Análise morfológica de Drosophila Larval sensorial periférica Dendrites Neuron e axônios Usando Mosaicos Genéticos

Resumo

A arborização dendrítica de neurônios sensoriais da Drosophila Sistema periférico larval nervoso são modelos úteis para elucidar tanto gerais como neurônio específico de classe mecanismos de diferenciação de neurônios. Nós apresentamos um guia prático para gerar e analisar arborização dendrítica mosaicos neurônio genética.

Resumo

Desenvolvimento do sistema nervoso requer a especificação correta de neurônio posição e identidade, seguido por desenvolvimento precisa dendríticas do neurônio específico de classe e fiação axonal. Recentemente, a arborização dendrítica (DA) neurônios sensoriais da larval Drosophila sistema nervoso periférico (SNP) tornaram-se poderosos modelos genéticos em que para elucidar os mecanismos gerais e específicas de classe de diferenciação neuronal. Há quatro principais classes DA neurônio (I-IV) ^1. Eles são nomeados em ordem crescente de complexidade arbor dendrite, e têm diferenças de classe específica no controle genético da sua diferenciação ^2-10. O sistema DA sensorial é um modelo prático para investigar os mecanismos moleculares por trás do controle da morfologia dendrítica ^13/11 porque: 1) pode aproveitar as poderosas ferramentas genéticas disponíveis na mosca da fruta, 2) o neurônio DA dendrite arbor se espalha em apenas duas dimensões sob uma ótica clear cutícula larval tornando-o fácil de visualizar com alta resolução in vivo, 3) a diversidade de classe específico em morfologia dendrítica facilita uma análise comparativa para encontrar elementos-chave controlando a formação de simples contra altamente ramificados árvores dendríticas, e 4) arbor dendríticas estereotipada formas diferentes de neurônios DA facilitar morfométricas análises estatísticas.

DA atividade do neurônio modifica a saída de um gerador de padrão larval locomoção centrais ^14-16. As diferentes classes de DA neurônio têm distintas modalidades sensoriais, e sua ativação provoca diferentes respostas comportamentais ^14,16-20. Além disso diferentes classes de enviar projeções stereotypically axonal no sistema central de Drosophila larval nervoso no cordão nervoso ventral (VNC) ^21. Essas projeções terminar com representações topográficas dos dois modalidade neurônio sensorial e DA a posição na parede do corpo do campo dendríticas ^7,22De 23. Por isso o exame de projeções DA axonal pode ser usado para elucidar os mecanismos subjacentes mapeamento topográfico ^7,22,23, bem como a fiação de um circuito simples locomoção larval modulando ^14-17.

Nós apresentamos aqui um guia prático para gerar e analisar mosaicos genéticos ²⁴ neurônios marcação DA via MARCM (Análise Mosaic com um marcador de células repressor) ^1,10,25 e FLP-out ^22,26,27 técnicas (resumidos na Figura 1.).

Protocolo

1.Preparação de reagentes

1. Prepare Ca ^{+ +} livre HL3.1 salina ^28.
   1. Em mM: 70 NaCl, KCl 5, 20 MgCl _2, 10 NaHCO _3, 5 HEPES, 115 sacarose, trealose e 5; pH 7.2. Filtro de esterilizar e armazenar a 4 ° C.
      Nota: Ca ^{+ +} livre solução impede a contração muscular durante a dissecção.
2. Faça poli-L-lisina (PLL) lamínulas.
   1. Dissolver 100mg PLL em água 4.2ml e fazer alíquotas em tubos de Eppendorf 300 ul e congelar a -20 ° C.
   2. Antes de lamínulas de revestimento, primeiro degelo uma alíquota, trazê-lo até 10ml em DDH ₂ O e adicionar 20μl do Kodak Photo-Flo, a concentração final PLL é de 0,7 mg / ml.
   3. Lamínulas submergir por 30 minutos em solução PLL, remover e seca, em seguida, lavar rapidamente com água e seca. Repita duas vezes. Lamínulas tratados durar aproximadamente um mês.

2. Cruzamentos genéticos

1. To gerar clones MARCM. Aqui está um exemplo cruz usando um driver de pan-DA ^11,27:
   FRT2A x hsFLP; Gal4 ^{109 (2) 80,} UAS-mCD8:: GFP; banheira Gal80 FRT2A/SM5-TM6B
2. Para gerar FLP-out clones. Aqui está uma cruz exemplo usando uma classe de driver específico ^IV-8:
   ppk-Gal4 x yw, hsFLP; UAS-FRT-CD2, ⁺ y-stop-FRT-mCD8:: GFP

3. Colheita de embriões

1. Mantenha cruza Drosophila em um frasco coletor a 25 ° C e coletar embriões em um suco de maçã espalhar placa agar ²⁹ com uma fina camada de pasta de levedura ^30,31.

4. Tratamento de choque térmico de embriões

1. Coloque um prato vazio em oposição à placa de ágar suco de maçã sobre a qual os embriões tenham sido estabelecidas. Selo em torno destas duas placas com Parafilm (Fig. 2).
2. Durante o choque de calor ª submergir,placa e no banho de água e segure-o para baixo, usando um peso de metal.
3. Para embriões MARCM
   1. Coletar embriões para 2h e incubar em um prato de 10 centímetros de Petri rodeada por lenços umedecidos a 25 ° C para uma 2h adicionais.
      Nota: Ajuste o protocolo de choque térmico altera a freqüência em que clones são gerados.
   2. Para um número menor de clones, visando única neurônios isolados, submergir e choque térmico em banho-maria por 1h a 38 ° C.
   3. Para um maior número de clones, de choque térmico para 45mins a 38 ° C, recuperar a RT 30mins, depois de choque térmico novamente para um 30mins adicionais.
4. Coletar FLP-out embriões para 24h, e de choque térmico por 1h a 38 ° C.

5. Triagem de clones

1. Depois de choque térmico, retire a tampa do arranjo à prova d'água e coloque o suco de maçã placa de ágar numa placa de Petri 10 centímetros cercado por lenços umedecidos. Cultura dos embriões e larvas subseqüentes a 25 ° C até vagaring 3 ^º instar.
   Nota: condições de cultura, especialmente nutrição, têm sido mostrados para alterar a morfologia DA arbor dendríticas ^32,33. Certifique-se que as larvas crescem têm acesso à pasta de fermento em todos os momentos; monitorar e repor o fermento colar, conforme necessário.
2. Deste ponto em diante no protocolo, manipular larvas delicadamente usando uma pinça de insetos.
3. Brevemente e lave as larvas na água da torneira, em seguida, coloque em uma placa de ágar.
   Nota: Este passo reduz de fundo auto-fluorescência de comida ou sujeira na superfície da larva.
4. Examine as larvas sob um poderoso microscópio de fluorescência de dissecação. Identificar larvas com GFP-positivos neurônios / células da parede do corpo.

6. Imagem in vivo em de dendritos

1. Coloque a larva em um vidro corrediça depressão com uma pequena gota de glicerol 80%. Coloque uma lamela em slide para imobilizar a larva. Garantir que nenhum ar permanece entre a larva eo coverslip.
2. Empurre cuidadosamente a lamínula para rolar a larva para permitir a visualização do neurônio de interesse. A imagem da mCD8:: GFP-etiquetadas arbor dendríticas através de microscopia confocal.

7. Dissecação das larvas

Nota antes de começar: dendrites DA neurônio degradam rapidamente após o início da dissecção. Dissecar cada larva individuais em menos de 5min para garantir a morfologia dendrite bom.

1. Dissecar vagando ³ de larvas em uma placa Sylgard como descrito anteriormente ³⁴ com as seguintes modificações:
   1. Para a imagem do axônio do neurônio DA termini, certifique-se que o SNC está intacta e os nervos segmentares não são quebradas. Depois de abrir as larvas, primeiro corte cuidadosamente as conexões traqueal contra a parede do corpo e, em seguida, remova cuidadosamente a tripa inteira.
   2. Se os dendritos de imagem por si só, remova o CNS para permitir um alisador de montagem.

8. Fixation e bloqueio de filetes larval

1. Com a larva ainda preso à placa Sylgard, corrigi-lo em PFA 4% em PBS durante 20 minutos à temperatura ambiente em um agitador rotativo delicadamente.
2. Remoção de vestígios de tecidos larval (de gordura corporal, traquéia, etc) após a fixação.
3. Lavar em PBST (PBS com 0,1% Triton X-100) 10mins 3x na placa Sylgard e shaker. Se examinar termini axônio, manter o filé no prato Sylgard. (Se dendrites coloração é possível transferir os filetes larval a um tubo de 0,5 ml nesta etapa ³⁴⁾
4. Bloquear as larvas de 20mins a RT em 5% de soro normal de burro (NDS) em PBST em um shaker.

9. Coloração dos filetes larval

1. Remover a solução de bloqueio e incubar em anticorpo primário (em 5% NDS / PBST) overnight a 4 ° C em um recipiente Tupperware pequena, rodeada por lenços umedecidos.
2. Remover os tubos de 4 ° C e incubar uma hora adicional de RT.
3. Lavar 10mins 6x no PBST. Adicione o antib secundárioody (em 5% NDS / PBST), e tampa para evitar a foto-branqueamento fluoróforo ^34.
4. Incubar quer no RT por duas horas, ou durante a noite a 4 ° C seguido por uma hora em temperatura ambiente.
5. Lavar a 10mins larvas 6x no PBST e prossiga para a montagem.

10. Montagem de filetes de larvas para exame do arbor dendrite

1. Monte cada filé larval tão plana quanto possível, utilizando uma tesoura ou um bisturi de dissecação para cortar a cabeça (incluindo os ganchos na boca), ea posterior (incluindo o espiráculos) ^34.
2. Coloque o filé larval no slide cutícula voltada para baixo, montado em glicerol 80%, e selar os lados da lamela com unha polonês para um 'quick' mount ^34.
3. Para uma montagem permanente e uma imagem mais clara
   1. Coloque o filé dissecados larval músculo lateral-down em uma gota de PBS em uma lamela PLL, ele vai rapidamente aderir à lamínula.
   2. Remover o líquido que for possível após a montagem, however não permitir que ele para secar completamente.
   3. Pegue a lamela (com filé larval em anexo) através de uma série de etanol: o etanol 35%, seguido por 50%, 70%, 95% e, finalmente, 2x 100% de etanol para cada 10 minutos (o segundo 100% solução EtOH devem ser mudados frequentemente ) e, finalmente, lavar 2-3x 10 minutos em xileno.
   4. Coloque uma gota de montagem DPX (Distyrene Xileno plastificante) em uma lâmina limpa e cuidadosamente coloque o filé de lamela lado-down no topo. Manter no escuro, e esperar um dia para o DPX para definir antes de imagem.

11. Montagem de filetes de larvas para exame dos términos axônio

1. Manter os nervos segmentares correndo entre o PNS e do SNC intacto durante a fixação, a dissecção e coloração para permitir o rastreamento dos axônios das células sensoriais do corpo de neurônio periférico para o VNC.
2. Monte cada larval filé cutícula voltada para baixo em 80% de glicerol em um slide depression. Traçar os axônios do corpo celular para o DAVNC sob o microscópio confocal. Nota: PNS neurônios em cada segmento do corpo do projeto de parede para o segmento de cognato do VNC.

12. Resultados representativos:

Resultados representativos são mostrados nas figuras 3-5. Fig. 3 mostra a arbor inteiro de um neurônio da classe IV, capturado in vivo sob o microscópio confocal. Fig. 4 mostra um close-up de parte da arbor dendrite de um imunohistoquímica rotulados classe III neurônio que foi corretamente fixada para preservar a morfologia. A inserção associados mostra a degradação que pode ocorrer após uma dissecção sem sucesso e fixação (ambos corados com anti-GFP de anticorpos). Fig. 5 mostra uma única classe IV terminal axônio no SNC (anti-GFP, verde); todos os terminais de classe IV são co-corados com anti-CD2 (magenta).

Figura 1 Visão geral do protocolo. a) Coletar e, em seguida, de choque térmico-embriões. b) Selecione uma larva com GFP-positivos DA neurônio clone, e depois a imagem do GFP-etiquetadas dendrite arbor na larva viva. c) dissecam a larva, e depois imunohistoquímica manchar o filé. d) Monte o filé manchado, e depois a imagem da árvore dendrítica e projeções axonal do neurônio DA clones.

Figura 2 Preparação da placa de ágar suco de maçã para o choque térmico. Pegue a placa (seta branca, ab), adicionar uma segunda placa de petri em cima (seta vermelha b) e vedação ao redor com Parafilm (seta azul, b).

Figura 3 na imagem in vivo do arbor dendrite de um mCD8:: GFP-etiquetadas clone MARCM (genótipo como em 2.1), representando uma classe IV (v'ada) neurônio de uma larva instar 3 ^rd. Barra de escala é de 50 ìm.

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Figura 4 mCD8:: GFP-etiquetadas MARCM clone de um neurônio III classe (ddaA) corado com anticorpos anti-GFP, mostrando boa morfologia após a dissecção de sucesso e fixação (verde). A inserção mostra a degradação dendrite (setas brancas) que ocorram após dissecção sem sucesso e fixação (magenta). Barra de escala é 25μm.

Figura 5 O 3 ^º instar larval VNC. Um clone FLP-out de uma classe VI único terminal axônio (VDAB) (genótipo como em 2.2) é detectada através de anticorpos anti-GFP (verde). Anti-CD2 rótulos toda a classe IV termini (magenta). Barra de escala é 25μm.

Discussão

A Drosophila larval DA modelo de neurônio fornece um excelente sistema genético para investigar os mecanismos de controle que a morfologia dos neurônios ea formação do circuito. MARCM é geralmente utilizada para rotulagem e para a geração de clones mutantes DA neurônio. Para MARCM que usar uma pan-neural (por exemplo Gal4 ^C155) ou DA motorista neurônio-específica. Usando um driver de pan-neural é possível usar diretamente diversas unidades populacionais amplamente dispon...

Materiais

Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Comments (opcional)
SZX16 microscópio de dissecção de fluorescência (com GFPHQ filtro)	Olimpo	SZX16
Pinça viver Insect	FST	26030-10
26 milímetros x 76 milímetros de vidro corrediça depressão	Toshinriko Co.	T8-R004
Sylgard 184 (ou Silpot 184)	Dow Corning	3097358-1004
Poli-L-lisina	Sigma	P-1524	Este produto tem se mostrado mais eficaz
DPX meio de montagem	Sigma	44581
De coelho anti-GFP	Invitrogen	A-11122	Diluição 1:500
Rat anti-CD8	Caltag	5H10	Diluição 1:200
Rato anti-CD2	AbD serotec	MCA443R	Diluição 1:700
Rato anti-Fasciclin2	DSHB	1d4	Diluição de 1:10