כירורגי של השתלת תאים עכבר גזע עצביים לתוך מיתרי השדרה של עכברים נגועים בנגיף הפטיטיס עכבר Neurotropic

Summary

השתלה של תאים העכבר גזע עצביים (NSCs) לתוך מיתרי השדרה של עכברים עם demyelination הוקמה מפורט. הכנה של NSCs, laminectomy של החוליה החזי 9 (T9), וכן השתלת NSCs מתוארת יחד עם הטיפול לפני ואחרי הניתוח של העכברים.

Abstract

עכברים שהודבקו בזן JHM neurotropic של נגיף הפטיטיס העכבר (MHV) לפתח התוצאות פתולוגיים וקליני דומה בחולים עם טרשת demyelinating המחלה נפוצה (MS). הראינו כי השתלת NSCs לתוך מיתרי השדרה של תוצאות עכברים חולים שיפור משמעותי בחידוש יצירת המיאלין והן על התוצאה הקלינית. החלפת תא טיפולים לטיפול במחלות נוירולוגיות כרוניות כיום מציאות במודלים vivo הם חיוניים להבנת יחסי הגומלין בין התאים engrafted ורקמות microenvironment המארח. מצגת זו מספקת שיטה המותאמת השתלת תאים לתוך חוט השדרה של JHMV עכברים נגועים. בקיצור, אנו מספקים נוהל i) הכנת NSCs לפני ההשתלה, ii) טרום ניתוחית לטפל בעכברים, ג) החשיפה של חוט השדרה דרך laminectomy, ד) הזרקה של stereotactic NSCs, ו ד) שלאחר הניתוח טיפול .

Protocol

1. הכנה

1. הכן Xylazine-קטמין פתרון (קטמין הוא חומר מבוקר. מידע מפורט צריך להישמר ופתרונות מאוחסן במיקום, כספת נעולה).
2. נקי מחטאים ציוד.
3. הכן אזור הניתוח על ידי מנגב עם סוכן aseptic ואז מכסה עם מגבת נייר סטרילי, ולהגדיר את micromanipulator.

2. הכנת תאים להשתלה

1. תאים צריכים להיות resuspended לריכוז של 100,000 תאים / l אלקטרוני, למרות שרק 250,000 תאים מושתלים לכל עכבר, עודף של התאים נדרשת טעינה למטרות מזרק (להכין לפחות 300,000 תאים לכל עכבר קבלת תאים).
2. לשטוף התאים המושתלים להיות 3 פעמים ב HBSS חרוטי בקבוקון 50 מ"ל. ספירת התאים לפני הסיבוב האחרון.
3. אחרי הספין האחרון למטה, HBSS למזוג ולהשאיר בקבוקון במהופך עמדה כדי למנוע טיפות מלהגיע גלולה.
4. בתוך קירות יבש עם Kimwipe, UV-מוקרן סטרילית. אל תאפשר גלולה להתייבש.
5. החזקת שפופרת זקוף, לאט מאוד בעדינות resuspend התאים בנפח חצי הרצוי הסופי של HBSS.
6. מדוד את הנפח הכולל של pipetting רוב ההשעיה אל קצה פיפטה ואז להתאים את החוגה על pipetter עד ההשעיה כולו בקצה פיפטה. זה יגיד לך כמה HBSS יותר דרוש ריכוז הרצוי.
7. תביאו נפח לכמות הרצויה על ידי הוספת HBSS.
8. מניחים בחזרה על הקרח. בדיקת הכדאיות של תאים אם הם חייבים להיות על הקרח יותר מ 2 שעות.

3. הכנה של עכברים עבור ניתוח השתלת

1. להרדים את העכבר באמצעות זריקה intraperitoneal של קטמין (100mg/kg) ו xylazine (10mg/kg) ב ~ 100 מנות μl או הרדמה המקבילה. ההליך כולו מן הרחצה כדי תפירת ייקח 30-40 דקות.
2. (אופציונאלי: להחיל ממוספרים, סרט צבעוני לזנב של עכבר כל כדי להבטיח זיהוי)
3. לגלח את האזור הגבי של העכבר מן הגב התחתון אל הצוואר, והארכת 2 ס"מ בין שתי המדינות מ קו האמצע, עם קוצץ חשמלי. השיער צריך לחתוך קרוב ככל האפשר (יתכן שיהיה צורך לעבור על האזור מספר פעמים).
4. כדי להסיר את השיער הנותר, למרוח שכבה דקה של קרם להסרת שיער (Nair) עם גזה היטה המוליך.
5. אחרי 1-2 דקות, לנגב נאיר את עם גזה הרטובות קלות במי סבון. השטח צריך להיות מוכן עור חשוף ונקי ללא חתיכות תועה של שיער שיכולים להיכנס הפצע במהלך ההליך הכירורגי הבאים.
   לחטא את האזור עם פתרון מוכן יודיד.

4. Laminectomy

1. לעתים קרובות שינוי ו / או לעקר כפפות לאורך כל ההליך. מקם את העכבר בצד הגב עם הראש והצביע שמאלה (אם אתם ימניים). הנח בעלי חיים על מנת להבטיח סטריליות וכי רק את האזור מגולח חשוף. ביצוע חתך אנכי (~ 1.3cm) על אתר laminecomy פורש מ על חוליות בית החזה T8 ל T12.
2. בעזרת מלקחיים גרפה החזיק ביד שמאל, בנחישות להבטיח את עמוד השדרה על מילון T9 (איור 1A) ולהרים את העכבר עד להגזים עקמת שדרתית.
3. השתמש באזמל כדי להבקיע את הצומת בין T10 ו T11, את החלל בין שתי בליטות קוצני. יתר על כן לחשוף את צומת בקפידה על ידי מבטל את שכבת השריר משם לחשוף את העצם (ראה איור 1 ב ', ג').
4. השתמש במספריים כדי לקדם את השריר ברור הרחק lamina וסביב pedicle עם חיתוכים קטנים. זו תפתח את חלל קטן בין החוליות. לאט לאט ובעדינות להוסיף אחת של להב המספריים לתוך הפער הזה לגזור pedicle. ודא את העקמומיות של המספריים ממוקם תמיד רוחבית, הרחק חוט. חזרי על הפעולה בצד השני. (ראה איור 1D, ה)
5. הרם את lamina לחשוף את כבל ובזהירות לגזור אותו. הקפידו לא להשאיר את כל שברי עצמות חינם או משונן מאחור. (ראה איור 1F)
6. לפני הזריקה, לנקות דם משם עם צמר גפן סטרילי.

5. הזרקה של תאים

1. צרף את המחט עם אגוז המחט במזרק המילטון לנקות אותם על ידי שטיפה מספר פעמים עם מים, אז 70% אתנול, ו HBSS לבסוף. הכנס הבוכנה לאחר מילוי כל אחד עם מים, אתנול 70%, או HBSS.
2. הכן את המזרק המילטון לטעינת התא על ידי הסרת הבוכנה ואת משחררת את אגוז מחט ומושך את המחט מן המזרק כדי למנוע backpressure. ודא כי טיפול זהיר של המחט ואגוזים נעשים עם כפפות סטריליות.
3. טען 15μl של תאים לתוך פיפטה קצה ולחץ בחוזקה את קצה אל הקצה האחורי של המזרק כדי לטעון את התאים לתוך המזרק.
4. הכנס את הבוכנה על 5 מ"מ, ואז להדק את האום מחט.
5. לדכא הבוכנה האו"םtil חלק ההשעיה תא נתפסת היציאה מחט.
6. ודא שאין בועות במזרק ולהניח את המזרק במצב האופקי כדי למנוע את התאים מפני ביצוע הדרגתי על ידי כוח הכבידה.
7. לאחוז בעכבר laminectomized על ידי השריר spinalis dorsi המחבר את עמוד השדרה של T8 ו T9 (איור 2 ב, ג).
8. קלאמפ hemostat לזרוע (אנכי) שמאל micromanipulator כך רגליו הקדמיות של העכבר נמצאים באוויר רגליו האחוריות נוגע קלות פלטפורמה של מגבות נייר סטרילי כמו דמויות 2A ו 2B.
9. צרף את המזרק בזרוע micromanipulator ימינה (בזווית של ° 70) והחלק את המזרק למצב הנמוכה ביותר האפשרית בטרם יבלעו.
10. לייצב את העכבר על ידי הצמדת זנבו נגד מגבות נייר ולאט לאט להוריד את המזרק (2B איור).
11. מנמיכים את המחט לכיוון חוט והכנס את 1mm מחט לתוך חצי הכדור השני דרך קו האמצע הגבי (איור 2C). קצה המחט צריכה להיות בחומר האפור קרוב לתעלה המרכזית.
12. לאט לאט להזריק 2.5μl של תאים. הזרק בשיעור של 1μl / 5 שניות. לאחר הזרקת תאים, להמתין 10 שניות לחזור בו את המחט עשירית סיבוב בכל פעם כל 10 שניות עד שהמחט יוצא של חוט. שימו לב בזרימת אפשרית של השעיה התא.
13. לסגת במהירות את המזרק ולנתק אותו מן היד micromanipulator. הנח את המזרק אופקית.
14. שחרר את העכבר ולהעביר אל שולחן התפירה.
15. חזור על שלבים 5.7-5.14 עבור כל עכבר עד מזרק מרוקנת. לעקר כלים (ב מעקר) ואת המחט (על ידי מנגב עם אתנול) בין בעלי חיים. מחק תאים מחדש אם clumping גלוי.
16. נקה את המזרק כמו בשלב 5.1 בין המון.

6. התפרים ואת מנותחות טיפול

1. תפר את החתך. מחט תפר מוכנס לתוך fascia השטחי משני צידי החתך. חוט מתוח היא דרך, מושך fascia השטחית יחד (איור 3A), ובכך מכסה את חוט השדרה חשוף באתר lamina הוסרו. אל תפר את השריר עורית המצורפת עור או שריר השלד של הגב. משוך את החוט כולו דרך, והשאיר כ 1 / 2 ". שימוש מחזיק מחט, שלושה קשרים נוצרים חוט חיתוך קרוב הקשר האפשרי.
2. סגירת החתך על ידי יישום 02:58 סיכות (בהתאם לגודל של החתך) על העור (איור 3B). משוך בזהירות העור הרחק העכבר כדי למנוע הידוק השרירים הבסיסית.
3. שימוש 26G3 / 8 המחט להזריק האצבעות Lactated 0.5ml משנה cutaneously בגב התחתון מן החתך.
4. המקום העכבר לכלוב שלו. כדי להבטיח זאת הוא מסוגל לנשום בנוחות בזמן הרדמה, העכבר צריך להיות ממוקם בצד שלה בכלוב, הימנעות ממגע בין האתר הניתוח ומצעים כלוב. כלובים צריך להיות ממוקם על כריות חימום.
5. עכברים מנוטרים לאחר הרדמה פגה כדי להבטיח שוך דימום, התפרים נשארים סגורים, עכברים לחזור ניידות ניתוח מראש.
6. התייחס עכברים פעם אחת עם עצירות כאבים (0.05-0.1 מ"ג / ק"ג) לאחר הניתוח.
7. ודא עכברים לקויי גישה מספיק אוכל ומים: בקבוקי מים מצוידים 3.5 אינטש פיות המורחבת ועכברים אינם מסוגלים ללכת יד הם האכילו מים ו / או עתירי קלוריות תוסף תזונה (Nutri-Cal, Tomlyn).

7. נציג תוצאות:

התוצאות הרצויות יהיה ניתן לזיהוי על ידי חוסר בזרימת ההשעיה התא במהלך זריקה ועל ידי הופעת שלם של חוט השדרה בעקבות ההליך. לשם כך, חיוני לקיים תאורה בהיר ישירות על עמוד השדרה של העכבר במהלך laminectomy ובמהלך הזריקה. תאורה אופטימליים הוא הקל על ידי תאורה סיבים אופטיים (איור 2 א).

איור 1 - Laminectomy (א) לאחר חוליה T9 מוחזק ביציבות עם מלקחיים גרפה, (B, C) ​​ציון את עמוד השדרה עם האיזמל בין T10 ו T11 כדי להקל על כניסתם של המספריים מיקרו.. (ד) להחליק בזהירות את המספריים מיקרו בחלל שבין T10 ו T11 (החצים הבלעה, E) לחתוך את pedicles בכל צד (מקפים, E) לשחרר את lamina הגבי. (F) תהפכו את lamina עד rostrally ולנתק אותה.

איור 2. הזרקת NSCs. (א) ההגדרה הכללית של micromanipulator עם hemostat שמחזיק את העכבר מחובר בזרוע שמאל את המזרק המילטון על זרוע ימין בזווית של 70. (ב) hemostat להחזיק את השריר spinalis dorsi המחבר את עמוד השדרה של T8 ו T9. (ג) הוא הוריד את המחט דרך tהוא קו האמצע אל החומר האפור על הכדור השני, הפרוקסימלי לתעלה המרכזית.

איור 3. Sutures וסגירת הפצע. (א) Sutures מוחלים fascia השטחי משני צידי החתך. (ב) החתך נסגר עם סיכות 2-3 לפי הצורך (אחד מצרך המוצג פצע צורך 3).

Discussion

ההשתלה מבוצע היטב יהיה בעיקר על ציר laminectomy הזריקה זהירה של התאים. מכשול יסודי להימנע במהלך laminectomy היא פגיעה של חוט השדרה. זה יכול להתרחש במהלך ההליך עצמו או על ידי נזק שנגרם עקב שברי עצמות חדות השאיר אחריו ביצוע ההליך. כדי להימנע אלה, להבטיח את הנקודות של המספריים מיקרו מעוקל תמיד פונה הרחק חוט לבחון היטב את עמוד השדרה laminectomized מנת להבטיח כי כל שברי עצמות נמחקים וזה הקצוות מבנה השדרה הנותרים אין בגלוי בולטות או משוננים.

כאמור, זיהוי של בזרימת יהיה אפשרי אם אור זורחת בעליזות ישירות על חוט השדרה חשוף במהלך ההזרקה. בזרימת סביר להניח שיקרה עם 30 מחטים מד (לעומת 33 מד) ואם זריקה נעשה מהר מדי. אף על פי פרוטוקול זה נתן לנו תוצאות טובות, אחרים דיווחו כבר תקופות ההמתנה (עד 5 דקות) לפני retracting מחט הזריקה הבאה ^8,9. כמו כן, מחטים מד קטן עדיפים, אבל יש לנו ציין כי כמה תאים lysed בקלות רבה מדי, כאשר עברו 33 מחטים מד.

כדי למקסם את היעילות, צוות ההשתלות איוש ארבע תחנות שונות (עכבר הכנה, laminectomy, הזרקה, ותפרים) רצוי. יתר על כן, התזמון עבור כל הליך צריך להיות מותאם כדי לצמצם את זמן התאים מחכים על הקרח. לדוגמה, אנו ההשתלה בעכברים שלנו בקבוצות של ארבעה (מספר מנות לטעון כל המזרק), האדם הזרקת התאים מתחיל להעמיס את המזרק לאחר העכבר השלישי היה laminectomized והאדם בהכנת עכברים צריך להרדים את הפעולות הבאות הקבוצה אחרי העכבר השני של הקבוצה הקודמת כבר laminectomized. באופן זה, אנו יכולים השתלת תאים (או בקרת מדיה) תוך 40 עכברים כ 3 שעות, למרות כל עכבר ייקח כ 30-40 דקות.

החלפת תא טיפולים לטיפול בהפרעות מערכת העצבים המרכזית חלק כרגע בניסויים קליניים ^10. אין תחליף במודלים vivo של NSC השתלת פרוטוקול שלנו engraftment של NSCs לתוך מיתרי השדרה של עכברים עם demyelination המושרה ויראלי מאפשר את השימוש מודל חשוב של טרשת נפוצה ניתן להתאים בקלות מודלים אחרים.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם מגיב / ציוד	חברה	מספר קטלוגי	הערות (אופציונלי)
Ketaject	הפניקס Parmaceuticals	NDC 57319-542-02
Xylazine הידרוכלוריד	MP Biomedicals	158307
נאיר	הכנסייה & דווייט ושות
10  μl המילטון מזרק w / נשלף מחט	המילטון החברה	7635-01
מחטים המילטון, 30G או 33 G, ½ אינץ', 30 מעלות שפוע	המילטון החברה	7803-077803-05	בדקו את הכדאיות של התאים הבאים מעבר דרך מחטים לזהות את מד הטובה ביותר לשימוש
מיקרו מספריים	העולם מכשירי דיוק	555500S
קטנים גרפה מלקחיים	FST	11053-10
Stereotaxic	KOPF מכשירים	דגם 1772 יוניברסל מחזיק
Stereotaxic	KOPF מכשירים	דגם 1773 מחזיק אלקטרודה
Stereotaxic	KOPF מכשירים	902 דגם stereotaxic קטן חיה
Stereotaxic	KOPF מכשירים	דגם 960 אלקטרודה שמאל הספק
Sutures	Ethicon	95057-064
Lactated האצבעות	Hospira	NDC 0409-7953-03
סטייפלס	פיין המדע	12032-07
Hemostat	FST	13010-12
אזמלים, בגדלים 10,11	דיג	268878, 268879
Sutures	Ethicon	1676G	גודל 5-0, 3 / 8 "מעגל, 19mm מחט, חוט 45cm קלוע
רפלקס 7 קליפ פצע המוליך	FST	12031-07
7mm פצע קליפים רפלקס	FST	12032-07
אולסן-Hegar בעל מחט	FST	12502-12