Морфологический анализ Drosophila Личинок периферийных сенсорных дендритов нейронов и аксонов с использованием генетических Мозаики

Резюме

Дендритные разветвление сенсорных нейронах Drosophila Личиночной периферической нервной системы, полезных моделей, чтобы выяснить как общие, так и нейронных класса конкретные механизмы дифференциации нейронов. Мы представляем практическое руководство для получения и анализа дендритных разветвление нейрона генетической мозаики.

Аннотация

Нервная система развития требует правильной спецификации нейронов позиции и идентичность, а затем точным нейрона класса специфическое развитие дендритных и аксонального проводки. Недавно дендритных разветвление (DA) сенсорных нейронов дрозофилы личиночной периферической нервной системы (ПНС) стали мощным генетических моделей, в которых выяснить как общие, так и класс-специфические механизмы дифференциации нейронов. Существуют четыре основных Д. А. нейрона классов (I-IV) ^1. Они названы в порядке возрастания сложности дендритные беседка, и классовые различия в генетическом контроле их дифференциация ^2-10. Д. А. сенсорные системы практическую модель для исследования молекулярных механизмов контроля за морфологию дендритных ^11-13, потому что: 1) он может воспользоваться мощным генетических инструментов, доступных в плодовой мушки, 2) Д. А. нейрона дендритов беседка распространяется только в 2 размерах под оптически CLEар личиночной кутикулы что позволяет с легкостью визуализировать с высоким разрешением в естественных условиях, 3) класса видового разнообразия в дендритные морфологии облегчает сравнительный анализ, чтобы найти ключевые элементы управления образования простых по сравнению с сильно разветвленными дендритных деревьев, и 4) дендритных беседки стереотипных формы различных нейронов Д. облегчить морфометрических статистического анализа.

Д. А. нейронной активности изменяет вывод личиночной передвижения центральный генератор шаблона ^14-16. Различных DA нейронов классов имеют различные сенсорные модальности, и их активация вызывает различные поведенческие реакции ^14,16-20. Кроме различных классов отправить аксонального прогнозы стереотипно в дрозофилы личиночной центральной нервной системы в брюшной нервной цепочки (VNC) ^21. Эти прогнозы прекратить с топографической представления как DA нейронов сенсорной модальности и положение в теле стены дендритных поле ^7,22, 23. Следовательно, изучение Д. А. аксонального прогнозы могут быть использованы для выяснения механизмов, лежащих топографических карт ^7,22,23, а также подключение простую схему модуляции передвижения личиночной ^14-17.

Мы приведем здесь практическое руководство для получения и анализа генетической мозаики ²⁴ Маркировка DA нейронов через MARCM (Мозаика Анализ с репрессируемый Маркер Cell) ^1,10,25 и ^FLP-22,26,27 из методов (представлены на рис. 1).

протокол

1.Preparation реагентов

1. Подготовка Ca ^{+ +-бесплатный} HL3.1 солевой ^28.
   1. В мм: 70 NaCl, 5 KCl, 20 ₂ MgCl, 10 NaHCO _3, 5 HEPES, 115 сахарозы и 5 трегалозу; рН 7,2. Фильтры стерилизовать и хранить при температуре 4 ° C.
      Примечание: Ca ^{+ +-бесплатное} решение предотвращает сокращение мышц во время вскрытия.
2. Сделать поли-L-лизин (PLL) покровные.
   1. Растворите 100 мг PLL в 4.2ml воды и сделать 300 мкл аликвоты в пробирки Эппендорф и заморозить при температуре -20 ° C.
   2. Перед покрытием покровные, в первую оттепель аликвоту, довести его до 10 мл в DDH ₂ O и добавить 20 мкл Kodak Photo-Flo, окончательный PLL концентрация составляет 0,7 мг / мл.
   3. Погрузитесь покровные для 30 минут в PLL решение, удалять и сухой, затем смойте водой кратко и сухо. Повторите дважды. Обработанные покровные длится около одного месяца.

2. Генетические кресты

1. То генерировать MARCM клонов. Вот пример перекрестного использования пан-DA водитель ^11,27:
   FRT2A х hsFLP; Gal4 ^{109 (2) 80,} UAS-mCD8:: GFP, ванной-Gal80 FRT2A/SM5-TM6B
2. Для создания FLP-из клонов. Вот пример перекрестного использования класса IV-специальный драйвер ^8:
   ППК-Gal4 х уш, hsFLP; UAS-FRT-CD2, у ^{+-стоп-FRT-mCD8::} GFP

3. Коллекция эмбрионов

1. Держите дрозофилы крестов в коллекции бутылки при 25 ° С и собирать эмбрионы на агар яблочный сок пластины ²⁹ распространяются с тонким слоем дрожжевой пасты ^30,31.

4. Тепло шоковой терапии эмбрионов

1. Место пустую тарелку в оппозиции к агар яблочный сок пластины, на которых эмбрионы были заложены. Уплотнение вокруг этих двух пластин с парафильмом (рис. 2).
2. Во время теплового шока, погрузиться йэлектронной пластины в водяной бане и удерживайте ее использованием металла весом.
3. Для MARCM эмбрионов
   1. Сбор эмбрионов для 2h и инкубировать в чашке Петри 10 см окружении смоченной ткани при температуре 25 ° С в течение дополнительных 2 часа.
      Примечание: Настройка протокола теплового шока изменяет частоту, на которой клоны создаются.
   2. Для меньшего количества клонов, стремясь к одной изолированной нейронов, погрузить и теплового шока в водяной бане в течение 1 часа при 38 ° C.
   3. Для большего количества клонов, теплового шока на 45 минут при 38 ° С, восстановление при комнатной температуре 30 мин, затем теплового шока снова для дополнительных 30 минут.
4. Сбор FLP-из эмбрионов в течение 24 часов, а также теплового шока в течение 1 ч при 38 ° C.

5. Скрининг клонов

1. После теплового шока, снять крышку из водонепроницаемых расположение и место агар яблочный сок пластины в чашке Петри 10 см окружении смоченной ткани. Культура эмбриона и последующего личинки при 25 ° С до блуждатьING ^3-го возраста.
   Примечание: условия культивирования, особенно питание, как было показано, изменить морфологию дендритных Д. А. беседки ^32,33. Убедитесь в том, что рост личинки имеют доступ к дрожжевой пасты в любое время контролировать и пополнять дрожжевой пастой по мере необходимости.
2. С этого момента в протоколе года, манипулировать личинки насекомых мягко использованием щипцов.
3. Коротко и осторожно промыть личинки в водопроводной воде, а затем поместить на агар пластины.
   Примечание: Этот шаг сокращает фоновые авто-флуоресценции от пищи или грязь на личиночной поверхности.
4. Изучите личинки под мощным микроскопом флуоресценции рассекает. Определить личинок с GFP-положительных нейронов / клеток в стенке тела.

6. В естественных изображений дендритов

1. Место личинки во стекло депрессии с небольшую каплю 80% глицерина. Место покровное на слайде для иммобилизации личинки. Убедитесь, что воздух не остается между личинкой и coversliстр.
2. Аккуратно надавите на покровное свернуть личинку, чтобы визуализация нейрона интересов. Изображение mCD8:: GFP-меченых дендритных беседки с помощью конфокальной микроскопии.

7. Личинки вскрытия

Обратите внимание, перед началом: Д. А. нейрона дендритами быстро разлагаться после начала вскрытия. Рассеките каждой отдельной личинки менее чем за 5 мин для обеспечения хорошей морфологией дендритов.

1. Рассеките блуждающих ^3-го возраста личинки на тарелку Sylgard, как описано выше ³⁴ со следующими изменениями:
   1. Для визуализации Д. А. нейрона аксон концов, убедитесь, что ЦНС не поврежден и сегментарных нервов не нарушены. После открытия личинки, прежде всего, тщательно вырезать трахеи подключения к стенке тела, а затем аккуратно удалить весь кишечник.
   2. Если изображения дендритов один, удалить ЦНС, чтобы льстить монтажа.

8. Fixatионных и блокирование личинок филе

1. С личинки все еще прикреплены к пластине Sylgard, зафиксировать его в 4% PFA в ФБР за 20 минут при комнатной температуре на мягко вращающийся шейкере.
2. Удаление следов личиночных тканей (жир, трахеи и т.д.) после фиксации.
3. Стирать в PBST (PBS с 0,1% Тритон Х-100) 3x 10 минут на Sylgard пластины и шейкер. Если изучение аксон концов, держать филе на тарелку Sylgard. (Если окрашивание дендритов можно перевести личиночной филе с 0,5 мл трубки на этот шаг ³⁴⁾
4. Блок личинок на 20 минут при комнатной температуре в 5% нормальной сыворотки осла (NDS) в PBST на шейкере.

9. Окрашивание личинок филе

1. Удалите блокирующий раствор и инкубировать в первичных антител (в 5% НСР / PBST) в течение ночи при температуре 4 ° С в небольшой контейнер Tupperware окружении смоченной ткани.
2. Снимите трубки от 4 ° С и выдержать дополнительный час при комнатной температуре.
3. Вымойте 6x 10 минут в PBST. Добавить вторичных Антибоды (в 5% НСР / PBST), и крышка, чтобы предотвратить флуорофора фото-отбеливание ^34.
4. Инкубируйте либо при комнатной температуре в течение двух часов или на ночь при 4 ° C следует один час при комнатной температуре.
5. Вымойте личинки 6x 10 минут в PBST и приступить к установке.

10. Монтаж личиночной филе для исследования дендритных беседки

1. Горы каждой личиночной филе плоской, как можно с помощью ножниц или рассекает скальпелем, чтобы отрубить голову (в том числе рта крючки) и задний (в том числе дыхальца) ^34.
2. Место личиночной филе на слайде кутикулы стороной вниз, смонтировать в 80% глицерина, и печатью сторон покровным лаком для ногтей для 'быстрый' горе ^34.
3. Для постоянного монтажа и четкое изображение
   1. Место расчлененный личиночной филе мышц стороной вниз на каплю PBS на покровное PLL, он будет быстро присоединиться к покровным.
   2. Удалить столько жидкости, как можно раньше после монтажа, howeveт, не позволяют ему полностью высохнуть.
   3. Возьмите покровное (с прикрепленными личиночной филе) с помощью этанола серии: 35% этанола, а затем на 50%, 70%, 95%, и, наконец, 2x 100% этанола каждый в течение 10 минут (2-я 100% этанола решение следует часто менять ) и, наконец, мыть 2-3x 10 минут в ксилоле.
   4. Поместите каплю DPX mountant (Distyrene Пластификатор ксилола) на чистую слайдов и аккуратно лежали покровное филе стороны-вниз на вершине. Хранить в темноте, и подождать один день для DPX поставить перед изображениями.

11. Монтаж личиночной филе на экспертизу аксона концах

1. Держите сегментарные нервы работает между ПНС и ЦНС не повредить во время вскрытия, фиксации и окрашивания, чтобы отслеживание аксоны от периферических сенсорных теле клетки нейрона к VNC.
2. Горы каждой личиночной филе кутикулы стороной вниз в 80% глицерина в депрессию слайда. Трассировка аксонов от тела клетки к Д. А.VNC под конфокальной микроскопии. Примечание: ПНС нейронов в каждом сегменте проекта стенкой тела, чтобы родственные сегменте VNC.

12. Представитель Результаты:

Представитель Результаты приведены на рисунках 3-5. Рис. 3 показан весь вал класса IV-да-нейрона, захваченных в естественных условиях под конфокальной микроскопии. Рис. 4 показаны крупным планом часть дендритов беседке иммуногистохимическое помечены класса III нейрон, который был правильно закреплен сохранить морфологию. Связанные вставке деградации, которые могут возникнуть после неудачного вскрытия и фиксации (как окрашивали анти-GFP антител). Рис. 5 показан один класс IV аксон вокзал ЦНС (анти-GFP, зеленый), и все концы класса IV являются со-окрашенных анти-CD2 (пурпурный).

Рисунок 1 Протокол обзор. а) собирать и затем теплового шока эмбрионов. б) Выберите личинки с GFP-положительных Д. А. нейрона клон, а затем изображение GFP-меченых дендритов беседка в живых личинок. в) Рассеките личинки, а затем иммуногистохимическое пятно филе. г) Смонтировать окрашенных филе, а затем изображение дендритных беседки и аксонального проекции Д. А. нейрона клонов.

Рисунок 2 Подготовка агара яблочный сок пластина для теплового шока. Возьмите пластину (белая стрелка, аЬ), добавьте вторую чашку Петри на вершине (красная стрелка б) и уплотнения вокруг с парафильмом (синяя стрелка, б).

На рисунке 3 в естественных образ дендритов беседке mCD8:: GFP-меченых MARCM клон (генотип, как в 2.1), представляющий класс IV (v'ada) нейрон ^3-го возраста личинки. Шкала бар 50 мкм.

d/3111/3111fig4.jpg "/>
Рисунок 4 mCD8:: GFP-меченых MARCM клон класса III нейрона (ddaA) окрашивали анти-GFP антител, показывая хорошую морфологии после успешного вскрытия и фиксации (зеленый). Вставке показана дендритов деградации (белые стрелки), возникающие после неудачного вскрытия и фиксации (пурпурный). Шкала бар 25 мкм.

Рисунок 5 ^3-го возраста личиночной VNC. ФЛП-клон из одного класса VI (vdaB) Аксон вокзал (генотип, как в 2.2) определяется с помощью анти-антител GFP (зеленый). Анти-CD2 этикетки всех концах класса IV (пурпурный). Шкала бар 25 мкм.

Обсуждение

Дрозофилы личиночной Д. А. нейрона модель обеспечивает один прекрасный генетическая система для исследования механизмов, которые управляют морфологии нейронов и схемы формирования. MARCM обычно используется для маркировки и для создания мутанта Д. А. нейрона клонов. Для MARCM мы испол...

Материалы

Название реагента	Компания	Номер по каталогу	Комментарии (необязательно)
SZX16 флуоресцентного микроскопа вскрытия (с GFPHQ фильтр)	Олимп	SZX16
Живая насекомых Пинцет	FST	26030-10
26мм х 76мм стекло депрессии	Toshinriko Ко	Т8-R004
Sylgard 184 (или Silpot 184)	Dow Corning	3097358-1004
Poly-L-лизин	Сигма	P-1524	Данный продукт зарекомендовал наиболее эффективным
DPX монтажа среда	Сигма	44581
Кролик анти-GFP	Invitrogen	-11122	Разведение 1:500
Крыса анти-CD8	Caltag	5H10	Разведение 1:200
Мышь против CD2	AbD serotec	MCA443R	Разведение 1:700
Мышь против Fasciclin2	DSHB	1D4	Разведение 1:10