ניתוח מורפולוגי של תסיסנית הזחל היקפיים Neuron דנדריטים חושי האקסונים באמצעות פסיפסים גנטי

Summary

Arborization הנוירונים הדנדריטים חושית של תסיסנית הזחל מערכת העצבים ההיקפית הם מודלים שימושי להבהיר הן בכלל נוירון מעמד ספציפי מנגנוני התמיינות נוירון. אנו מציגים מדריך מעשי ליצור ולנתח הדנדריטים נוירון arborization פסיפסים גנטית.

Abstract

התפתחות מערכת העצבים מחייב את המפרט הנכון של נוירון עמדה וזהות, ואחריו התפתחות דנדריטים מדויק בכיתה ספציפית נוירון וחיווט axonal. לאחרונה הדנדריטי (DA) arborization עצב סנסורי של המערכת תסיסנית הזחל העצבים ההיקפית (PNS) הפכו מודלים גנטי חזק שבו להבהיר שני מנגנונים כלליים בכיתה ספציפית של בידול נוירון. ישנם ארבעה הראשי התובע כיתות נוירון (I-IV) ^1. הם שם לפי סדר המורכבות הגוברת סוכת דנדריט, יש מעמד ספציפי ההבדלים בשליטה הגנטי של בידול שלהם ^20-10. המערכת החושית התובע הוא מודל מעשי לחקור את המנגנונים המולקולריים מאחורי שליטתה של מורפולוגיה הדנדריטים ^11-13 כי: 1) הוא יכול לנצל את הכלים גנטי חזק זמין זבוב הפירות, 2) התובע דנדריט נוירון סוכת פורשת רק 2 מימדים מתחת אופטית CLEלציפורן ar הזחל ולכן קל לדמיין עם רזולוציה גבוהה in vivo, 3) את המגוון בכיתה ספציפית במורפולוגיה הדנדריטים מאפשרת ניתוח השוואתי למצוא אלמנטים מרכזיים שליטה על היווצרות של עצים דנדריטים פשוט מול מסועפת מאוד, 4) סוכת הדנדריטים סטריאוטיפיות צורות שונות של נוירונים התובע להקל על ניתוחים סטטיסטיים morphometric.

פעילות התובע נוירון משנה את הפלט של גנרטור דפוס הזחל מרכזי תנועה ^14-16. שונה התובע כיתות נוירון יש שיטות שונות חושית, והפעלה שלהם מעוררת תגובות התנהגותיות שונות ^14,16-20. מעמדות שונים ועוד לשלוח תחזיות axonal סטריאוטיפי לתוך מערכת הזחל תסיסנית מרכזי העצבים בחוט עצב הגחון (VNC) ^21. תחזיות אלו לסיים עם ייצוגים הטופוגרפי של מודליות הן התובע נוירון חושי את המיקום בקיר גוף השדה הדנדריטים ^7,22, 23. לפיכך, בחינה של תחזיות התובע axonal יכול לשמש כדי להבהיר המנגנונים מיפוי טופוגרפי ^7,22,23, כמו גם את החיווט של תנועה הזחל פשוט ויסות מעגל ^14-17.

אנו מציגים כאן מדריך מעשי ליצור ולנתח פסיפסים גנטי ²⁴ נוירונים סימון התובע באמצעות MARCM (ניתוח פסיפס עם מרקר תא Repressible) ^1,10,25 ו Flp-out ^22,26,27 טכניקות (מסוכם באיור. 1).

Protocol

1.Preparation של ריאגנטים

1. הכן Ca ^{+ +} ללא HL3.1 מלוחים ^28.
   1. במ"מ: 70 NaCl, KCl 5, 20 MgCl _2, 10 NaHCO _3, 5 HEPES, 115 סוכרוז, ו 5 trehalose; pH 7.2. סנן לעקר ולאחסן ב 4 ° C.
      הערה: Ca ^{+ +} ללא פתרון המונע התכווצות שרירים במהלך לנתיחה.
2. הפוך את פולי-L-ליזין (PLL) coverslips.
   1. ממיסים 100 מ"ג PLL במים 4.2ml ולעשות aliquots 300μl צינורות Eppendorf ולהקפיא ב -20 ° C.
   2. לפני coverslips ציפוי, להפשיר הראשונה בה aliquot, ולהביא אותו עד 10 מ"ל ב DDH ₂ O ולהוסיף 20μl של Kodak Photo-פלו; ריכוז PLL הסופית היא 0.7 מ"ג / מ"ל.
   3. Coverslips לצלול עבור 30mins בפתרון PLL, להסיר ויבש, ולאחר מכן לשטוף עם מים לזמן קצר ויבש. חזור פעמיים. המטופלים coverslips האחרון כחודש.

2. חוצה גנטית

1. To ליצור שיבוטים MARCM. הנה דוגמה לחצות באמצעות הנהג הפאן התובע ^11,27:
   FRT2A x hsFLP; Gal4 ^{109 (2) 80,} כטב"מ-mCD8: ה-GFP, גיגית, Gal80 FRT2A/SM5-TM6B
2. כדי ליצור Flp-out שיבוטים. הנה דוגמה לחצות באמצעות הנהג IV ספציפיים בכיתה ^8:
   פ.פ.ק. Gal4 x-YW, hsFLP; כטב"מ-FRT-CD2, y ^{+-stop-FRT-mCD8:} GFP

3. אוסף של עוברים

1. שמור חוצה תסיסנית בבקבוק אוסף של 25 ° C ו לאסוף עוברים על התפשטות אגר מיץ תפוחים ²⁹ צלחת בשכבה דקה של ממרח שמרים ^30,31.

4. הלם חום טיפול של עוברים

1. מניחים צלחת ריקה בניגוד צלחת אגר מיץ תפוחים שעליו עוברים נקבעו. חותם סביב אלה שתי צלחות עם Parafilm (איור 2).
2. במהלך הלם חום, לצלול הצלחת דואר באמבט מים והחזק אותו באמצעות משקולת מתכת.
3. עבור עוברי MARCM
   1. איסוף עוברים 2h ו דגירה בצלחת פטרי 10 ס"מ מוקף לחלח ברקמות של 25 מעלות צלזיוס במשך 2h נוספים.
      הערה: התאמת פרוטוקול הלם החום משנה את התדירות שבה הם שיבוטים שנוצרו.
   2. במשך מספר קטן יותר של שיבוטים, מכוון נוירונים בודדים בודד, לצלול הלם החום באמבט מים 1h ב 38 ° C.
   3. עבור מספר גדול יותר של שיבוטים, הלם חום עבור 45mins ב 38 ° C, ולשחזר את 30mins RT, אז הלם החום שוב 30mins נוספים.
4. איסוף Flp-out עוברים 24 שעות, ו הלם החום 1h ב 38 ° C.

5. הקרנת עבור שיבוטים

1. אחרי ההלם חום, להסיר את המכסה של ההסדר האטומה למים והמקום צלחת אגר מיץ תפוחים בצלחת פטרי 10 ס"מ מוקף ברקמות לחלח. התרבות עוברים הזחלים לאחר מכן ב 25 ° C עד לנדודing 3 ^rd instar.
   הערה: התנאים תרבות, במיוחד תזונה, הוכחו לשנות התובע הדנדריטים מורפולוגיה סוכת ^32,33. ודא כי הזחלים גדל גישה להדביק שמרים בכל עת, לפקח לחדש את השמרים להדביק כנדרש.
2. מנקודה זו ואילך בפרוטוקול, לתמרן בעדינות באמצעות מלקחיים זחלי חרקים.
3. בקצרה בעדינות ולשטוף את הזחלים במי ברז ולאחר מכן מקום לצלחת אגר.
   הערה: צעד זה מפחית את הקרינה רקע אוטומטי מהמזון או לכלוך על פני הזחל.
4. בחן את הזחלים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי חזק לנתח. זיהוי הזחלים עם GFP חיובי נוירונים / תאים בדופן הגוף.

6. הדמיה in vivo של דנדריטים

1. מניחים את הזחל לתוך כוס שקופית דיכאון עם טיפה קטנה של גליצרול 80%. מניחים coverslip בשקופית כדי לשתק את הזחל. ודא כי לא נותר אוויר בין הזחל לבין coversliעמ '
2. דחף בעדינות את coverslip לגלגל את הזחל כדי לאפשר ויזואליזציה של הנוירון של עניין. תמונת mCD8: GFP שכותרתו סוכת הדנדריטים באמצעות מיקרוסקופיה confocal.

7. הזחל לנתיחה

הערה לפני שמתחילים: התובע דנדריטים נוירון לבזות במהירות לאחר תחילתו של דיסקציה. לנתח כל זחל בודדים פחות 5min כדי להבטיח מורפולוגיה דנדריט טוב.

1. לנתח נדודים 3 ^rd הזחלים instar על צלחת Sylgard כפי שתואר לעיל ³⁴ בשינויים הבאים:
   1. עבור הדמיה של התובע נוירון האקסון טרמיני, להבטיח כי מערכת העצבים המרכזית הוא שלם את העצבים סגמנטלי לא שבורים. לאחר פתיחת זחלים, תחילה בזהירות לחתוך את הקשרים קנה הנשימה אל הקיר הגוף ואז בעדינות להסיר את הבטן כולה.
   2. אם הדמיה דנדריטים לבד, להסיר את מערכת העצבים המרכזית לאפשר להחמיא גובר.

8. Fixatיונים חסימת פילה הזחל

1. עם הזחל ניצח עדיין הצלחת Sylgard, לתקן את זה PFA 4% PBS עבור 20mins ב RT על שייקר בעדינות מסתובב.
2. הסר עקבות של רקמות הזחל (שומן הגוף, הנשימה וכו ') לאחר קיבוע.
3. לשטוף ב PBST (PBS עם 0.1% טריטון X-100) 10mins 3x על צלחת Sylgard ו שייקר. אם בוחנים Termini האקסון, לשמור על פילה בצלחת Sylgard. (אם דנדריטים מכתים אפשר להעביר את פילה הזחל אל צינור 0.5 מ"ל בשלב זה ³⁴⁾
4. חסום את הזחלים עבור 20mins ב RT ב 5% נורמלי חמור בדם (NDS) ב PBST על שייקר.

9. הכתמה של פילה הזחל

1. הסר את פתרון חסימת דגירה של הנוגדן הראשוני (ב 5% NDS / PBST) לילה ב 4 מעלות צלזיוס במיכל פלסטיק קטן מוקף לחלח רקמות.
2. הסר את הצינורות מתוך 4 ° C ו דגירה שעה נוספת ב RT.
3. לשטוף 10mins 6x ב PBST. מוסיפים את antib משניody (ב 5% NDS / PBST), ומכסים על מנת למנוע צילום הלבנת fluorophore ^34.
4. דגירה או ב RT במשך שעתיים, או לילה ב 4 ° C ואחריו שעה אחת ב RT.
5. שטפו את 10mins הזחלים 6x ב PBST והמשך גובר.

10. הרכבה של פילה הזחל לבדיקה של סוכת דנדריט

1. הר כל פילה הזחל ישר ככל הניתן באמצעות מספריים או אזמל מנתחים לנתק את הראש (כולל ווים הפה), ואת האחורי (כולל spiracles) ^34.
2. מניחים את פילה הזחל בשקופית לציפורן בצד למטה, לעלות ב 80% גליצרול ו לאטום את הצדדים של coverslip עם לק על "מהיר" הר ^34.
3. עבור הרכבה קבוע תמונה ברורה יותר
   1. מניחים את פילה גזור הזחל שרירים בצד למטה על ירידה של PBS על coverslip PLL, זה יהיה מהר לדבוק coverslip.
   2. הסר כנוזל רב ככל האפשר לאחר הרכבה, however לא לאפשר לו להתייבש לחלוטין.
   3. קח את coverslip (עם פילה הזחל המצורפת) באמצעות סדרה אתנול: אתנול 35%, ואחריהם 50%, 70%, 95% ו 100% אתנול 2x בסופו של דבר כל אחד במשך 10 דקות (את פתרון 2 100% EtOH צריך להיות שונה לעיתים קרובות ;) סוף סוף, לשטוף 2-3x 10mins ב קסילן.
   4. שים טיפת DPX mountant (קסילן Distyrene plasticizer) בשקופית נקי בזהירות להניח את coverslip פילה בצד למטה למעלה. שמור בחושך, ולהמתין יום אחד עבור DPX להגדיר לפני הדמיה.

11. הרכבה של פילה הזחל לבדיקה של Termini האקסון

1. שמור את העצבים סגמנטלי רץ בין PNS ו CNS ללא פגע במהלך קיבעון לנתיחה, והכתים כדי לאפשר מעקב של אקסונים מן הפריפריה גוף תא עצב תחושתי על VNC.
2. הר כל הזחל פילה לציפורן בצד למטה גליצרול 80% שקופית דיכאון. עקוב אחר אקסונים מגוף התא אל התובעVNC תחת מיקרוסקופ confocal. הערה: PNS הנוירונים בכל פרויקט קיר גוף קטע לקטע מאותו מקור של VNC.

12. נציג תוצאות:

תוצאות נציג מוצגות דמויות 3-5. איור. 3 מציג את סוכת שלמה של IV בכיתה דה נוירון, שנתפסו in vivo תחת מיקרוסקופ confocal. איור. 4 מראה תקריב של חלק סוכת דנדריט של המעמד השלישי שכותרתו immunohistochemically נוירון כי תוקנה כראוי כדי לשמור על המורפולוגיה. הבלעה הקשורים מציגה את השפלה שעלול להתרחש לאחר דיסקציה כושל ועל קיבעון (שניהם מוכתמים נוגדן אנטי-GFP). איור. 5 מראה בכיתה אחת IV האקסון הסופית של מערכת העצבים המרכזית (אנטי GFP, ירוק); כל IV Termini בכיתה הם שיתוף מוכתם אנטי CD2 (מג'נטה).

איור 1 סקירת הפרוטוקול. א) איסוף ולאחר מכן חום עוברים זעזוע. ב) בחר הזחל עם GFP חיובי התובע נוירון לשבט, ואז התמונה GFP שכותרתו דנדריט סוכה הזחל לחיות. ג) מנתחים את הזחל, ולאחר מכן immunohistochemically הכתם פילה. ד) הר פילה מוכתם, ואז התמונה סוכת הדנדריטים ותחזיות axonal של נוירון התובע שיבוטים.

איור 2 הכנת צלחת אגר מיץ תפוחים להלם חום. קחו את הצלחת (חץ לבן, א.ב.), להוסיף המנה השנייה פטרי על גבי (אדום חץ ב) ו חותם מסביב עם Parafilm (חץ כחול, ב).

איור 3 בתמונה vivo של סוכת דנדריט של mCD8: GFP שכותרתו שיבוט MARCM (גנוטיפ כמו 2.1) המייצג הרביעי בכיתה (v'ada) הנוירון של הזחל instar 3 ^rd. סרגל קנה המידה 50μm.

d/3111/3111fig4.jpg "/>
איור 4 mCD8: GFP שכותרתו שיבוט MARCM של המעמד השלישי נוירון (ddaA) מוכתם נוגדן אנטי-GFP, מראה מורפולוגיה טוב לאחר דיסקציה קיבעון מוצלח (ירוק). מראה הבלעה השפלה דנדריט (חצים לבנים) המתרחשים לאחר דיסקציה קיבעון נכשל (מג'נטה). סרגל קנה המידה 25μm.

איור 5 3 ^rd instar הזחל VNC. שיבוט Flp, מתוך מסוף יחיד בכיתה ו האקסון (vdaB) (גנוטיפ כמו 2.2) הוא זוהה באמצעות נוגדן אנטי-GFP (ירוק). Anti-CD2 כל התוויות IV בכיתה טרמיני (מג'נטה). סרגל קנה המידה 25μm.

Discussion

הזחל תסיסנית מודל התובע נוירון מספקת מערכת אחת גנטי מעולה לחקור מנגנוני בקרה נוירון מורפולוגיה היווצרות מעגל. MARCM משמש בדרך כלל עבור תיוג ליצירת מוטציה התובע שיבוטים נוירון. עבור MARCM אנו משתמשים או מחבת-עצביים (למשל Gal4 ^c155) או התובע נוירון ספציפי הנ...

Materials

שם מגיב	חברה	מספר קטלוגי	הערות (אופציונלי)
SZX16 לנתיחה מיקרוסקופ פלואורסצנטי (עם GFPHQ לסנן)	אולימפוס	SZX16
חיים מלקחיים חרקים	FST	26030-10
26mm x 76mm דיכאון שקופיות זכוכית	Toshinriko ושות	T8-R004
Sylgard 184 (או Silpot 184)	Dow Corning	3097358-1004
פולי-L-ליזין	סיגמא	P-1524	מוצר זה הוכח כיעיל ביותר
DPX הרכבה בינונית	סיגמא	44581
הארנב נגד ה-GFP	Invitrogen	A-11122	דילול 1:500
עכברוש אנטי CD8	Caltag	5H10	דילול 1:200
עכבר אנטי CD2	AbD serotec	MCA443R	דילול 1:700
עכבר אנטי Fasciclin2	DSHB	1D4	דילול 1:10