ויזואליזציה של דנ"א רקומביננטי ו קומפלקסים חלבונים באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי

Summary

כוח הקשה במצב מיקרוסקופ אטומי (AFM) שיטת הדמיה של פלסמיד דנ"א, חלבונים cytoplasmic, ו-DNA-חלבון מתחמי מתואר. השיטה כוללת גישות חלופיות להכנת דגימות הדמיה AFM בעקבות מניפולציה ביוכימית. ה-DNA המכיל אזורים ספציפיים אינטראקציה חלבון שנצפה כמעט פיזיולוגי התנאים חיץ.

Abstract

מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) מאפשר הדמיה של חלבונים בודדים, מולקולות דנ"א, חלבונים קומפלקסים, ו-DNA-חלבון קומפלקסים. בצד של שלוחה של המיקרוסקופ היא בדיקה בקנה מידה ננו, אשר חוצה אזורים בתמונה החל ננומטר עד מיקרומטר, מדידת גובה של מקרומולקולות נחים על פני המצע בכל נקודה נתונה. כוחות אלקטרוסטטיים לגרום חלבונים, שומנים, וחומצות גרעין כדי רופף לצרף המצע של אוריינטציות אקראי היתר הדמיה. הנתונים שנוצר דומה מפה טופוגרפית, שם מקרומולקולות לפתור כמו תלת מימדי חלקיקים בגדלים בדידים (איור 1) ^1,2. במצב הקשה AFM כרוך תנודה חוזרות ונשנות של שלוחה, המאפשרת הדמיה של biomaterials רכים יחסית כגון דנ"א וחלבונים. אחד היתרונות הבולטים של AFM על אחרים שיטות מיקרוסקופיה ננו ההסתגלות היחסי לדמיין חלבונים בודדים ומתחמים מולקולארית מאגרים מימית, כולל כמעט פיזיולוגי התנאים שנאגרו, בזמן אמת, ללא כתמים או ציפוי המדגם להיות צילמו.

השיטה המוצגת כאן מתארת ​​את הדמיה של דנ"א גורם שעתוק immunoadsorbed (כלומר, הקולטן glucocorticoid, GR) בתמיסת בופר (איור 2). חלבונים Immunoadsorbed ו קומפלקסים חלבונים ניתן להפריד immunoadsorbing נוגדנים חרוז גלולה על ידי תחרות עם epitope את הנוגדן הדמיה אז (איור 2 א). זה מאפשר מניפולציה ביוכימית של ביומולקולות עניין לפני הדמיה. מטוהרים פעם, דנ"א וחלבונים יכול להיות מעורבת המורכבת אינטראקציה כתוצאה ניתן הדמיה גם כן. עקידת דנ"א מיקה דורש קטיון divalent ^3, כגון ניקל או ^{2 +} Mg ^{2 +,} אשר ניתן להוסיף מאגרים מדגם עדיין לשמור על פעילות החלבון. שימוש בגישה דומה, AFM נוצל לדמיין אנזימים נפרדים, כולל RNA פולימראז ⁴ ו - אנזים תיקון ^5, חייב גדילי דנ"א בודדות. ניסויים אלו מספקות תובנה משמעותית לתוך חלבונים ושל אינטראקציות חלבון דנ"א biophysical המתרחשים ברמה המולקולרית. חלקיקים הדמיה macromolecular הפרט עם AFM יכול להיות שימושי לקביעת הומוגניות החלקיקים לזיהוי הסדר הפיזי של הרכיבים המרכיבים של חלקיקים הדמיה. בעוד השיטה הנוכחית פותחה עבור להדמיה של GR-המלווה קומפלקסים חלבונים ו-DNA גדילי ^1,2 אשר GR יכול להיקשר, זה יכול להיות מיושם באופן נרחב ל-DNA הדמיה דגימות חלבון ממגוון רחב של מקורות.

Protocol

1. הכנת דגימות דנ"א וחלבון להיות צילמו ללא מזהמים

1. בודד ביומולקולות להיות צילמו ומניחים חיץ מימית מתאים. חלבונים להיות צילמו ניתן יהיה לטהר באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית ^6, ואחריו immunoadsorption על ידי הסרה של נוגדנים ואת גלולה ^1,2, או טיהור Profinity המדויק והסרת תג ⁷ (איור 2 א). לבודד מולקולות דנ"א להיות צילמו על ידי טיהור miniprep (2B איור).
2. אישור הרכב וטוהר של דגימות חלבון להיות צילמו באמצעות SDS-PAGE ומערב סופג. עבור ה-DNA, לאשר רצף וטוהר ידי השלמת הגבלה לעכל ג'ל אלקטרופורזה agarose.
3. דגירה דגימות ספיחה AFM חיץ כדי לקדם את הדבקות של המדגם כדי מיקה. לקבלת דוגמיות חלבון, 10 mM HEPES חיץ עשוי לשמש. נוסף נמוך מלחים יוניים כוח או cofactors אחרים ניתן להוסיף גם כן. עבור דגימות DNA, כוללים קטיון divalent (למשל Mg ^{2 +} או Ni ^{2 +)} כדי לקדם ספיחה למצע מיקה. מתאים Mg ^{2 +} המכיל מאגר של DNA הוא 10 mM טריס, pH 7.5, 10 mM NaCl, 2 מ"מ MgCl ₂ ^3. Ni חלופה ² חיץ ⁺ הוא HEPES 10 מ"מ, pH 6.8, 10 mM NiCl _2.
4. לדלל את המדגם כדי בריכוז של 5 מיקרוגרם / מ"ל ​​במאגר ספיחה. לערבב בעדינות. חנות על הקרח בעוד מיקרוסקופ מכינים.

2. הרכבה AFM בדיקה

1. המקום בעל נוזל התא בדיקה על גבי שלוחה תחנת עגינה המתאימה להתקנה.
2. אתר את שלוחה ארוכה ועבה (המכונה שלוחה 'ב') של בדיקה חד מנוף (SNL) ניטריד לשמש הדמיה. בזהירות להעביר אותו בעל תא נוזל בדיקה, להבטיח כי קצה נשאר זקוף. הערה טכנית: טיפול אקסטרים חייב להיות משולם תוך בדיקה נמצא במעבר, כמו להפיל אותו מגובה כלשהו עלול לגרום נזק או להרוס את שלוחה או טיפ. SNL microlever (MSNL) בדיקה עשוי לשמש כאלטרנטיבה לחקור את SNL.
3. הסר את מחזיק בדיקה מתחנת העגינה ולבחון את שלוחה תחת מיקרוסקופ אור כדי להבטיח שהוא שלם יושב כמו שצריך בעל תא נוזל בדיקה.
4. הסר בזהירות את הראש AFM מ הרכבה להשתלב מכשיר על ידי הידוק בורג המחורצים מהדק את הראש. הערה טכנית: טיפול אקסטרים חייב להיות משולם תוך מניפולציה של ראש AFM, כמו להפיל אותו אפילו ממרחק קצר (למשל, אם לא יושב כראוי באסיפה להשתלב) עלול לגרום נזק משמעותי.
5. היפוך ראש AFM ובתקיפות לדחוף את נוזל בעל תא החללית על ארבע סיכות בבסיס הראש AFM. בזהירות להחזיר את הראש AFM לתוך הרכבה להשתלב מכשיר. שחרר את הבורג המחורצים מהדק ראש להדק את הראש AFM לתוך המכשיר.

3. איתור קצה שלוחה, יישור לייזר, והתאמת photodetector

1. שימוש בתוכנת המכשיר AFM, לאתר את קצה שלוחה ידי הזזת ידיות של מיקרוסקופ אור המשולב. כוון את התאורה של המיקרוסקופ אם יש צורך לשפר את הזיהוי קצה. תביא סוף קצה שלוחה לתוך בסמיכות של הכוונת המוצג על התוכנה במכשיר.
2. תביאו את קצה שלוחה אל המוקד באמצעות התאמת בחצים מעלה ומטה של ​​הבקר אופטיקה על התוכנה. השתמש איטי (S) או (ז) במהירות בינונית תוך התאמת אופטיקה.
3. יישר את הלייזר על קצה שלוחה באמצעות התאמת ידיות לייזר. הזיזו את ידיות הסתגלות עד נקודה אדומה הלייזר בתוך במקום תאורה לבנה. מעקב לאורך הזרוע שלוחה באמצעות דפוס זיג זג עד הלייזר ממוקם על קצה שלוחה. כאשר מיושר כראוי, נקודה השתקפות חזקה יופיע החלון הקדמי של הראש AFM.
4. המרכז photodetector ידי התאמת ידיות photodetector על הראש AFM. זה יהיה ליישר את נקודה לייזר על הכוונת של התצוגה photodetector של התוכנה במכשיר. סכום אות נצפתה צריך להיות כ 4-6.

4. מיקום AFM ראש שלוחה כוונון

1. הנח גיליון ביקע טרי נציץ המצורפת לדיסק הדגימה מתכת AFM על בעל מדגם ממוגנטים על גבי צלחת בעל AFM. ההתקנה זה ישמש לתפקיד ראש AFM לפני הדמיה דגימת DNA או חלבון מוכן בשלב 1.
   1. הערה טכנית: בעל מדגם ממוגנטים מחזיק נוזל בדיקה תא עבה יותר מדגם אחר לחיזוק מנגנוני ובעלי בדיקה. אם יש כיום אישור מספיק בין הרכבה מיקה מדגם בעל הראש AFM, להזיז את הראש AFM על ידי בחירת סמל לסגת על תוכנת המכשיר מספר פעמים.
2. סובב את הלוח בעל AFM כך את הדיסק הדגימה ממוקם הדמיה הראשונית. ודא את המצע מיקה מרוכז תחת הראש AFM.
3. הזז את הראש כלפי מטה AFMפני השטח של הדיסק מיקה הדגימה באמצעות משטח מוקד השליטה של ​​התוכנה במכשיר. בחר (M) בינונית מהירות על המנוע Z, ולהמשיך לכיוון פני המים עד הראש AFM הוא כ 2 מ"מ מעל מיקה. בשלב זה, לעבור להשתמש במהירות איטית (S) Z מנוע כדי להימנע ממגע פתאומי בין החללית לבין המשטח (המכונה מתרסק קצה).
4. המשך להזיז את החללית קרוב לפני השטח המצע מיקה עד הייחודיות על פני השטח מיקה או השתקפות קצה הם בפוקוס. מעבר בין פני השטח השתקפות קצה מטוסים באמצעות מוקד "להתמקד:" הסמל של התוכנה במכשיר.
5. בחר את סמל מנגינה מתוך התוכנה המכשיר לכוון את שלוחה. תדר התהודה של SNL מומלץ בדיקות MSNL שלוחה היא kHz 20-60. בחר לשיא של 5% לקזז. הערה טכנית: כוונון שלוחה נאותה חיונית הדמיה דגימה מספקת.

5. הדמיה מיקה פני השטח מדגם

1. Engage את החללית על פני השטח מיקה. הגדרת גודל הסריקה הראשונית עד 10 מיקרומטר וקצב סריקה הרץ 1. רווח אינטגרל ולהשיג יחסי ניתן להגדיר תחילה 0.2 ו - 0.4, בהתאמה. התאם רווחים לפי הצורך כדי שיהיה זכר וסריקות לשחזר בערך חפיפה. הקטנת setpoint משרעת יגדיל את האינטראקציה בין החללית לבין מיקה ולהבטיח מעורבות.
2. צלמו תמונות סריקה מלאה של השדה 10 מיקרומטר. הקטנת גודל סריקה עד 5, 1, ו - 0.5 מיקרומטר ו ללכוד תמונות שלם של כל שדה. התאם רווחי וקצב סריקה לפי הצורך. לכידת תמונות של פני השטח מיקה מספק הבסיס לעומת ה-DNA ואת החלבונים המכילים דגימות.
3. לנתק את החללית בלחיצה אחת על אייקון לנתק את התוכנה על המכשיר.

6. הדמיה של ביומולקולות עניין

1. לערבב בעדינות את ה-DNA או דגימת חלבון מוכן בשלב 1 ולהכין לטעון אותו על פני השטח מיקה הדמיה. מערבבים 5 μl של המדגם מוכן עם 45 μl של חיץ ספיחה טרי (ריכוז המדגם הסופי = 0.5 מיקרוגרם / מ"ל).
2. בזהירות להוסיף 50 μl של 0.5 מיקרוגרם / מ"ל ​​פתרון biomolecule המכילים ישירות על גבי המשטח מיקה. האם זה מבלי להזיז את הראש או בדיקה AFM, ולהבטיח את הפתרון מדגם (אך לא קצה pipet) יוצר קשר עם החללית.
3. 5 דקות הפסקה כדי לאפשר ביומולקולות במדגם לדבוק פני השטח מיקה.
4. בתום 5 דקות, pipet μl נוסף 50-100 של חיץ ספיחה לתוך בעל תא נוזל בדיקה נזהר שלא לגעת בדיקה, ראש AFM, או מיקה עם קצה pipet. זה יהוו המניסקוס ולאפשר AFM הקשה הדמיה במצב נוזל. איור 3 מראה את ההסדר הסופי של התא שלוחה נוזל, לדוגמה, בעל המדגם, המניסקוס.
5. כוונו את photodetector ויישר מחדש את לייזר שלוחה לפי הצורך. הערה טכנית: צפייה קצה בדיקה ויישור הלייזר הוא מסובך עקב דיפרקציה הדפוס הנגרמת על ידי הוספת מאגר מדגם לתוך מחזיק בדיקה. ידנית retune שלוחה, במידת הצורך.
6. Re-לעסוק בדיקה באמצעות כלי תוכנה. התאמת הטיה אנכית, רווח נפרד, ולהשיג יחסי לפי הצורך. זה יהיה להתחיל את התהליך מחדש הדמיה בסעיף נציץ סרוקים מיד לפני הוספת מדגם ותמונות ללכוד.
7. הגדלת גודל סריקה (500 ננומטר-10 מיקרומטר) כדי לזהות אזורים של עניין. זום פנימה להפחית את קצב הסריקה הרץ 0.5 כדי לשפר את רזולוציית התמונה
8. לאחר הדמיה תושלם, לנתק את החללית על ידי בחירת לסגת סמל התוכנה במכשיר מספר פעמים. ודא אישור מספיק בין ראש AFM ו דיסק הדגימה לפני פירוק התא נוזל או דיסק הדגימה.
9. לשטוף ביסודיות את תא נוזל בדיקה מחזיק ואת הדיסק הדגימה עם מים מזוקקים כדי למנוע גבישי מלח מ טביעה כמו שיורי מתאדה ספיחה חיץ. יבש עם אוויר דחוס.

7. נציג תוצאות:

דוגמאות של תמונות AFM מוצגים באיור 4. המצע מיכה (א) מספק משטח שטוח מולקולרי אשר על דנ"א וחלבון יכול לספוג. הדמיה מיקה לפני דגימות biomolecule מספק בקרה הערכה שלילית של רעש הדמיה. הוא גם מספק רמה של ביטחון כי שלוחה מכוון כראוי הדמיה מדגם הבאות יהיה מוצלח. פעמיים גדילי הדנ"א פלסמיד (B, D), supercoiled מתיימר, מזוהה בקלות על ידי מראה סימטרית שלה הפקדת אחיד על פני המצע מיקה ייחוד בעבר. קומפלקסים חלבונים בגדלים החלקיקים דיסקרטי (C, E) גם להבחין ייחודי מן המצע מיקה. ההבדלים בגודל החלקיקים עולה הטרוגניות המדגם, יכול להיות שימושי כדי קירוב stoichiometry חלבון מורכב או פעילות ביוכימית. הצורה אלכסונית בכלל אוריינטציה עקבית של הפרוחלקיקים טיין נצפתה בלוח C הוא חפץ הדמיה, כמו חלבונים היה כצפוי להיות מונחה על פני המצע מיקה באופן אקראי. גורמים אפשריים של החפץ הנצפה הוא פיזי קצה חריגות או AFM הדמיה מהירה מדי של שער סריקה. בעוד קונבולוציה קצה (מאויר ב 1B איור) מונע מוחלט מדידה חישובים באורך של x ו-y צירים, מדידת הגובה (ציר z) x ו-y יחסית המדידות עשוי להיות שימושי בכל זאת להערכת מאפייני biophysical של ביומולקולות הדמיה.

איור 1: מצגת סכמטי של כוח אטומי במצב הקשה מיקרוסקופית (AFM). , את המיקרוסקופ. בסוף שלוחה הוא קצה חד נעה מעלה ומטה כמו סריקות על פני השטח של מצע מיקה אשר מתחמי לספוג biomolecular. כאשר הסורק עובר בכיוונים x ו-y, קרן לייזר משתקף מהחלק האחורי של שלוחה אל גלאי רגיש, עמדה photodiode למפות את המרחק האנכי (z) טיפ עובר כשהוא עובר על מתחמי biomolecular יושב על מיקה. ב עיוות של התמונה בכיוונים x ו-y הנגרמת על ידי קונבולוציה קצה. רדיוס הנקוב של טיפ סיליקון קונבנציונלי ניטריד הוא גדול יותר מאשר החלקיקים להיות צילמו, לבין קצה המגעים קצה מדגם כפי שהוא חוצה את פני השטח. קונבולוציה עצה תוצאות חלקיקי צילמו המופיעים גדול ב x ו-y כיוונים, אבל לא בכיוון z. השפעה זו ניתן למזער על ידי שימוש טיפים עם רדיוס קטן טיפ הנומינלי.

איור 2: איור של חלבון immunoadsorbed מדגם הכנה DNA. שחרור, של GR immunoadsorbed • חלבון מורכב מ hsp70 בנוגדן (מב), חלבון A-Sepharose (PAS) גלולה. דוגרים immunopellet עם פפטיד המכיל את epitope MAB יקל על שחרורו של GR • חלבון מורכב hsp70 מן גלולה, המאפשר מורכבים להיות שנאסף supernatant ו דמיינו ידי AFM. B, הכנת DNA עבור הדמיה AFM מחייב שימוש קטיון divalent ספיחה חיץ. קטיון divalent מגביר את הזיקה של ה-DNA של המצע מיקה.

איור 3: הסדר סופי של הראש AFM, מחזיק נוזל בדיקה התא, לדוגמה, בעל הדגימה, ואת המניסקוס חיץ. טיפול, יש לנקוט בעת הפקדת מדגם חיץ נוסף על המצע מיקה, כדי למנוע מגע פיזי בין קצה pipet וראש AFM, קוראים נוזל, המצע מיקה. ב ', הגדלה של א המניסקוס המאגר משתרע מדיסק הדגימה את בעל תא נוזל בדיקה.

איור 4: micrographs כוח אטומי המצע מיקה (A), 2xGal4-2xGRE luciferease-DNA פלסמיד ⁸ (B, D), ו - GR • קומפלקסים חלבונים hsp70 (C, E) בתמיסה שנאגרו. מיכה משמש דימוי בקרה להשוות עם חזותיים של דנ"א וחלבון. GR • קומפלקסים חלבונים hsp70 הוכנו על ידי immunoadsorption של GR ישפעו hsp70 ולאחר מכן שוחרר מן גלולה את הנוגדן-חרוז באמצעות נוגדן MAB מתחרים (באיור 2 א). ה-DNA הוכן על ידי miniprep פלסמיד קונבנציונאלי. לוחות A, B ו-C הם של הגדלה מקבילה (ברים בקנה מידה = 200 ננומטר), כמו גם לוחות D ו-E (מוטות סולם = 40 ננומטר).

Discussion

AFM מספק שיטה מיקרוסקופית ייחודי המסוגל ביומולקולות הדמיה בודדים ללא ציפוי בפתרונות שנאגרו מימית כמעט פיזיולוגיים בזמן אמת. זה מאפשר הדמיה של חלבונים בודדים מולקולות דנ"א, כמו גם מתחמי multiprotein ו-DNA חלבון קומפלקסים. חלקיקים הדמיה macromolecular עם AFM יכול להיות שימושי להערכת ההומוגניות מדגם לזיהוי הסדר הפיזי של הרכיבים המרכיבים של החלקיקים שנצפו. גישה זו של התבוננות macromolecular חלקיקים בודדים יכולים להיות תוספת שימושית טכניקות ביוכימיות קונבנציונליים, כגון מבחני immunoprecipitation, ג'ל אלקטרופורזה polyacrylamide, והדרה גודל עמודה כרומטוגרפיה, המספקים נתונים מסכמת משמעותי המייצג את 10 -10 ^{11 3} מתחמי biomolecular בודדים עניין להציג במדגם.

מחקר לתוך stoichiometry multiprotein מורכבים, אינטראקציות biomolecular, ודרישות cofactor יכול כל להיחקר באמצעות AFM. השיטה המוצגת כאן ניתן להתאים להתאים biophysical שאלות ספציפיות של עניין. לדוגמה, באמצעות תא נוזל בדיקה בעל יכולת החלפת החיץ, הוא ניתן cofactor דרישות assay להיווצרות חלבונים מורכבים. ה-DNA חלבון אסיפות יכול להיווצר ו ניתק בשנת ליד בזמן אמת, ואפילו תוך הדמיה. הדנ"א יכול להיות שנוצר עם רצפים מסוימים של עניין (לדוגמה, אלמנטים בתגובה משוערת או חלבון רומן רצף מחייב), מעורבב עם החלבון מחייב שיערו, הדמיה לספק עדות ישירה של אינטראקציות מולקולאריים.

במצב הקשה AFM הדמיה באופן משמעותי פחות מסובך אם דגימות יבש מנוצלים ולא דגימות תמיסות מימיות, ועומד DNA ליניארי וסגר מעגל פלסמידים DNA יש שני כבר צילמו בדרך זו ^3,9. השיטה המוצגת כאן מנצל דגימות שנאגרו פתרונות על מנת לספק סביבת הדמיה פיזיולוגית יותר. שיטות אחרות לציין של חלבונים הדמיה צריך להיות גם נחשב, לרבות בתחום האינפרא אדום הקרוב מיקרוסקופיה ^10. השימוש משלימים של immunoadsorption בשיתוף פעולה עם AFM מספק הזדמנות להכין מספר עצום של קומפלקסים חלבונים, באמצעות ומבוססת טכניקות ביוכימיות, ולאחר מכן לדמיין אותם לאחר שחרורו מן immunoadsorbing נוגדנים חרוז גלולה. לדוגמה, GR immunoadsorbed כבר assayed על הקשר שלה עם החלבון המלווה המולקולרי hsp70 ^1, כמו גם את החלבון מנוע dynein ² שימוש בגישה זו כדי להעריך גודל מורכבים stoichiometries. גודל החלקיקים ותכונות biophysical (קשיחות למשל) כבר שימושי לוודא את זהותו של ביומולקולות נצפתה בדגימות AFM הדמיה ^11,12. אפשר גם לאשר זהות biomolecule על ידי תוספת של biomolecule אינטראקציה (לדוגמא ליגנד או נוגדן חד שבטי), זה היה לאגד היעד שלה לגרום לעלייה גודל החלקיקים אם biomolecule היעד הוא ההווה.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם מגיב	חברה	מספר קטלוגי
Dimension 3100	Bruker	Dimension 3100
נוזל המימד Cell	Bruker	DTFML-DD-HE
ניטריד מנוף שארפ (SNL) סיליקון ניטריד AFM בדיקה	Bruker	SNL-10
Microlever ניטריד מנוף חדה (MSNL) סיליקון ניטריד AFM בדיקה	Bruker	MSNL-10
NanoScope AFM כלי תוכנה	Bruker	004-132-000
מתכת AFM דיסקים הדגימה	טד פלה	16208
כיתה V1 מיכה דיסקים, 12 מ"מ	טד פלה	50-12