellet di cellule in 100 ml di buffer di lisi RT SDS (50 mM Tris-HCl (pH 8.1), 10 mM EDTA e 1% SDS con PIC appena aggiunto 1 ml PIC/800 microlitri di volume totale). Quando risospeso, aggiungere ulteriori 100 ul di tampone RT lisi SDS per promuovere la risospensione. Mescolare bene pipettando e inversione.
2. Incubare la sospensione cellulare in ghiaccio per 10 min.
3. Sonicare cellule lisate al DNA di taglio compreso tra 200 e 500 paia di basi con un Bioruptor Diagenode ™ UCD200 (5 min x 8 volte: impostazione di ampiezza di 30 sec on/30 sec off in alto (320 watt) di potenza). I campioni devono essere circondato da un impasto di ghiaccio. Non lasciare che i campioni di caldo sopra i 4 ° C o congelare. Ci sono molti tipi di sonicatori disponibili. Condizioni di sonicazione deve essere ottimizzata per ogni sonicatore comportare taglio del reticolato del DNA per una lunghezza di circa 500 bp.
4. Centrifugare i campioni sonicato a 4 ° C a 14000 xg per 10 min.
5. Transfer il supernatante in una nuova provetta eppendorf pre-raffreddata in ghiaccio.
6. Suddividere il campione sonicato in un massimo di 5 aliquote. Abbiamo empiricamente determinato che si E8.5 embrione può essere suddiviso in 5 aliquote. Campioni di dimensioni più piccole o più grandi possono essere ripartita in proporzione. A questo punto, il campione può essere conservato a -80 ° C fino all'utilizzo ulteriormente.
7. Riservare una aliquota per l'utilizzo come input e conservare a -20 ° C fino al punto 6, quando il cross-link sarà invertito. Diluire le aliquote altre 10 volte in tampone di diluizione ChIP (16,7 mM Tris-HCl (pH 8,1), 1,2 mM EDTA, 1.1% Triton X-100, 167 mM NaCl e 0,01% SDS) contenente PIC appena aggiunta a 1 μl/800 microlitri di buffer.

5. Pre-clearing e Immunoprecipitazione

1. Pre-clear il surnatante diluito con 75 ml di sperma di salmone-DNA / proteina A o G liquami agarosio-50% a 4 ° C, con rotazione, per 1 ora. L'uso di proteine ​​sia A o perline G proteine ​​deve essere determinato dal anticorpi da utilizzare per il chip. Per esempio, la proteina A perline sono raccomandati per gli anticorpi di coniglio, mentre le proteine ​​G perle sono raccomandati per gli anticorpi di capra o il mouse anticorpi IgG _1. Per informazioni più dettagliate, vedere le raccomandazioni formulate dal produttore tallone.
2. Centrifugare a 4 ° C a 2500 xg per 1 min.
3. Trasferire il supernatante in una nuova, pre-raffreddata provetta Eppendorf.
4. Aggiungi anticorpi (4 mg / campione) per la pre-cancellati aliquota e incubare una notte a 4 ° C con rotazione.

6. Lavaggio della cromatina-proteina-tallone Complex

1. Aggiungere 60 ml di sperma di salmone DNA / proteina A o G agarosio liquame in ciascuna provetta ed incubare a 4 ° C con rotazione per 1 ora. Utilizzare lo stesso tipo perlina utilizzato per il pre-clearing al punto 3.
2. Centrifugare a 4 ° C a 1000 xg per 1 min.
3. Rimuovere con cura il supernatante ed eliminarlo. Tenere il DNA-proteina-tallone complesso sul ghiaccio.
4. Risospendere e lavare il pellet come indicato di seguito con tamponi di lavaggio 1, 2, 3 e 4. Lavare 1-3 buffer, vengono refrigerate a 4 ° C e si lava con questi tamponi devono essere eseguiti a 4 ° C. Tampone di lavaggio 4 dovrebbe essere a temperatura ambiente e si lava con questo buffer deve essere eseguita a temperatura ambiente. Ogni lavaggio è di 5 minuti con rotazione alla temperatura appropriata. Dopo ogni lavaggio centrifuga, a 4 ° C (temperatura ambiente per tampone di lavaggio 4 lavaggi) a 1000 xg per 1 minuto, poi accuratamente aspirare o rimuovere il surnatante.

Tampone 1: Bassa tampone di lavaggio di sale (20 mM Tris-HCl (pH 8,1), 2 mM EDTA, 1% Triton X-100,
150 mM NaCl e 0,1% SDS), 1 ml x 2 lavaggi.
Buffer di 2: High tampone di lavaggio di sale (20 mM Tris-HCl (pH 8,1), 2 mM EDTA, 1% Triton X-100,
500 mM NaCl e 0,1% SDS), 1 ml x 2 lavaggi.
Tampone 3: buffer sale lavare LiCl (10 mM Tris-HCl (pH 8,1), 1 mM EDTA, 1% IGEPAL-CA630,
0,25 M LiCl e acido desossicolico 1% (sale sodico)), 1 ml x 1 lavaggio.
Buffer 4: tampone TE (10 mM Tris-HCl (pH 8,1), 1 mM EDTA), 1 ml x 2 lavaggi.

7. Eluizione della cromatina-anticorpo

1. Risospendere il lavato cromatina-proteina-tallone complesso in 250 ml di tampone di eluizione appena preparati (1% SDS, 0,1 M NaHCO _3). Vigorosamente vortice il campione per 5 secondi, poi incubare a RT per 15 minuti con rotazione.
2. Centrifugare a 2500 xg per 1 minuto a temperatura ambiente e trasferire l'eluato in un nuovo tubo eppendorf.
3. Ripetere i passaggi 1 e 2 e combinare i eluati nella stessa provetta Eppendorf. Il eluati deve essere conservato a temperatura ambiente. Al termine di questa fase, gli eluati possono essere conservati a -20 ° C fino a quando un ulteriore uso.

8. Reverse Cross-link e Recupero del DNA

1. Aggiungere 20 l 5 M NaCl per 500 eluato microlitri (40 microlitri / ml per il controllo di input).
2. Riscaldare il eluati a 65 ° C in un bagno d'acqua per 4 ore a notte.
3. 10 ml di ciascun campione (compreso il controllo di ingresso) può essere eseguito su un gel di agarosio al 2% accanto alla segnataglie spanning 0,1-1 kbp per verificare la dimensione del frammento di DNA. Il DNA apparirà come uno striscio e non un gruppo forte. Il resto dei campioni può essere lasciato a 65 ° C mentre il gel è in esecuzione.
4. Recuperare il DNA di ogni campione con un QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen). Aggiungere 600 microlitri di buffer QG (fornito nel kit) per ottimizzare l'assorbimento del DNA con la membrana di silice in una colonna di spin QIAquick e 200 ul isopropanolo in un campione di 500 microlitri. Si noti che di buffer QG contiene un indicatore di pH che permette una facile determinazione del pH del campione. Se il colore del campione si trasforma dal giallo al viola (pH> 7,5) dopo la miscelazione, aggiungere 10 ml di NaAcetate 3 M (pH 5.2) al campione e mescolare. Questo riduce il pH della miscela di massimizzare il DNA legame con le perline nella colonna.
5. Prima di caricare la colonna, controllare la miscela per stabilire se l'eventuale precipitato SDS è presente. Se SDS precipitazioni si è verificato, il campione deve essere portata in un42 ° C bagnomaria fino a quando il precipitato scompare.
6. Carico di 700 l di miscela nella colonna di spin QIAquick (colonna viola nel kit) e centrifugare a RT a 14000 xg per 1 min. Gettare il flusso attraverso dalla colonna prima di procedere e ripetere l'operazione con il resto del campione.
7. Aggiungere 500 microlitri di buffer QG per lavare la colonna. Centrifugare a RT a 14000 xg per 2 minuti. Gettare il flusso attraverso dalla colonna prima di procedere.
8. Lavare la colonna con 700 ml di PE tampone di lavaggio (in dotazione nel kit) a cui l'etanolo è stato aggiunto secondo le istruzioni del produttore. Centrifugare a RT a 14000 xg per 1 min. Gettare il flusso attraverso dalla colonna prima di procedere.
9. Ripetere la fase di centrifugazione per rimuovere completamente la parte restante del buffer PE dalla colonna. Gettare il flusso attraverso il tubo e la raccolta.
10. DNA eluire dalla colonna in una nuova provetta eppendorf con l'aggiunta di 60 microlitri di buffer EB (tampone di eluizione fornito nel kit).
11. Centrifugare a temperatura ambiente a 14000 xg per 1 min. Il DNA eluito può essere conservata a -20 ° C fino rilevamento. A ₂₆₀ letture del materiale recuperato indicano in genere le concentrazioni di 90-120 ng / ul, per un recupero totale di circa 6-7 ug per aliquota. Tuttavia, la A _260/280 rapporto di questi campioni è tipicamente> 1,8, il che suggerisce che l'RNA è presente nel campione. Pertanto, l'importo esatto di DNA recuperato può essere inferiore.

9. Analisi del DNA recuperato

1. SDS possono interferire con l'attività della polimerasi PCR Taq. SDS deve essere rimosso completamente prima di eseguire PCR. Incubare il DNA in ghiaccio per far precipitare ogni residuo SDS e centrifugare a 4 ° C a 14000 xg per 1 min. Trasferire il supernatante in una nuova fase eppendorf tube.This è fortemente raccomandato.
2. Il eluati DNA può essere rilevato sia convenzionale PCR quantitativa o real-time PCR (Q-PCR) con primer specifici per ogni sequenza da analizzare. Microlitri 5-10 eluato DNA totale può essere utilizzato per una PCR o Q-PCR reazione. PCR con il controllo di input possono essere effettuate con una diluizione del 5-10 volte del DNA rispetto alla quantità di altri campioni. PCR e Q-PCR condizioni variano, tuttavia, la quantità limitata di materiale di partenza richiede ulteriori cicli di PCR. Per convenzionale PCR, si consiglia di partire con 40 cicli e regolando, se necessario.

10. Rappresentante Risultati

Abbiamo usato questo protocollo per eseguire ChIP sia da embrioni E8.5 e E9.5 (Figura 2). I risultati dimostrano che miogenina è presente sul promotore miogenina in E8.5 ed embrioni E9.5. ChIP DNA purificati sono stati analizzati mediante PCR convenzionale (Figura 2A) e quantitativa real-time PCR (Figura 2B). Al contrario, non vi era alcuna indicazione di miogenina legame al promotore miogenina nel sacco vitellino, dove miogenina non si esprime. L'interferone-γ (IFNγ) promotore, che contiene le sequenze corrispondenti nel sito miogenina vincolante, è stato utilizzato come controllo sequenza negativa. Come previsto, miogenina non era legato al promotore IFNγ in nessuno dei campioni di tessuto testato. In E8.5 e 9,5 embrioni, miogenina è specificamente indicato nella somiti (Figura 3, ^6,10), che sono i precursori del muscolo scheletrico. Così i risultati indicano che miogenina è legato al promotore miogenina nei metameri nella E8.5 e E9.5.

Figura 1. E8.5 dissezione dell'embrione. (A) Isolato corno uterino (pannello superiore, maggiore ingrandimento mostrato nel riquadro inferiore). (B) uterino corno tagliato con le forbici per separare i singoli siti di impianto degli embrioni contenenti individuali. (C) Gli embrioni che sporge dal tessuto uterino durante la dissezione. Frecce marchio embrioni ancora coperto da tessuti extra-embrionali. (D) Due E8.5 embrioni della stessa cucciolata. L'embrione di sinistra non ha iniziato il processo di trasformazione. L'embrione a destra è in fase di svolta. Estrema destra - rappresentante degli embrioni E9.5.

Figura 2. Test ChIP dimostrando miogenina vincolante per il promotore miogenina in E8.5 ed embrioni E9.5. (Top) analisi PCR convenzionale su 5 ul di DNA purificato da esperimenti di ChIP utilizzando un anticorpo miogenina o non-specifici IgG è stata eseguita con primers che amplificano una parte del promotore miogenina da -79 a 69 rispetto al sito di inizio della trascrizione che contiene un sito miogenina vincolante trova a -12 o primer che amplificano una parte del promotore IFNγ che contiene una sequenza corrispondente al sito miogenina legame situato ~ 1075 bp a monte del sito di inizio della trascrizione. Le sequenze IFNγ Primer utilizzati sono stati 5'-GCT GAC TCA AGA CCC CGA GGC-3 'e 5'-GGA TGA TGG GGC AGG AGG CC-3'. (In basso) quantitativa in tempo reale analisi PCR dei campioni stessi utilizzati (A). Ili dati sono rappresentati come% di ingresso + / - deviazione standard.

Figura 3. Myogenin è specificamente indicato nella somiti di E8.5 e E9.5 embrioni. Montare tutto ibridazione in situ di miogenina mostra specifica espressione di mRNA in somiti. Bar dimensioni in E8.5 immagine - 200 micron. Bar dimensioni in E9.5 immagine - 500 micron.

Discussione

Nel protocollo ChIP descritto, ci mostrano che la miogenina regolatore miogenico è associato con il promotore miogenina nel tessuto muscolare scheletrico precursore presenti nel singolo E8.5 ed embrioni E9.5. Precedenti studi hanno ampiamente caratterizzato miogenina vincolante alla casella E contenenti sequenze, a partire dalla iniziale esperimenti in vitro spostamento gel utilizzando in vitro tradotto o batteri prodotto DNA radiomarcato miogenina e codifica la quota di competenza di sequenze geniche...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
ChIP Assay Kit	Upstate, Millipore	17-295
Collagenase Type II	Invitrogen	17101015	Dilution by 1 x PBS
Dulbecco’s modified eagle medium (DMEM)	GIBCO, by Life Technologies	12100-061	High glucose content
Dulbecco’s phosphate buffered saline 1X (DPBS)	GIBCO, by Life Technologies	14190-144	Calcium chloride free, Magnesium chloride free
Fetal bovine serum (FBS)	Mediatech, Inc.	35-010-CV
Gel extraction kit	QIAquick	28704	50 reaction kit
Penicillin/streptomycin stock solution	GIBCO, by Life Technologies		5000 μg/ml concentration
Protease Inhibitor Cocktail	Sigma-Aldrich	P8340
Salmon sperm DNA /Protein A agarose	EMD Millipore	16-157
myogenin antibody	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	sc-576
Normal rabbit IgG	EMD Millipore	12-370
Platinum PCR Supermix	Invitrogen	11306-016
GoTaq Q-PCR master mix	Promega Corp.	A6001