Neurotropic 마우스 간염 바이러스에 감염된 마우스의 척수 코드에 마우스 신경 줄기 세포의 이식 외과

요약

설립 demyelination과 생쥐의 척수 코드에 마우스를 신경 줄기 세포 (NSCs)의 이식이 자세히 있습니다. NSCs의 준비는 흉부 척추 9 조 (T9) 및 NSCs의 이식의 laminectomy은 생쥐의 사전 및 사후 수술 치료와 함께 설명되어 있습니다.

초록

마우스 간염 바이러스의 neurotropic JHM 스트레인 (MHV)에 감염된 생쥐는 demyelinating 질병 다중 경화증 (MS) 환자와 유사한 병리 및 임상 결과를 개발할 수 있습니다. 우리는 모두 remyelination 및 임상 결과에 상당한 개선 아픈 쥐 결과의 척추 코드에 NSCs의 이식을 표시합니다. 만성 neurologic 질환의 치료를위한 세포 대체 요법은 이제 현실이며, 생체내 모델에 engrafted 세포 및 호스트 조직 microenvironment 사이의 상호 작용을 이해하는 핵심입니다. 이 프레 젠 테이션 JHMV에 감염된 생쥐의 척수에 세포를 이식에 대한 적응 방법을 제공합니다. 간단한, 우리는)​​) II, 이전 이식)를 게시 수술 치료를 미리 수술 생쥐의 치료, 3) laminectomy 통해 척수의 노출, IV) NSCs의 stereotactic 사출 및 IV를 NSCs의 준비를 I에 대한 절차를 제공합니다 .

프로토콜

1. 준비

1. Xylazine - 케타민을 솔루션 (케타민을는 규제 약품입니다. 상세한 기록 보관 및 솔루션은 안전 고정 위치에 보관해야합니다) 준비합니다.
2. 장비를 청소하고 소독.
3. 무균 에이전트 닦는 후 멸균 종이 수건으로 닦음과 덮개에 의해 수술 영역을 준비하고 micromanipulator를 설정합니다.

2. 이식 세포의 준비

1. 전용 250,000 세포가 마우스를 따라 이식 있지만 세포, 100,000 전지 / 전자 리터의 농도 resuspended 및되어야 세포의 과잉은 주사기 로딩 목적 (세포를 받고 마우스 적어도 초당 300,000 세포를 준비하는)가 필요합니다.
2. 50 ML 원뿔 병에 HBSS에 3 번 이식하는 세포를 씻으십시오. 마지막 스핀 전에 세포를 계산합니다.
3. 후 아래 마지막 스핀, 가만히 따르다 HBSS와 펠렛에 도달에서 방울을 방지하기 위해 위치를 아래로 뒤집어에 병을 두십시오.
4. UV - 조사, 멸균 Kimwipe와 건조 내부 벽. 펠렛 건조하는 것을 허용하지 않습니다.
5. 천천히 수직 튜브를 개최하고 매우 정교한 HBSS의 절반 마지막 원하는 볼륨에있는 세포를 resuspend.
6. 피펫 팁에 정지의 대부분을 pipetting 후 전체 정지가 피펫 팁의 때까지 pipetter에 다이얼을 조정하여 전체 볼륨을 측정합니다. 이것은 원하는 농도에 필요한 얼마나 더 많은 HBSS를 알려 줄 것입니다.
7. HBSS를 추가하여 원하는 금액으로 볼륨을 가져와.
8. 얼음에 다시 넣습니다. 그들은 더 이상의 2 시간을위한 얼음해야하는 경우 세포의 생존을 확인합니다.

3. 수술과 이식을위한 생쥐의 준비

1. 마취제 (100mg/kg)과 ~ 100 μl 회에 걸쳐 xylazine (10mg/kg) 또는 이에 상응하는 마취의 intraperitoneal 주사로 마우스를 마취. 외과 초등학교에서 suturing하는 전체 절차는 30-40분 소요됩니다.
2. (옵션 : 식별을 위해 각 마우스의 꼬리에 번호, 색깔 테이프를 적용)
3. 목 허리에서 마우스 등의 영역을 면도하고, 전기 면도기와 정중선에서 양국 2cm 연장. 머리는 (그것이 지역에 여러 번 이동해야 할 수 있습니다) 가능한 한 가까운 절단해야합니다.
4. 나머지 머리를 제거하려면, 거즈로 제모 크림 (나이르)의 얇은 레이어를 적용하는 것은 작은 주걱을 밀고.
5. 1~2분 후 비눗물로 가볍게 침수 거즈로 끝났다 나이르 닦으십시오. 준비 영역은 이후 수술 도중 상처로 얻을 수 머리카락의 몸에는 빠진 부분없이 깨끗한 맨 피부해야합니다.
   요오드 용액으로 준비 영역을 소독.

4. Laminectomy

1. 자주 절차 전반에 걸쳐 장갑을 변경 및 / 또는 소독. 머리가 (당신이 바로 잡 경우) 왼쪽을 가리키는와 마우스 등의 측면을 놓습니다. 불임을 보장만을 면도 지역 노출되는 위해 동물을 드레이프. laminecomy 사이트 T12에 대한 흉부 척추 T8에서 스팬 이상의 수직 절개 (~ 1.3cm)를 확인합니다.
2. 왼쪽에서 개최된 graefe의 집게로 단단히 T9 (그림 1A)에서 척추를 보호하고 척추 만곡을 과장하기 위해 마우스를 올려.
3. T10와 T11의 경계인 두 가시 라고나할까요 사이의 공간을 점수 메스를 사용합니다. 더 신중하게 (C를 그림 1B 참조) 뼈가 노출 떨어진 근육 레이어를 scrapping하여 접합을 폭로.
4. 멀리 라미나에서 작은 자르는으로 작은 꽃자루 주위 명확 근육을 심화하기 위해 가위를 사용합니다. 이것은 척추 사이의 작은 공간을 열 것입니다. 천천히 그리고 정교한이 간격으로 가위 중 하나 블레이드를 삽입하고 작은 꽃자루를 싹둑. 가위의 곡률은 항상 멀리 코드에서 옆으로 위치에 있는지 확인하십시오. 반대편에 반복합니다. (그림 1D, E 참조)
5. 코드를 노출하는 얇은 판을 들어 신중히를 싹둑. 뒤에 어떤 무료 또는 톱니 뼈 조각을 떠날하지 않도록주의하십시오. (그림 1 층 참조)
6. 이전 분사로 살균 목화 면봉을 제거하는 혈액을 청소하십시오.

5. 세포의 분사

1. 해밀턴 주사기에 바늘 너트와 바늘을 첨부와 물, 다음 70 % 에탄올로 여러 번 플러싱하여 청소하고, 마지막으로 HBSS. 물, 70 % 에탄올 또는 HBSS 각 입력 후 플런저를 삽입합니다.
2. 플런저를 제거하고 바늘 너트를 느슨해진 멀리 backpressure을 방지하기 위해 주사기에서 바늘을 당기는하여 셀 로딩에 대한 해밀턴 주사기를 준비합니다. 바늘 및 너트의주의 처리가 멸균 장갑을 착용 한채로 완료되었는지 확인합니다.
3. 피펫 팁로 세포의 15μl를로드하고 주사기로 세포를로드하기 위해 주사기의 백 엔드에 단단히 팁을 누르십시오.
4. 5mm에 대한 플런저를 삽입 후 바늘 너트를 조이십시오.
5. 플런저 취소를 낮춰까지 세포 현탁액의 일부가 바늘을 종료 볼 수 있습니다.
6. 거기에 주사기에 거품이없고, 중력에 그라디언트 만들기에서 세포를 방지하기 위해 수평 위치에 주사기를 누워 있는지 확인하십시오.
7. T8 및 T9 (그림 2B, C)의 쪽이를 연결하는 spinalis dorsi 근육에 의해 laminectomized 마우스를 꽉 잡아.
8. 마우스의 전면 손바닥이 하늘에 있고 그 뒤쪽 손바닥이 가볍게 인물 2A와 2B와 같이 멸균 종이 타월의 플랫폼을 감동 있도록 왼쪽 (세로) micromanipulator 암에 hemostat를 클램프.
9. 오른쪽 micromanipulator 암 (70 ° 각도)에 주사기를 부착하고 고정하기 전에 가능한 한 낮은 위치로 주사기를 슬라이드.
10. 종이 타올에 대한 꼬리를 달아 천천히 주사기 (그림 2B)을 낮게하여 마우스를 안정화.
11. 코드 향해 바늘을 내리고 등의 정중선 (그림 2C)를 통해 반대 북반구에 바늘 1mm를 삽입합니다. 바늘 끝은 중앙 운하에 가까운 회색 문제에 있어야합니다.
12. 천천히 세포의 2.5μl를 삽입. 1μl / 5 초 속도로 주입. 세포를 주입 후, 바늘이 코드의인지 10 초마다 때까지 한 번에 10 초 기다렸다가 바늘에게 차례의 10를 철회. 세포 현탁액의 유출 가능성에 관심을 기울이십시오.
13. 신속하게 주사기를 철회하고 micromanipulator 부문에서 분리합니다. 수평 주사기를 내려 놓 아라.
14. 마우스 및 suturing 테이블에 전송 놓습니다.
15. 주사기납니다 때까지 반복 각 마우스 5.7-5.14 단계를 반복합니다. 도구 (살균기) 및 동물 사이에 바늘을 (에탄올로 닦고 바이) 소독. 세포를 버리고 clumping이 보이는 경우 다시로드합니다.
16. 하중 사이의 단계 5.1로 주사기를 청소합니다.

6. 봉합하고 수술 치료

1. 절개를 봉합. 봉합사의 바늘은 절개의 양쪽에있는 표면 근막에 삽입됩니다. 스레드는이를 제거 라미나의 사이트에 노출된 척수를 덮고, (그림 3A) 함께 표면 근막을 끌어를 통해 중독이다. 피부 또는 뒷면의 골격 근육에 연결된 피부 근육을 치료하지 마십시오. 약 2분의 1가. "바늘 홀더, 세 옹이가 형성되고 스레드가 가능한 매듭 가까이로 줄어들 수 있습니다 사용 떠나는를 통해 전체 스레드를 당겨.
2. 피부 (그림 3B)에 2 ~ 3 스테이플을 (절개의 크기에 따라 다름) 적용하여 절개를 닫습니다. 조심스럽게 기본 근육 stapling 피하기 위해 멀리 마우스 피부를 가져옵니다.
3. 26G3 / 8 바늘을 사용하면 하위 cutaneously 멀리 절개에서 허리에 0.5ml Lactated 링거스를 삽입.
4. 다시는 케이지에 넣어 마우스. 그것이 마취에서 마우스가 수술 사이트와 케이지 침구 간의 접촉을 피하기 위해, 우리에의 측면에 배치해야하는 동안 편안하게 숨을 쉴 수있게되도록합니다. 케이지스는 가열 패드에 배치해야합니다.
5. 마취가 출혈이 가라 앉다을 보장하기 위해 약 기운이 떨어지기 후에 마우스가 모니터링되고 봉합은 폐쇄, 그 생쥐는 사전에 수술의 이동성으로 돌아갑니다.
6. 진통 buprenorphine (0.05-0.1 MG / kg) 다음과 같은 수술 생쥐 한 번 드셔보세요.
7. 장애 쥐가 먹이와 물을 충분한 액세스 권한이 있는지 확인 : 물 병 연장 3.5 인치 spouts과 아르 손으로 먹이로 물 및 / 또는 높은 열량식이 보충제 (Nutri - 칼, Tomlyn)을 도보로 수없는 생쥐가 장착되어 있습니다.

7. 대표 결과 :

원하는 결과를 주사하는 동안 세포 현탁액의 유출의 부족에 의해 및 절차에 따라 척수의 손상 외모로 식별됩니다. 이를 위해, 그것은 laminectomy 동안과 주입하는 동안 마우스의 척추에 밝고 직접 조명을 가지고 중요합니다. 최적의 조명 광섬유 조명 (그림 2A)에 의해 촉진됩니다.

그림 1 - Laminectomy (A) 일단 척추 T9가 solidly 점수 마이크로 가위의 진입을 촉진하기위한 T10와 T11 사이의 메스와 척추 (B, C), Graefe의 집게와 함께 개최됩니다.. (D) 조심스럽게 T10 및 T11 (화살표와 삽입된 페이지, E) 사이의 공간을 통해 마이크로 가위를 슬라이드와 지느러미 라미나을 무료로 각 측면에있는 pedicles (대시, E)를 잘라. (F) rostrally 라미나을 전환하고 잘라.

그림 2. NSCs의 사출. (A) 70 각도로 오른쪽 팔을 왼쪽 팔과 해밀턴 주사기에 연결된 마우스를 쥐고있는 hemostat과 micromanipulator의 일반적인 설정. (B) hemostat는 T8과 T9의 쪽이를 연결하는 spinalis dorsi 근육을 보유. (C) 주사 바늘은 t를 통해 저하됩니다그는 정중선과 중앙 운하에 근위 반대 북반구에있는 회색 물질로.

그림 3. 봉합하고 상처 폐쇄가. (A) 봉합은 절개의 양쪽에있는 표면 근막에 적용됩니다. (B) 절개는 필요에 따라 2-3 스테이 플스 (한 주요 3 필요 상처에 표시)으로 닫힙니다.

토론

잘 실행 이식 세포의주의 laminectomy 및 사출에 주로 힌지 것입니다. laminectomy 중에 피하기 위해 기본 함정은 척수의 손상이다. 이 절차 자체 동안이나 절차에 따라 남아 날카로운 뼈 조각에 의한 손상에 의해 발생할 수 있습니다. 이것을 방지하려면 곡선 마이크로 가위의 포인트는 항상 멀리 코드에서 직면 확인하고 신중하게 모든 뼈 조각이 해제되는 것을 보장하기 위해 laminectomized 척추를 검사하고 나머지 척추 구조가 명백히 튀어나온이나 계단이없는 가장자리 것을.

이전에 언급했듯이 빛을 주사하는 동안 노출된 척수에 밝은 직접 빛나는 경우 유출의 검색이 가능합니다. 유출은 30 게이지 바늘 (33 게이지 비교)과 사출이 너무 빠르게 할 경우 일어날 가능성이 높습니다. 이 프로토콜은 우리에게 좋은 결과를 주신지만, 다른 retracting 바늘 다음 사출 ^8,9에게 전 (최대 5 분) 기간을 기다리고 이상보고있다. 또한, 작은 게이지 바늘이 바람직하지만, 우리는 33 게이지 바늘을 통과하면 일부 세포가 너무 쉽게 lys​​ed 것을 관찰했습니다.

효율을 극대화하기 위해 네 가지 방송국 (마우스를 준비, laminectomy, 사출 및 봉합) 매닝 이식 팀이 바람직합니다. 또한, 각 절차에 대한 타이밍은 세포가 얼음위에 대기하는 시간을 최소화하기 위해 최적화해야합니다. 예를 들어, 우리가 4 (주사기의 각 하중에 복용의 숫자)의 그룹의 마우스를 이식, 세포를 주입 사람이 세 번째 마우스가 laminectomized 후 주사기를로드 시작하고 생쥐를 준비하는 사람은 다음과 마취해야 이전 그룹의 두 번째 마우스 이후 그룹이 laminectomized되었습니다. 각각의 마우스가 약 30-40 분 소요됩니다하더라도 이러한 방법으로, 우리는 약 3 시간 40 마우스로 셀 (또는 제어 미디어) 이식 수 있습니다.

일부 CNS 장애의 치료를위한 세포 대체 요법 ¹⁰ 임상 실험에 있습니다. 이 NSC 이식 및 바이러스성 유도 demyelination MS의 중요한 모델의 사용을 용이와 생쥐의 척수 코드에 NSCs의 engraftment위한 프로토콜의 생체내 모델에 대한 대체가없고 쉽게 다른 모델로 적용할 수 있습니다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
시약 / 장비 이름	회사	카탈로그 번호	댓글 (옵션)
Ketaject	피닉스 Parmaceuticals	NDC 57319-542-02
Xylazine 하이드로 클로라이드	MP의 Biomedicals	158307
나이르	처치 & 드와이트 (주)
10  μl 해밀턴 주사기 W / 이동식 바늘	해밀턴 회사	7635-01
해밀턴 바늘, 30G 또는 33 G, ½ 인치, 30 ° 사각	해밀턴 회사	7803-077803-05	사용할 수있는 최고의 게이지를 확인하기 위해 바늘을 통해 통로를 따라 당신의 세포의 생존을 테스트
마이크로 가위	세계 정밀 계측기	555500S
소형 Graefe의 포셉	FST	11053-10
Stereotaxic	KOPF 인 스트 루먼트	모델 1772 유니버셜 홀더
Stereotaxic	KOPF 인 스트 루먼트	모델 1773 전극 홀더
Stereotaxic	KOPF 인 스트 루먼트	모델 902 작은 동물 stereotaxic
Stereotaxic	KOPF 인 스트 루먼트	모델 960 왼쪽 전극 캐리어
봉합	Ethicon	95057-064
Lactated 링거스	Hospira	NDC 0409-7953-03
스테이 플스	파인 과학	12032-07
Hemostat	FST	13010-12
Scalpels, 크기 10,11	어부	268878, 268879
봉합	ETHICON	1676G	크기 5-0, 3 / 8 "원형, 19mm 바늘, 45cm 꼰 스레드
리플렉스 7 상처 클립 작은 주걱	FST	12031-07
7mm 리플렉스 상처 클립	FST	12032-07
올센 - 헤거 니들 홀더	FST	12502-12