Erken evre Fare Embriyolar kullanarak Doku özel Genler Kromatin Immunoprecipitation Testi

Özet

Biz fare embriyonik doku doku-spesifik gen ekspresyonu başlangıcı sırasında veya sonrasında doku spesifik genlerin faktör etkileşimleri belirlemek için yöntem bir kromatin immunoprecipitation (ChIP) göstermektedir. Bu protokol, normal embriyonik gelişim sırasında ortaya çıkan doku-spesifik gen aktivasyon çalışması için yaygın olarak uygulanabilir olmalıdır.

Özet

^1-3 canlı hücreler bağlamında ortaya çıkan kromatin etkileşimleri: Kromatin immunoprecipitation (ChIP) protein tanımlamak için güçlü bir araçtır. Bu teknik yaygın birincil doku, doku kültürü hücrelerinde daha az bir ölçüde istismar ve olmuştur. ChIP kemirgen embriyonik gelişimin erken dönemlerinde özellikle doku, uygulaması, sınırlı miktarda doku ve embriyonun hücre ve doku tiplerinin heterojenite karmaşıktır. Burada ayrışmış bir embriyonik gün 8.5 (E8.5) embriyo kullanarak ChIP gerçekleştirmek için bir yöntem sunuyoruz. Kromatin etkileşimleri tek bir E8.5 embriyo makaslanmış kromatin beş alikotları, denetimleri ve özel protein soruşturma için müfettiş yeterli malzeme sağlar içine kadar bölünmüş olabilir.

Özellikleri, doku-spesifik gen ekspresyonu programlar sırasında kromatin etkileşimleri: Biz protein belge başlamak için bu tekniği kullanmış olması. Kromatin etkileşimleri tüm etkileşimler meydana olsun ayrım yapmadan, bir alt kümesidir, ya da tek bir hücre tipi (ler): Sonuç protein saptanması, çünkü bir embriyo hücre tiplerinin heterojenite mutlaka bu tekniğin uygulama kısıtlar. Ancak, sırasında doku spesifik genlerin incelenmesi veya doku belirli bir gen ekspresyonu başlangıcını izleyen iki nedenden dolayı mümkün. İlk olarak, doku spesifik faktörlerin immunoprecipitation mutlaka faktör ifade edilen hücre tipi kromatin izole eder. İkincisi, gen aktivasyonu ile ilişkili olan post-translasyonel modifikasyonlar içeren koaktivatörleri ve histon, immunoprecipitation sadece gen olan hücre tipi genler ve gen düzenleyici dizileri olmalıdır ya da aktif olmuştur. Tekniği, doku-spesifik gen aktivasyonu olayları incelemek için geçerli olmalıdır.

Örneği aşağıda tarif edilen, bağlayıcı faktör incelemek için bir iskelet kas belirli bir gen promoter E8.5 ve E9.5 fare embriyoları kullanılmıştır. E8.5-9.5 ^4,5 Somitlerin, gövde, kol ve bacakların iskelet kaslarının formunu hangi habercisi dokularda bulunur. Myogenin iskelet kası farklılaşması ^6-9 için gerekli düzenleyici bir faktör. Myogenin E8.5 ve E9.5 embriyolar kendi organizatörü ile ilişkili olduğunu göstermektedir. Myogenin sadece ^6,10 gelişme bu aşamada Somitlerin ifade olduğundan, veri kendi organizatörü myogenin etkileşimleri zaten E8.5 embriyolar iskelet kas öncü hücrelerinde meydana gelmiş olduğunu göstermektedir.

Protokol

1. Embriyoların izolasyonu

Not: fareler içeren tüm işlemler uygun hayvan bakımı ve kullanım ilkeleri ve protokolleri doğrultusunda yapılmalıdır

1. Sabah çiftleşmeden sonra dişi fare, bir çiftleşme fişi varlığı için kontrol edin ve onlara farklı bir kafese koyarak damızlık erkek evlendirilen kadın ayrı. Çiftleşme fişi görülmektedir gün Noon embriyonik gelişim günde 0.5 (E0.5) olarak kabul edilir.
2. E8.5, (ya da istenen sahne, eğer farklıysa), onaylı bir protokolü kullanarak fare kurban.
3. % 70 etanol ile ötenazi hayvanın karın Islak ve karın boşluğu açmak. Gelişmekte olan embriyolar varlığını gösteren uygulama yerlerinin her rahim boynuz uzunluğu boyunca (Şekil 1A) bir ipe boncuk "düzenleme" olarak görülüyor. Makaslar kullanılarak, hem de rahim boynuzları kaldırmak ayrı ayrı ayrı her implantasyon sitesi kesmek (Şekil 1B) ve oda sıcaklığında (RT) içeren bir 100 mm petri koyun diseksiyonu orta (DMEM,% 10 fetal sığır serumu, 20 mM HEPES pH 7.4 60 mcg / ml penisilin, 2 mM streptomisin).
4. Forseps kullanarak, rahim dokusu (Şekil 1C) her embriyo ve çevresindeki membranlar kaldırmak ve taze diseksiyonu orta koyun.
5. Forseps kullanarak bir diseksiyon mikroskop altında bireysel embriyolar izole edin. Geliştirme Bu aşamada, embriyoların, paryetal yolk kesesi, rehber deciduum doku, visseral yolk kesesi ve amniyon. Ile çevrili Amniyon embriyo ile doğrudan temas halinde olan şeffaf bir zar. Visseral sarısı kesesi, amnion ve paryetal yolk kesesi arasında yer alır ve kolayca E8.5-E9.5 embriyolar embriyo beslemek önde gelen kan damarlarının varlığı ile ayırt edilir. Çevresindeki membranlar, her embriyo çıkarın ve aşırı kan çıkarmak için diseksiyon medya içeren yeni bir plaka içine ayrı ayrı transferi. Gelişimsel aşamada, embriyo embriyoya litre arasında değişebilir; temsilcisi E8.5 embriyo ve bir temsilcisi E9.5 embriyo Şekil 1D gösterilmiştir.
6. 200 ul diseksiyonu medya (yukarıdaki 4. adımda açıklandığı gibi) içeren 1.5 ml Eppendorf tüp her embriyo transferi.

2. İzole Embriyo, Homojenizasyon

1. Her Eppendorf tüpüne 200 ul hacmi (DPBS 1X Dubbecco Fosfat seyreltilmiş Tamponlu Salin) 20 adet kollajenaz tip II ekleyin.
2. 37 ° C çalkalayıcı numune 100 rpm'de 20 dakika süreyle hafifçe sallayın.
3. Hücre kümeleri bozabilir pipetleme iyi süspanse edin.
4. Hücre süspansiyonu, 1.5 ml Eppendorf tüp üzerine yerleştirilir steril hücre süzgeç (40 mikron mesh boyutu) üstüne sürün.
5. Ayrımını tamamlamak için oda sıcaklığında hücre süzgeç üstüne 1X DPBS 600 ul hemen geçerlidir. Süzgeç atın.
6. 4 örnekleri Santrifüj ° C, 5 dakika için 4000 xg'de.
7. Süpernatantı atın.
8. RT 1X DPBS 1 ml pelletini tekrar.
9. Örnekleri oda sıcaklığında 1 dakika için 4000 xg'de santrifüjleyin.
10. Süpernatantı atın.
11. 200 RT diseksiyon medya ul pelletini tekrar.
12. Embriyonik hücre sayımı. Ortalama 3-5 x 10 ⁶ cells/E8.5 embriyo vardır.

3. Çapraz bağlantı Kromatin

1. % 1 lik formaldehit nihai konsantrasyonu 200 ul örnekleri% 37 formaldehit 5.6 ul ekleyin.
2. Örnekleri oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.
3. 4 ° C ile 3 dakika 4000 xg'de numuneleri santrifüjleyin.
4. Süpernatantı atın.
5. 80 ul / ml proteaz inhibitörü kokteyl (PIC) içeren soğuk 1X DPBS hücreleri yeniden süspanse edin.
6. 4 örnekleri Santrifüj ° C, 3 dakika 4000 xg'de.
7. Süpernatantı atın. Bu aşamada, numuneler -80 dondurulmuş ° C Dondurulmuş, çapraz örnekleri, birkaç ay boyunca stabildir.

4. Sonikasyon

1. RT SDS lizis tamponu (taze eklendi PIC 1 ul PIC/800 ul toplam hacmi 50 mM Tris-HCl (pH 8.1), 10 mM EDTA ve% 1 SDS) 100 ul hücre pelletini tekrar. Yeniden süspanse, RT SDS lizis tamponu tabanda teşvik etmek için ek bir 100 ul ekleyin. Pipetleme ve tersine çevirerek iyice karıştırın.
2. 10 dakika buz üzerinde hücre süspansiyonu inkübe edin.
3. 200 ile 500 basepairs Diagenode Bioruptor kullanarak kesme DNA parçalanmış hücreleri sonikasyon ™ UCD200 (5 dak x 8 kez 30 sn on/30 sn: yüksek (320 watt) güç genlik ayarı). Örnekleri bir buz bulamaç çevrili olmalıdır. Örnekler 4 ° C üzerinde sıcak veya dondurmak için izin vermeyin. Kullanılabilir sonicators birçok türü vardır. Yaklaşık 500 bp uzunluğunda çapraz bağlı DNA makaslama sonucu her sonikatör Sonikasyon koşulları için optimize edilmelidir.
4. 4 sonicated örnekleri Santrifüj ° C'de 10 dakika süreyle 14000 xg'de.
5. Ttaze bir Eppendorf tüp buz üzerinde önceden soğutulmuş süpernatant ransfer.
6. 5 alikotları maksimum sonicated örnek bölün. Ampirik bir E8.5 embriyo 5 alikotları ayrılabilir olduğunu tespit ettik. Küçük veya büyük örneklem büyüklüğü buna göre ölçeklendirilebilir. Bu aşamada, örnek -80 ° C daha sonra kullanmak kadar saklanabilir.
7. Rezerv çapraz bağ tersine dönecek kadar -20 ° C adım 6 giriş ve deposu olarak kullanmak için bir kısım. Seyreltik 1 μl/800 taze eklendi PIC içeren ChIP seyreltme tamponu (16.7 mM Tris-HCl (pH 8.1), 1.2 mM EDTA,% 1.1 Triton X-100, 167 mM NaCl ve% 0,01 SDS) 10 kat, diğer alikot ul tampon.

5. Ön temizleme ve Immunoprecipitation

1. Pre-açık Salmon-Sperm DNA / Protein 4 A veya Agaroz G-50% bulamaç ° C, döndürme, 1 saat 75 ul ile seyreltilmiş süpernatant. A veya Protein G boncuk ChIP için kullanılacak antikor tespit edilmelidir iki Protein kullanın. Örneğin, protein G boncuk keçi antikorları veya fare IgG ₁ antikorlar için önerilen ise protein A boncuk, tavşan antikorları için önerilir. Daha ayrıntılı bilgi için, boncuk üreticisi tarafından yapılan tavsiyelere bakın.
2. 4 ° C'de 1 dakika için 2500 xg'de santrifüjleyin.
3. Yeni bir ön soğutmalı Eppendorf tüp süpernatantı aktarın.
4. Önceden temizlenmiş kısım antikor (4 mikrogram / örnek) ekleyin ve 4 gece inkübe ° C dönüş.

6. Çamaşır Kromatin-protein-boncuk Kompleksi

1. 4 ° C rotasyon ile 1 saat süreyle inkübe içine her şişe ve Somon Sperm DNA / Protein A veya G agaroz bulamaç 60 ul ekleyin. 3. adımda ön temizleme için kullanılan aynı boncuk türü kullanın.
2. 4 ° C'de 1 dakika için 1000 xg'de santrifüjleyin.
3. Süpernatantı dikkatlice çıkarın ve atın. DNA-protein-boncuk kompleksi buz üzerinde tutun.
4. Süspanse edin ve yıkama tamponlar 1, 2 ile aşağıda yönettiği pelet, 3, ve 4 yıkayın. 1-3, 4 ° C ve bu tamponlar ile yıkama yapılmalıdır 4 soğutulmuş olmalıdır tamponlar ° C yıkayın Tampon 4 oda sıcaklığında yapılmalıdır oda sıcaklığında ve bu tamponu ile yıkar olmalıdır yıkayın. Her yıkama uygun sıcaklık rotasyon ile 5 dakika boyunca. 4 ° C (4 yıkama yıkama tamponu oda sıcaklığında) 1 dakika için 1000 xg'de her yıkama, santrifüj, daha sonra dikkatlice aspire veya süpernatantı kaldırmak.

Tampon 1: Düşük tuz yıkama tamponu (20 mM Tris-HCl (pH 8.1), 2 mM EDTA,% 1 Triton X-100,
150 mM NaCl ve% 0.1 SDS), 1 ml x 2 yıkar.
Tampon 2: Yüksek tuz yıkama tamponu (20 mM Tris-HCl (pH 8.1), 2 mM EDTA,% 1 Triton X-100,
500 mM NaCl ve% 0.1 SDS), 1 ml x 2 yıkar.
Tampon 3: LiCl tuz yıkama tamponu (10 mM Tris-HCl (pH 8.1), 1 mM EDTA,% 1 IGEPAL-CA630
0.25 M LiCl ve% 1 deoxycholic asit (sodyum tuzu)), 1 ml x 1 yıkama.
Tampon 4: TE tamponu (10 mM Tris-HCl (pH 8.1), 1 mM EDTA), 1 ml x 2 yıkar.

7. Kromatin-antikor Kompleksi, Elüsyon

1. Taze hazırlanmış elüsyon tamponu (1% SDS, 0.1 M NaHCO ₃₎ 250 ul yıkanmış kromatin-protein-boncuk kompleks tekrar 5 saniye sonra rotasyon ile 15 dakika oda sıcaklığında inkübe şiddetle vorteks örnek.
2. 1 dakika için 2500 xg'de RT Santrifüj ve yeni bir Eppendorf tüp içine eluat aktarmak.
3. 1. ve 2. adımları tekrarlayın ve aynı Eppendorf tüp Eluatlar birleştirmek. Eluatlar oda sıcaklığında tutulmalıdır. Eluatlar bu adımın tamamlanmasından sonra, daha sonra kullanmak kadar -20 ° C'de saklanabilir.

8. Ters Cross-Link ve DNA Kurtar

1. 500 ul eluat (giriş kontrolü için 40 ul / ml) 20 ul 5 M NaCl ekleyin.
2. Bir gecede 4 saat süreyle su banyosunda 65 ° C Eluatlar ısıtın.
3. (Giriş kontrolü de dahil olmak üzere) her bir numune 10 ul DNA parçası boyutunu kontrol etmek için 0.1 ile 1 kbç kapsayan boyutu işaretleri yanında% 2 agaroz jel üzerinde çalıştırılabilir. DNA bir karalama olarak görünür ve keskin bir grup değil. Örneklerin geri kalanı 65 bırakılabilir ° C jel çalışırken.
4. QIAquick Jel Ekstraksiyon Kiti (Qiagen) kullanılarak her örnek DNA kurtarın. QIAquick spin kolon ve 500 ul örnek içine izopropanol 200 ul silika membran ile DNA adsorpsiyon optimize etmek için 600 ul QG tampon (kit verilen) ekleyin. QG tampon numunenin pH kolay belirlenmesi sağlayan bir pH indikatörü içerdiğini unutmayın. Numunenin rengi mor sarı çıkarsa (pH> 7.5) karıştırıldıktan sonra, 3 M NaAcetate 10 ul örnek ve karıştırmak için (pH 5.2) ekleyebilirsiniz. Bu sütunda boncuk bağlayıcı DNA en üst düzeye çıkarmak için karışımın pH azaltır.
5. Sütun yüklemeden önce, herhangi bir SDS çökelti olup olmadığını belirlemek için karışımı kontrol edin. SDS yağış meydana gelmişse, örnek bir ısıtılmalıdır.42 ° C su banyosu çökelti kaybolana kadar.
6. Karışımı 700 ul QIAquick spin kolon (kit mor sütun) içine yerleştirin ve oda sıcaklığında 1 dakika süreyle 14000 xg'de santrifüj. Devam etmeden önce sütun üzerinden akış atın ve numunenin geri kalanı ile bu adımı tekrarlayın.
7. Sütun yıkamak için 500 ul QG tampon ekleyin. 2 dakika süreyle 14000 xg'de RT santrifüjleyin. Devam etmeden önce sütun üzerinden akış atın.
8. Sütun üretici tarafından talimat olarak etanol eklendiği PE yıkama tamponu 700 ul (kit verilen) ile yıkayın. 1 dakika için 14000 xg'de RT santrifüjleyin. Devam etmeden önce sütun üzerinden akış atın.
9. Sütun PE tampon kalanı tamamen kaldırmak için santrifüj adımı yineleyin. Üzerinden akışı ve toplama tüpüne atın.
10. 60 ul EB tampon (elüsyon tampon kiti) ekleyerek, yeni bir Eppendorf tüp içine sütun Zehir DNA.
11. Oda sıcaklığında 1 dakika süreyle 14000 xg'de santrifüjleyin. Elue edilmiş DNA tespiti kadar -20 ° C'de saklanabilir. Kurtarılan malzemenin genellikle ₂₆₀ okuma ~ kısım ortalama 6-7 ug toplam kurtarma için 90-120 ng / ul konsantrasyonları göstermektedir. Ancak, RNA örnek olduğunu düşündüren bu örnekler A _260/280 oranı, genellikle> 1.8. Böylece atık DNA tam miktarı düşük olabilir.

9 - Kurtarılan DNA Analizi

1. SDS PCR Taq polimeraz aktivitesini engelleyebilir. SDS PCR performans önce tamamen çıkarılmalıdır. 14000 xg'de 1 dakika için 4 herhangi bir kalıntı SDS ve santrifüj ° C çöktürmek için buz üzerinde DNA inkübe edin. Yeni bir eppendorf tube.This adım süpernatant transfer şiddetle tavsiye edilir.
2. DNA Eluatlar geleneksel PCR ile analiz edilmesi için her sırası için spesifik primerler ile kantitatif gerçek zamanlı PCR (Q-PCR) tarafından da tespit edilebilir. Toplam DNA eluat 5-10 ul bir PCR veya Q-PCR reaksiyonu için kullanılıyor olabilir. PCR ile giriş kontrolü, diğer örneklerin miktarı ile karşılaştırıldığında DNA 5-10 kat seyreltme yapılabilir. Ancak, PCR ve Q-PCR koşulları değişecektir, başlangıç ​​materyalinin sınırlı miktarda ek PCR döngüsü gerektirir. Konvansiyonel PCR için 40 döngü ile başlayan ve gerektiği şekilde ayarlanması önerilir.

10 Temsilcisi Sonuçlar

Biz E8.5 ve E9.5 embriyolar (Şekil 2) hem de ChIP gerçekleştirmek için bu protokol kullandık. Myogenin E8.5 ve E9.5 embriyolar myogenin organizatörü mevcut olduğunu göstermektedir. ChIP saflaştırılmış DNA'lar geleneksel PCR (Şekil 2A) ve kantitatif gerçek zamanlı PCR (Şekil 2B) tarafından analiz edildi. Buna karşılık, myogenin ifade değildir yolk kesesi, myogenin organizatörü bağlayıcı myogenin hiçbir belirti yoktu. Interferon-γ (IFNγ) myogenin bağlayıcı site eşleşen dizileri içeren organizatörü, negatif bir dizi kontrol olarak kullanıldı. Beklendiği gibi, myogenin test edilen doku örneklerinde herhangi bir IFNγ organizatörü bağlı değildi. Iskelet kas öncüleri; E8.5 ve 9.5 embriyolar myogenin özellikle hücre grubu ^(6,10 Şekil 3) ifade edilir. Böylece sonuçları myogenin E8.5 ve E9.5 Somitlerin myogenin organizatörü bağlı olduğunu göstermektedir.

Şekil 1 E8.5 embriyo diseksiyonu. (A) İzole uterin horn (üst panel, alt panel gösterilen yüksek büyütme). (B) uterin horn, bireysel embriyoları içeren bireysel uygulama yerleri ayrı makasla kesilir. (C) Embriyolar Diseksiyon sırasında rahim dokusundan çıkıntılı. Oklar embriyoların hala ekstra embriyonik doku ile kaplı işareti. (D) İki aynı çöp E8.5 embriyolar. Soldaki embriyo dönüm süreci başlamamıştır. Sağdaki embriyo dönüm geçiyor. Uzak sağ temsilcisi E9.5 embriyo.

Şekil 2 ChIP tahlil E8.5 ve E9.5 embriyolar myogenin organizatörü bağlayıcı myogenin gösteren. Myogenin antikor veya non-spesifik IgG transkripsiyon başlangıç ​​sitesine myogenin organizatörü -79 - 69 göreli bir kısmını yükseltmek primerler ile yapıldı kullanarak ChIP deneylerden elde edilen arıtılmış DNA 5 ul (Üst) Konvansiyonel PCR analizi -12 veya IFNγ organizatörü ~ 1075 bp upstream transkripsiyon başlangıç ​​sitesinde yer alan myogenin bağlayıcı site ile eşleşen bir dizi içeren bir kısmını yükseltmek primerler bulunan bir myogenin bağlayıcı site içermektedir. IFNγ astar dizileri GAC TCA AGA CCC CGA GGC-3 've 5'-TGA GGA TGG GGC AGG AGG CC-3', 5'-GCT edildi. (A) kullanılan aynı örneklerinin (Alt) Kantitatif Gerçek-zamanlı PCR analizi.standart sapma - veri giriş + / -% olarak çizilir.

Şekil 3 Myogenin E8.5 ve E9.5 embriyolar Somitlerin ifade edilir. Tüm montaj myogenin in situ hibridizasyon Somitlerin spesifik mRNA ekspresyonu gösterir. 200 mikron - E8.5 görüntü Boyut bar. E9.5 görüntü Boyut bar - 500 mikron.

Tartışmalar

Açıklanan ChIP protokolde, miyojenik regülatör myogenin tek E8.5 ve E9.5 embriyolar bulunan, iskelet kas habercisi dokusunda myogenin organizatörü ile ilişkili olduğunu göstermektedir. Önceki çalışmalar ^yoğun, 11-20 hedef gen düzenleyici dizilerinin ilgili kısmı kodlama in vitro tercüme veya bakteriyel myogenin ve radyoaktif DNA kullanan in vitro jel vardiya deneylerde ilk başlayan, dizileri içeren E kutusuna bağlayıcı myogenin belirlemiştir . Konvansiyonel C...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
ChIP Assay Kit	Upstate, Millipore	17-295
Collagenase Type II	Invitrogen	17101015	Dilution by 1 x PBS
Dulbecco’s modified eagle medium (DMEM)	GIBCO, by Life Technologies	12100-061	High glucose content
Dulbecco’s phosphate buffered saline 1X (DPBS)	GIBCO, by Life Technologies	14190-144	Calcium chloride free, Magnesium chloride free
Fetal bovine serum (FBS)	Mediatech, Inc.	35-010-CV
Gel extraction kit	QIAquick	28704	50 reaction kit
Penicillin/streptomycin stock solution	GIBCO, by Life Technologies		5000 μg/ml concentration
Protease Inhibitor Cocktail	Sigma-Aldrich	P8340
Salmon sperm DNA /Protein A agarose	EMD Millipore	16-157
myogenin antibody	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	sc-576
Normal rabbit IgG	EMD Millipore	12-370
Platinum PCR Supermix	Invitrogen	11306-016
GoTaq Q-PCR master mix	Promega Corp.	A6001